基因工程方法生产乙肝疫苗
乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。[1] 我国乙肝感染率为60%，乙肝表面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。[2] 疫苗接种是预防乙肝的主要途径。国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。[3] 但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗。
[4]1982年, Valenzuela等人在国际上首次成功运用基因手段构建重组质粒，在酵母中表达出乙肝病毒表面抗原。[7] 1986年，美国批准了酵母来源基因工程方法生产的乙肝疫苗投放市场。[5] 本文主要内容是简要总结运用基因工程方法，以酵母为载体生产乙肝疫苗的流程。
乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白，主要包括：乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，前S1抗原和前S2抗原。乙肝病毒包膜相关蛋白的编码基因位于HBV基因组的S区。S区基因有三个起始密码子和同一个终止子，从不同的起始密码子开始转录，可得到三种不同的包膜蛋白。小蛋白（SHB,即主表面蛋白,S蛋白）包括表面抗原HBsAg（p24为非糖基化形式，gp27为糖基化形式），由226个氨基酸组成；中蛋白（MHB）除了具有S蛋白的226个氨基酸，N端多出55个氨基酸残基（前S2蛋白）；大蛋白（LHB）除了具有S蛋白和前S2蛋白还具有前S1蛋白。在完整的乙肝病毒Dane毒粒中，小蛋白、中蛋白与大蛋白通过各自S蛋白之间的二硫键共价连接，外包脂膜形成完整颗粒。由于三种蛋白中均包括S蛋白区域，故含有HBsAg的疫苗可以在机体中引发针对乙肝病毒的免疫反应。[2]
基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。在之前的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得到大量具有免疫原性的基因表达产物。[6]这可能是由于原核表达系统中不能进行糖基化修饰，或者原核细胞环境不适合专性寄生于真核生物的乙肝病毒包膜蛋白表达，故应选用真核表达系统。选用酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主系统，因其具有丰富的膜结构和细胞器的特点，既可使蛋白以分泌形式表达，又可以使蛋白糖基化变为活性形式。克隆载体构建时，将编码HBsAg的基因（野生型adw）添加到酵母酒精脱氢酶Ⅰ（ADHⅠ）的启动子之后。如图1所示构建载体。[6]将质粒转化至酵母菌中，通过HBsAg抗体与酵母菌积累产物HBsAg之间的特异性反应筛选出成功转化的菌体。对筛选出的菌体进一步发酵培养，摸索合适的基因工程菌培养条件，使产物尽量高效积累。
基因工程法表达的乙肝病毒表面抗原以22nm的蛋白颗粒形式存在，分离纯化时可采用分离纯化蛋白质的方法，先浓缩，再精制纯化。具体方法如下：第一步浓缩时，先将发酵液离心，将酵母细胞置于高压均质机内进行破碎均一化处理，加入蛋白酶抑制剂后立即冷却，防止目的蛋白降解。再经过微滤和超滤系统处理去除细胞碎片进行第二步浓缩。第三步浓缩方法是硅胶吸附和硼酸洗脱。硅烷醇基表面的氢键可与乙肝病毒表面抗原蛋白结合，硼酸离洗后可得到HBsAg蛋白粗制品。精制纯化第一步采用丁基琼脂糖疏水层析，通过洗涤和收集得到高纯度表面抗原蛋白。第二步精制纯化采用亲和色谱法（原理是HBsAg抗原与其特异性抗体的结合）。[2]精制纯化后还要进行除菌过滤。纯化出的抗原要进行下列多个标准的检验，合格后才可继续进行后续步骤。[7]（1）总蛋白量测定（2）抗原含量测定：通过SDS-PAGE检测产物是否是大小正确的HBsAg。再通过放射免
疫实验（RIA），酶联免疫吸附实验（ELISA），或免疫印迹实验检测HBsAg含量。（3）抗原纯度测定：通过液相色谱或酸性蓝/银染SDS-PAGE检测总蛋白中HBsAg含量。（4）检测蛋白质、脂类、核酸、糖的种类和含量（要低于一定标准）。（5）检测载体DNA的残留量（要低于一定标准）。（6）检验是否无菌。
上述检验合格后进一步进行成品化处理。添加佐剂氢氧化铝（作用是增加抗原表面面积，延长抗原在体内保留时间，使抗原与淋巴细胞充分接触，使疫苗更容易诱发机体的免疫应答）和添加抗生素处理（避免细菌污染，破坏疫苗效果和安全性）。处理后要检测佐剂含量、抗生素含量和无菌性。此外，疫苗还要进行效价测定、热源检测。[7] 当以上检测全部合格后，疫苗才可以进行包装和贴标签处理。
综上所述，用基因工程法纺生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、乙肝病毒表面抗原的分离纯化、产品多项性质的初步检测、成品化处理（如添加佐剂、抗生素、除菌）、成品检测鉴定、包装几个步骤。对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安全性尤其重要。
目前对基因工程法生产乙肝疫苗方法的优化方向主要如下。第一，目的基因除了HBsAg外还可添加前S1蛋白和前S2蛋白。前S蛋白在病毒感染、装配、复制和刺激机体产生免疫反应中有十分重要的作用。[8]若在疫苗中加入前S蛋白可增加疫苗的免疫原性，起更好的预防作用。第二，改变基因表达载体系统。若选用中国仓鼠细胞（CHO）作为基因表达系统，得到的蛋白折叠和糖基化形式更类似于天然乙肝病毒表面抗原。但是这种方法的主要问题是后续纯化处理后仍存在极少量外源DNA残留，有潜在致癌风险。第三，对分离纯化的工艺进行优化，提高产量，提高目的蛋白的最终纯度。这就需要综合利用多种浓缩和精制
第3节基因工程的应用 【本节重难点】 重点：1.基因工程在农业和医疗等方面的应用 难点：1.基因治疗 【知识精讲】 教材梳理 知识点一植物基因工程的应用 植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等）以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。 1.提高抗逆性 （1）常用抗虫基因：用于抗虫（杀虫）的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。 （2）常用抗病基因：a.抗病毒基因有：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因；b.抗真菌基因有：几丁质酶基因和抗毒素合成基因 （3）其他抗逆基因：环境条件对农作物的生产会造成很大影响，并且这些影响是多方面的，因此，抗逆性基因也有多种多样，如：抗盐碱和干旱的调节细胞渗透压基因、抗冻基因、抗除草剂基因等等。 2.改良植物品质 由于人们的食品含有的营养不平衡，不能满足人们对食品的要求，这样，可以通过转基因技术，使植物能够合成某些本来不能合成的物质。如科学家将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。 3.生产药物 基因工程不但促进了传统技术的变革，也为人类提供了传统产业难以得到的许多昂贵药品，并已形成基因工程制药业的雏形。目前诸如人胰岛素、人生长激素、人脑激素、 α－干扰素、乙肝疫苗、蛋白C、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂等数十种基因工程药物已实现商品化。此外，还有促红细胞生成素、白细胞介素－2、肾素、心钠素等一大批珍贵药品正处于试用或临床试验阶段。 知识点二动物基因工程的应用 1.用于提高动物生长速度：由于外援生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。如：转基因绵羊和转基因鲤鱼。 2.用于改善畜产品的品质：基因工程可用于改善畜产品的品质。如：有些人对牛奶中的乳糖不能完全消化或食用后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，这样所获得的牛奶其成分不受影响，但乳糖的含量大大减低。 3.用转基因动物做器官移植的供体：目前，人体移植器官短缺是一个世界性的难题，用其它动物的器官替代，又会出现免疫排斥现象，现在，科学家正试图利用基因工程方法对一些动物的器官进行改造，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆器官。 知识点三基因治疗 1.概念：基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。 2.方法：体外基因治疗和体内基因治疗 体外基因治疗：先从病人体内获得某种相关细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再
第十四章基因重组与基因工程 一、选择题 1.细菌的F因子是通过哪种方式进行基因转移的 A.接合作用 B.转化 C.转导 D.转染 E.转座 2. 下列关于限制性内切核酸酶作用特性正确的是 A.在对称序列处切开单链DNA B.DNA两链的切点一定不在同一位点 C.酶切部位一定位于识别序列处 D.酶辨认的碱基一般为8～12个 E.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性互补末端 3. 限制性核酸内切酶识别的顺序通常是 A.基因的操纵序列 B.启动子序列 C.S-D序列 D.回文结构 E.长末端重复序列 4. 可识别并切割特异DNA序列的酶称为 A.限制性核酸外切酶 B.限制性核酸内切酶 C.核酶 D.核酸酶 E.反转录酶 5. 下列DNA序列属于回文结构的是 A.ATGCCG B.GGCCGG C.CTAGGG D.GAATTC E.TCTGAC TACGGC CCGGCC GATCCC CTTAAG AGACTG 6. cDNA文库包括该种生物 A.某些蛋白质的结构基因 B.所有蛋白质的结构基因 C.所有结构基因 D.结构基因与不表达的调控区 E.内含子和调控区 7. 下列哪种工具酶的出现在基因工程中具有最重要的意义： A.逆转录酶 B.限制性核酸内切酶 C.末端转移酶 D.DNA聚合酶 E.DNA连接酶 8. 常用质粒载体的特点是 A.为线性双链DNA分子 B.为环形单链DNA分子 C.具有自我复制能力 D.含有同一限制性内切酶的多个切点 E.缺乏表达外源基因的能力 9. 基因工程的操作程序可简单地概括为 A.载体和目的基因的分离 B.分、切、接、转、筛、表达 C.将重组体导入宿主细胞，筛出阳性细胞株 D.将载体和目的基因连接成重组体 E.限制性内切酶的应用
When the lives of employees or national property are endangered, production activities are stopped to rectify and eliminate dangerous factors. （安全管理） 单位：___________________ 姓名：___________________ 日期：___________________ 基因工程安全管理办法(通用版)
基因工程安全管理办法(通用版)导语：生产有了安全保障，才能持续、稳定发展。生产活动中事故层出不穷，生产势必陷于混乱、甚至瘫痪状态。当生产与安全发生矛盾、危及职工生命或国家财产时，生产活动停下来整治、消除危险因素以后，生产形势会变得更好。"安全第一" 的提法，决非把安全摆到生产之上;忽视安全自然是一种错误。 第一章总则 第一条为了促进我国生物技术的研究与开发，加强基因工程工作的安全管理，保障公众和基因工程工作人员的健康，防止环境污染，维护生态平衡，制定本办法。 第二条本办法所称基因工程，包括利用载体系统的重组体ＤＮＡ技术，以及利用物理或者化学方法把异源ＤＮＡ直接导入有机体的技术。但不包括下列遗传操作： （一）细胞融合技术，原生质体融合技术； （二）传统杂交繁殖技术； （三）诱变技术，体外受精技术，细胞培养或者胚胎培养技术。 第三条本办法适用于在中华人民共和国境内进行的一切基因工程工作，包括实验研究、中间试验、工业化生产以及遗传工程体释放和遗传工程产品使用等。 从国外进口遗传工程体，在中国境内进行基因工程工作的，应当
基因重组与基因工程 一、选择题 1．F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 2．通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 3．溶原菌是指： A．整合了噬菌体基因组的细菌 B．整合了质粒基因组的细菌 C．含有独立噬菌体基因组的细菌 D．含有独立质粒基因组的细菌 E．含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌 4．由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为： A．转化 B．转导
C．转染 D．转座 E．接合 5．由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为：A．位点特异的重组 B．同源重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 6．发生在同源序列间的重组称为： A．位点特异的重组 B．非位点特异的重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 7．限制性核酸内切酶切割DNA后产生： A．5'磷酸基和3'羟基基团的末端 B．3'磷酸基和5'羟基基团的末端 C．5'磷酸基和3'磷酸基团韵末端 D．5'羟基和3'羟基基团的末端 E．以上都不是 8．可识别并切割特异DNA序列的称： A．限制性核酸外切酶 B．限制性核酸内切酶
C．非限制性核酸外切酶 D．非限制性核酸内切酶 E．DNA酶 9．限制酶的识别顺序通常是： A．聚腺苷酸 B．聚胞苷酸 C．RNA聚合酶附着点 D．回文对称序列 E．甲基化“帽”结构 10．限制酶： A．从噬菌体中提取而得 B．可将单链DNA任意切开 C．可将双链DNA任意切开 D．可将双链DNA特异切开 E．不受DNA甲基化影响． 11．限制酶的作用特性不包括： A．在对称序列处切开DNA B．同时切开双链DNA C．DNA两链的切点常在同一位点 D．酶切后的DNA片段多具有粘性互补末端 E．酶辨认的碱基一般为4—6个 12．限制酶的特点不包括： A．只识别一种核苷酸序列 B．其识别不受DNA来源的限制
基因重组与基因工程
基因重组与基因工程 一、选择题 1．F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为： A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 2．通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 3．溶原菌是指：
A．整合了噬菌体基因组的细菌 B．整合了质粒基因组的细菌 C．含有独立噬菌体基因组的细菌 D．含有独立质粒基因组的细菌 E．含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌 4．由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为： A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 5．由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为：A．位点特异的重组 B．同源重组 C．基本重组 D．随机重组
E．人工重组 6．发生在同源序列间的重组称为：A．位点特异的重组 B．非位点特异的重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 7．限制性核酸内切酶切割DNA后产生： A．5'磷酸基和3'羟基基团的末端 B．3'磷酸基和5'羟基基团的末端 C．5'磷酸基和3'磷酸基团韵末端 D．5'羟基和3'羟基基团的末端 E．以上都不是 8．可识别并切割特异DNA序列的称： A．限制性核酸外切酶 B．限制性核酸内切酶
C．非限制性核酸外切酶 D．非限制性核酸内切酶 E．DNA酶 9．限制酶的识别顺序通常是：A．聚腺苷酸 B．聚胞苷酸 C．RNA聚合酶附着点 D．回文对称序列 E．甲基化“帽”结构 10．限制酶： A．从噬菌体中提取而得B．可将单链DNA任意切开 C．可将双链DNA任意切开 D．可将双链DNA特异切开 E．不受DNA甲基化影响．11．限制酶的作用特性不包括：
轧钢生产工艺流程介绍 1、棒材生产线工艺流程 钢坯验收f加热f轧制f倍尺剪切f冷却f剪切f检验f包装f计量f入库 (1)钢坯验收=钢坯质量是关系到成品质量的关键，必须经过检查验收。 ①、钢坯验收程序包括：物卡核对、外形尺寸测量、表而质量检查、记录等。 ②、钢坯验收依据钢坯技术标准和内控技术条件进行，不合格钢坯不得入炉。 (2)、钢坯加热 钢坯加热是热轧生产工艺过程中的重要工序。 ①、钢坯加热的目的 钢坯加热的目的是提高钢的塑性，降低变形抗力，以便于轧制；正确的加热工艺，还可以消除或减轻钢坯内部组织缺陷。钢的加热工艺与钢材质量、轧机产量、能量消耗、轧机寿命等各项技术经济指标有直接关系。 ②、三段连续式加热炉 所谓的三段即：预热段、加热段和均热段。 预热段的作用：利用加热烟气余热对钢坯进行预加热，以节约燃料。(一般预加热 到 300?450°C) 加热段的作用：对预加热钢坯再加温至1150?1250°C,它是加热炉的主要供热段，决定炉子的加热生产能力。 均热段的作用：减少钢坯内外温差及消除水冷滑道黑印，稳定均匀加热质量。 ③、钢坯加热常见的几种缺陷 a、过热钢坯在高温长时间加热时，极易产生过热现象。钢坯产生过热现象主要表现在钢的组织晶粒过分长大变为粗晶组织，从而降低晶粒间的结合力，降低钢的可塑
性。过热钢在轧制时易产生拉裂，尤其边角部位。轻微过热时钢材表面产生裂纹， 影响钢材表而质M和力学性能。 为了避免产生过热缺陷，必须对加热温度和加热时间进行严格控制。 b、过烧 钢坯在高温长时间加热会变成粗大的结晶组织，同时晶粒边界上的低熔点非金属化 合物氧化而使结晶组织遭到破坏，使钢失去应有的强度和塑性，这种现象称为过 烧。 过烧钢在轧制时会产生严重的破裂。因此过烧是比过热更为严重的一种加热缺陷。 过烧钢除重新冶炼外无法挽救。 避免过烧的办法：合理控制加热温度和炉内氧化气氛，严格执行正确的加热制度和 待轧制度，避免温度过高。 ( C、温度不均 钢坯加热速度过快或轧制机时产量大于加热能力时易产生这种现象。温度不均的钢坯，轧制时轧件尺寸精度难以稳定控制，且易造成轧制事故或设备事故。 避免方法：合理控制炉温和加热速度；做好轧制与加热的联系衔接。 d、氧化烧损 钢坯在室温状态就产生氧化，只是氧化速度较慢而己，随着加热温度的升高氧化速度加快，当钢坯加热到1100-1200°C时，在炉气的作用下进行强烈的氧化而生成氧化铁皮。氧化铁皮的产生，增加了加热烧损，造成成材率指标下降。 减少氧化烧损的措施：合理加热制度并正确操作，控制好炉内气氛。 e、脱碳 钢坯在加热时，表面含碳量减少的现象称脱碳，易脱碳的钢一般是含碳量较高的优
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
第十七章基因重组和基因工程 一、单项选择题 1.限制性核酸内切酶切割DNA后产生 A. 5′磷酸基和3′羟基基团的末端 B. 5′磷酸基和3′磷酸基团的末端 C. 5′羟基和3′羟基基团的末端 D. 3′磷酸基和5′羟基基团的末端 E. 以上都不是 2. 可识别并切割特异DNA序列的酶是 A. 非限制性核酸外切酶 B. 限制性核酸内切酶 C. 限制性核酸外切酶 D. 非限制性核酸内切酶 E. DNA酶 3. 有关限制性核酸内切酶，以下哪个描述是错误的？ A. 识别和切割位点通常是4～8个bp长度 B. 大多数酶的识别序列具有回文结构 C. 在识别位点切割磷酸二酯键 D. 只能识别和切割原核生物DNA分子 E. 只能切割含识别序列的双链DNA分子 4. 在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的酶是 A. 解链酶 B. DNA聚合酶 C. DNA连接酶 D. 内切酶 E. 拓扑酶 5. 对基因工程载体的描述，下列哪个不正确？ A. 可以转入宿主细胞 B. 有限制酶的识别位点 C. 可与目的基因相连 D. 是环状DNA分子 E. 有筛选标志 6. 克隆所依赖的DNA载体的最基本性质是 A. 卡那霉素抗性 B. 青霉素抗性 C. 自我复制能力 D. 自我表达能力 E. 自我转录能力 7. 重组DNA技术中常用的质粒DNA是 A. 病毒基因组DNA的一部分 B. 细菌染色体外的独立遗传单位 C. 细菌染色体DNA的一部分 D. 真核细胞染色体外的独立遗传单位 E. 真核细胞染色体DNA的一部分 8. 下列哪种物质一般不用作基因工程的载体？ A. 质粒 B. 噬菌体
C. 哺乳动物的病毒 D. 逆转录病毒ＤＮＡ E. 大肠杆菌基因组 9. 关于pBR322质粒描述错误的是 Ａ．有一些限制酶的酶切位点Ｂ．含有1个ori. Ｃ．含有来自大肠杆菌的lacZ基因片段Ｄ．含个氨卞青霉素抗性基因Ｅ．含四环素抗性基因。 10. 以ｍＲＮＡ为模板催化ｃＤＮＡ合成需要下列酶 A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. Klenow片段 D. 逆转录酶 E. ＤＮＡ酶 11. 催化聚合酶链反应需要下列酶 A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. Taq DNA聚合酶 D. 逆转录酶 E.限制性核酸内切酶 12. 关于ＰＣＲ的描述下列哪项不正确？ A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性 C. 扩增产物量大 D.扩增的对象是ＤＮＡ序列 E.扩增的对象是RNA序列 13. 在基因工程中，DNA重组体是指 A. 不同来源的两段DNA单链的复性 B. 目的基因与载体的连接物 C. 不同来源的DNA分子的连接物 D. 原核DNA与真核DNA的连接物 E. 两个不同的结构基因形成的连接物 14. 基因工程操作中转导是指 A. 把重组质粒导入宿主细胞 B. 把DNA重组体导入真核细胞 C. 把DNA重组体导入原核细胞 D. 把外源DNA导入宿主细胞 E. 以噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA导入宿主细胞 15. 重组DNA的筛选与鉴定不包括哪一方法 A. 限制酶酶切图谱鉴定 B. PCR扩增鉴定 C. 显微注射 D. 蓝白筛选 E.抗药筛选
第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程： 第一步：加热至90～95℃DNA解链； 第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链； 第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1. 转化的概念： 是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA
重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用 国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。 第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。 第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。 第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。 第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA 及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。 对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。 第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。
第十四章基因重组与基因工程 内容提要： 细菌的基因转移包括接合作用、转化作用、转导作用等。当细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞转移至另一个细胞，这种类型的DNA转移称为接合作用。通过自动获取或人为的供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是转化作用。由病毒携带将宿主DNA片段从一个细胞转移至另一细胞的现象或机制，称为转导作用。在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。 重组DNA技术是在人们对自然界基因转移和重组的认识基础上创立的新技术。为研究基因的结构与功能，从构建的基因组DNA文库或cDNA文库分离、扩增某一感兴趣的基因就是基因克隆或分子克隆，又称重组DNA技术。一个完整的基因克隆过程应包括：1．分，即目的基因的获取及基因载体的选择。目的基因指科学家感兴趣的外源基因，其来源有几种途径：化学合成、PCR技术、基因组文库或cDNA文库中获得。载体是目的基因的携带者，常用的载体有质粒、噬菌体等。2．切，即限制性核酸内切酶的应用。限制性内切酶是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，是实现重组DNA技术的重要的工具酶。3．接，即将目的基因与载体连接形成重组体（或重组DNA）。4．转，即将重组体导入宿主菌（或细胞），根据采用的载体性质不同，将重组体导入宿主菌的方法有转化、转染及感染。5．筛，即重组体的筛选与鉴定，将重组体导入宿主菌后，通过适当形式的培养板生长即可获得一定的抗药菌落。利用原位杂交，和Southern印迹或免疫学方法对抗药菌落进行筛选，获得含目的基因的转化子菌落，再经扩增、分离重组DNA获得基因克隆。重组DNA 技术在疾病基因的发现，表达有药用价值的蛋白质，DNA诊断及疾病的预防等方面具有广泛应用价值，并促进了当代分子医学的诞生和发展。 一、选择题 【A型题】 1．下列DNA序列属于回文结构的是（） A．ATGCCG TACGGC B．GAA TTC CTTAAG C．GGCCGG CCGGCC D．TCTGAC AGACTG E．CTAGGG GA TCCC 2．DNA经限制性内切核酸酶切割后，断端易于首尾相接，自行成环。这是因为存在着（） A．钝性末端B．平端C．粘性末端D．5’端E．3’端 3．限制性内切核酸酶的通常识别序列是（） A．粘性末端B．聚腺苷酸 C．回文对称序列D．RNA聚合酶附着点E．甲基化“帽”结构 4．pBR322是（）
服装生产制作工艺流程介绍 （一）生产准备 面辅料进厂检验→技术准备→打版→试板样→封样→制定做工艺文件→裁剪→缝制→确认首件（水洗首缸）→锁眼钉扣→整烫→成衣检验→包装→入库出运。 （二）面料、辅料检验的目的和要求 根据发货单详细出现短码/少现象要亲自参与清点并确认大货跟单负责大货的交货日期确定及面料进厂后要进行数量清点以及外观和内在质量的检验，及确认符合生产要求的才能投产使用。在批量生产前首先要进行技术准备，包括工艺单、样板的制定和样衣制作，样衣经客户确认后方能进入下一道生产流程。面料经过裁剪、缝制制成半成品，有些梭织物制成半成品后，根据特殊工艺要求，须进行后整理加工，例如成衣水洗、成衣砂洗、扭皱效果加工等等，最后通过锁眼钉扣辅助工序以及整烫工序，再经检验合格后包装入库。 根据客户确认后的单耗对面/辅料的进行核对，并将具体数据以书面形式报告公司。如有欠料，要及时落实补料事宜并告知客户。如有溢余则要报告客户大货结束后退还仓库保存，要节约使用，杜绝浪费现象。 由于坯布的质量直接关系到成品的质量和产量，因此裁剪前，必须根据裁剪用布配料单，核对匹数、尺寸、密度、批号、线密度是否符合要求，在验布时对坯布按标准逐一进行检验，对影响成品质量的
各类疵点，例如色花、漏针、破洞、油污等须做好标记及质量记录把好面料质量关是控制成品质量重要的一环。通过对进厂面料的检验和测定可有效地提高服装的正品率。 面料检验包括外观质量和内在质量两大方面。外观上主要检验面料是否存在破损、污迹、织造疵点、色差等等问题。经砂洗的面料还应注意是否存在砂道、死褶印、披裂等砂洗疵点。影响外观的疵点在检验中均需用标记注出，在剪裁时避开使用。 面料的内在质量主要包括缩水率、色牢度和克重（姆米、盎司）三项内容。在进行检验取样时，应剪取不同生产厂家生产的、不同品种、不同颜色具有代表性的样品进行测试，以确保数据的准确度。同时对进厂的辅料也要进行检验，例如松紧带缩水率，粘合衬粘合牢度，拉链顺滑程度等等，对不能符合要求的辅料不予投产使用。 （三）技术准备的主要内容 收到样品、原始资料，按工艺要求（参考客人的原样），制作合理的纸板，并做好各种技术工艺的记录，对生产过程中遇到的技术问题负责。 按照客户和厂部的规定的样品时间，安排好样衣的生产，并做好几率，遇到做样衣时，工艺单不清楚的地方，要主动向跟单提出或向厂长提出，让他们去同客户商讨，不能自作主张。 认真审核客供工艺单的资料，原样衣，明确了解客户的要求，尺寸，原辅料和配料等，在做给客人的批核样衣时，以便于车间的生产为原则，提示可以简化的车缝的工序。样衣完成后，对比原样品和工
基因工程乙肝疫苗的制备 【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。 【关键词】乙肝疫苗重组质粒工艺流程 1.基因工程乙肝疫苗产生背景 疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······” 世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。 我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB）计划免疫。92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。为了实现HB计划目标，进一步为控制全球HB做出贡献，我们必须大规模提高HB 疫苗的产量和进一步提高质量。 血源HB疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg阳性血浆。血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg生产HB疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。 2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建 2.1使用重组酵母的原因 使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因： （1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。 （2）.酵母细胞生长快，故生产率高。 （3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。 （4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。 2.2重组酵母构建 HBV只有3200bp，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。其基因组共有四个ORF，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重组酵母可用以下方法： （1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质
时间： 地点： 主讲：胡永珍 参加人员： 内容：重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用 国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。 对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。最后，利用发酵工程培养重组与乙肝疫苗的工程菌理化性质从热稳定性方面说酵母源乙型肝炎疫苗37℃保存1周不改变其免疫原性乙肝疫苗，主要成分是45个氨基酸的多肽，通过化学合成的方式制备，使用直接注射的方法打入静脉。这45个氨基酸分别编码了三个抗原表位（所谓表位，是一串大于9个氨基酸的多肽，是能够刺激免疫系统发生反应的最小多肽片段）：,HBscFv等电点理论值为8.5 1,实验值为7.3～8.1（就是抗体）综上所述，用基因工程法生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工
生产工艺流程图及工艺说明 （一）、原料的接收 1 、散装原料的接收以散装汽车、火车运输的，用自卸汽车经地磅称量后将原料卸到卸料坑。2 、包装原料的接收：分为人工搬运和机械接收两种。3 、液体原料的接收：瓶装、捅装可直接由人工搬运入库。 （二）、原料的贮存饲料中原料和物料的状态较多，必须使用各种形式的料仓，饲料厂的料仓有筒仓和房式仓两种。主原料如玉米、高粮等谷物类原料，流动性好，不易结块，多采用筒仓贮存，而副料如麸皮、豆粕等粉状原料，散落性差，存放一段时间后易结块不易出料，采用房式仓贮存。 （三）、原料的清理饲料原料中的杂质，不仅影响到饲料产品质量而且直接关系到饲料加工设备及人身安全，严重时可致整台设备遭到破坏，影响饲料生产的顺利进行，故应及时清除。饲料厂的清理设备以筛选和磁选设备为主，筛选设备除去原料中的石块、泥块、麻袋片等大而长的杂物，磁选设备主要去除铁质杂质。 （四）、原料的粉碎饲料粉碎的工艺流程是根据要求的粒度，饲料的品种等条件而定。按原料粉碎次数，可分为一次粉碎工艺和循环粉碎工艺或二次粉碎工艺。按与配料工序的组合形式可分为先配料后粉碎工艺与先粉碎后配料工艺。 1 、一次粉碎工艺：是最简单、最常用、最原始的一种粉碎工艺，无论是单一原料、混合原料，均经一次粉碎后即可，按使用粉碎机的台数可分为单机粉碎和并列粉碎，小型饲料加工厂大多采用单机粉碎，中型饲料加工厂有用两台或两台以上粉碎机并列使用，缺点是粒度不均匀，电耗较高。 2 、二次粉碎工艺有三种工艺形式，即单一循环粉碎工艺、阶段粉碎工艺和组织粉碎工艺。（ 1 ）单一循环二次粉碎工艺用一台粉碎机将物料粉碎后进行筛分，筛上物再回流到原来的粉碎机再次进行粉碎。（ 2 ）阶段二次粉碎工艺该工艺的基本设置是采用两台筛片不同的粉碎机，两粉碎机上各设一道分级筛，将物料先经第一道筛筛理，符合粒度要求的筛
基因工程方法生产乙肝疫苗 乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。[1] 我国乙肝感染率为60%，乙肝表面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。[2] 疫苗接种是预防乙肝的主要途径。国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。[3] 但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗。 [4]1982年, Valenzuela等人在国际上首次成功运用基因手段构建重组质粒，在酵母中表达出乙肝病毒表面抗原。[7] 1986年，美国批准了酵母来源基因工程方法生产的乙肝疫苗投放市场。[5] 本文主要内容是简要总结运用基因工程方法，以酵母为载体生产乙肝疫苗的流程。 乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白，主要包括：乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，前S1抗原和前S2抗原。乙肝病毒包膜相关蛋白的编码基因位于HBV基因组的S区。S区基因有三个起始密码子和同一个终止子，从不同的起始密码子开始转录，可得到三种不同的包膜蛋白。小蛋白（SHB,即主表面蛋白,S蛋白）包括表面抗原HBsAg（p24为非糖基化形式，gp27为糖基化形式），由226个氨基酸组成；中蛋白（MHB）除了具有S蛋白的226个氨基酸，N端多出55个氨基酸残基（前S2蛋白）；大蛋白（LHB）除了具有S蛋白和前S2蛋白还具有前S1蛋白。在完整的乙肝病毒Dane毒粒中，小蛋白、中蛋白与大蛋白通过各自S蛋白之间的二硫键共价连接，外包脂膜形成完整颗粒。由于三种蛋白中均包括S蛋白区域，故含有HBsAg的疫苗可以在机体中引发针对乙肝病毒的免疫反应。[2]
水寨中学生物自主探究学案 内容：基因工程的基本操作程序课时：2课时年级：高二编号64 一、教学目标 1．知识目标： 了解基因工程原理及基本操作程序。 2．能力目标： 尝试设计某一转基因生物的研制过程。 3．情感、态度和价值观目标： （1）了解基因工程的发展。 （2）认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 二、教学重点和难点 1、教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤。 2、教学难点 （1）从基因文库中获取目的基因 （2）利用PCR技术扩增目的基因 第一课时 三、教学过程 （一）复习上节内容 1、什么是基因工程？DNA重组技术的基本工具有哪些？运载体需要具备哪些条件？ 以上问题可以不展示 （二）讲授新课 1、基因工程的基本步骤包括那四步？ 2、第一步：目的基因的获取 （１）为什么要有目的基因的获取这一步骤？ （２）目的基因的获取方法有哪些？ （3）为什么要建立基因文库？怎么建立的？
（4）如何从基因文库中获取目的基因？ （5）为什么要建立cDNA文库？如何获取cDNA？ （5）PCR技术的原理是什么？利用PCR技术扩增目的基因的前提是什么？ （6）如何获取引物？ （7）请你用文字和箭头描述PCR技术扩增的过程？ 3、第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心步骤） （1）在基因工程的操作过程中，为什么要构建基因表达载体？单独的DNA片段能不能稳定遗传？ （2）参考课本P11页图1—10基因表达载体模式图，在学案上绘出基因表达载体的模式图，并标出其组成部分。并了解什么是启动子、终止子？他们位于哪里？有什么作用？标记基因的作用是什么？
思考:1、作为基因工程的表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么 2、完成教材P11页的“寻根问底” 第二课时 4、第三步：将目的基因导入受体细胞 （1）为什么要把目的基因导入受体细胞而不是在外界培养让其维持稳定和表达？（2）什么是转化？ （3）将目的基因导入植物细胞的方法有哪些？最常用的方法是哪种？（结合示意图，了解农杆菌转化法的基本过程） （4）将目的基因导入动物细胞的基本操作程序是怎样的？要用到什么技术？ （5）早期的基因工程为什么选择原核生物作为受体细胞？大肠杆菌细胞最常用的转化方法是？
基因重组与基因工程 第一节 DNA的重组 自然界不同物种和个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。 一、同源重组 同源重组：发生在同源序列间的重组称之，又称基本重组。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型(1964年) 结果可产生片段重组体和拼接重组体两种重组体。 二、细菌的基因转移与重组 （一）接合作用 概念：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可以从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），此类型的DNA转移,称之。 只有某些较大的质粒，才能通过接合作用从一个细胞移至另一细胞。质粒双链DNA中的一条链就会切割、产生单链缺口，切口单链DNA通过鞭毛连接桥向另一细胞转移，随后在两细胞内分别以单链DNA为模板合成互补链。 （二）转化作用 1、概念：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体 细胞获得新的遗传表型，这就是转化作用。即由外来DNA引起生物类型的改变过程。 2、本质：外来DNA重组(整合)到宿主细胞内表达新的蛋白质，（经过 复制、转录、翻译）——→经过转化，遗传类型改变。 但是，由于较大的外源DNA不易透过细胞膜，因此自然界发生的转化作用效率并不高，染色体整合几率则更低。 （三）转导作用 概念：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
常见：噬菌体感染宿主时伴随基因转移；噬菌体感染宿主有两种结局：1）溶菌生长途径——噬菌体DNA在宿主菌内迅速增殖，产生新的病毒颗粒，溶解细菌，释放新生噬菌体； 2）溶源菌生长途径——噬菌体DNA整合进宿主染色体，随宿主DNA 复制而被动复制。 三、位点特异的重组 位点特异的重组：由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 （一）λ噬菌体DNA的整合 （二）细菌的特异位点重组 沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 （三）免疫球蛋白基因的重排 四、转座重组 概念：大多数基因在基因组内的位置是固定的，有些基因可以从一个位置移动到另一位置，这种由插入序列和转座子介导的基因移位或重排，称为转座。 （一）插入序列转座——两种形式 1、保守性转座：是插入序列从原位迁至新位； 2、复制性转座：是插入序列复制后，其中的一个复制本迁移至新位，另一个仍保留在原位。 （二）转座子转座 概念：转座子就是可从一个染色体位点转移至另一位点的分散的重复序列。 第二节重组DNA技术 一、重组DNA技术（或称基因工程）相关概念： 1、DNA克隆(分子克隆)：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA 接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过