反向PCR技术原理和应用
摘要：PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段不扩增。反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。随着现代医学和分子生物学的飞速发展，该技术在各个领域都发挥着重要的作用。
关键词：反向PCR;原理;不足之处;应用
反向PCR是一种多聚合酶链式反应（PCR）应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于P CR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4 kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板（依赖于引物）的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点（例如，互补突头连接与钝头连接）。对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别多个碱基位点的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。
用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向PC R大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4 DNA聚合酶修理（钝化）。连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。
聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火，T aq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向P CR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。
1 反向PCR技术原理
反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。
2 反向PCR技术不足之处
该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶
进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。
3 应用
3.1克隆慢病毒介导的转基因小鼠整合位点序列
卵周隙显微注射慢病毒载体是制备转基因动物，尤其是转基因小鼠的一种新的方法。它相对于传统的方法，如原核显微注射质粒载体等，具有外源基因整合率高、适用广等优点。整合位点是外源基因表达的决定性因素之一。当慢病毒介导的转基因动物拷贝数较少时，由于整合位点的不同将导致外源基因的表达呈多样化或高低不等。因此，整合位点的分析对于深入探讨外源基因在转基因动物中的表达规律具有重要的意义。
转基因整合位点的研究通常应用染色体步移技术，而在众多染色体步移方法中，反向PCR是应用最早，也是最常用的方法之一。反向PCR的过程是：选择在已知序列中没有酶切位点的限制性内切酶将基因组DNA完全酶解后，DNA片段在低浓度的体系中自连接形成环状分子，然后利用已知序列中反向的PCR引物扩增已知序列的旁侧序列。
张俊等获得了经测序的慢病毒介导的转基因小鼠整合位点序列信息，可结合外源基因拷贝数及外源基因的表达情况分析整合位点与外源基因表达之间的关系，为建立高表达的慢病毒介导的转基因小鼠的新品系提供科学数据和参考。
3.2 建立有效分离酵母人工染色体（YAC)末端的方法
构建含有目的基因区域的精细物理图是基因克隆的前提。建立物理图的主要途径是通过筛选酵母人工染色体(YAC)文库，建立互相重叠的YAC重叠群。在建立YAC重叠群的过程中，一个很重要的工作就是分离YAC末端。
龚瑶琴等在构建11q13 YAC重叠群过程中，发现反向PCR用于YAC末端的分离较其它方法（Alu一载体PCR和锚定PCR等）有明显的优势。经过反复试验和改进，建立了简便易行的用反向PCR分离YAC末端的方法。
3.3 扩增抗人宫颈癌单克隆抗体重链可变区基因
单克隆抗体(mAb) V区cDNA序列的克降是构建单链抗体(ScFv)的关键一步。通常是在抗体V区序列两头5’和3’端设计带简并碱基的引物，用普通PCR法进行扩增。该法虽看似简单，但局限性很大，若遇到同源性差且复杂的序列，则难以获得。同时，因带有简并碱基，可使PCR产物不纯，而影响蛋白的表达及其功能。王莹等在构建抗人宫颈癌ScFv过程中，用常规PCR法扩增出V H cDNA序列．经多种方法尝试，均未获得V H cDNA序列。随后，采用反向PCR技术扩增并测序，与GenBank的已知序列相比较，证明PCR扩增产物的测序结果确为V H cDNA序列，为重组制备ScFv奠定了基础。
3.4 扩增细菌热激蛋白HSP60基因
HSP60属于热激蛋白家族。热激蛋白广泛存在于真核生物细胞器及细菌中，其功能是帮助蛋白质肽链折叠成正确的构象。当有机体受到理化刺激时．热激蛋白的表达会进一步增强。由于热激蛋白的结构和功能保守，近年来，其分子序列常被用来研究生物的系统进化。HSP60家族的所有成员，不论属于真核生物还是原核生物，其分子中均有两段、各八个氨基酸十分保守，分别是GDGTIATV和AVKAPGFGD。如何从已知序列的核心区向上游和下游步移，是HSP60全基因克隆的中心问题。经典的方法是利用鸟枪法构建基因组DNA文库．再用核心区作为探针筛选该基因文库，便可得到含有核心区及其上下游序列的克隆。但该方法工作量大，效率也较低。
为了研究双歧杆菌及加德纳氏菌等有关细菌的系统进化，蹇文婴等在已获得HSP60基因
核心区序列的基础上，采用反向PCR对3株双歧杆菌和1株加德纳氏菌的HSP60基因全序列进行了扩增、克隆和序列测定，结果证明，该方法可有效地扩增细菌的HSP60全基因序列。3.5 扩增沙门菌第一类整合子旁翼基因序列
整合子对细菌耐药性的介导作用，已经引起研究人员的广泛注意，尤其第一类整合子在耐药菌中分布最广泛，占有重要地位。在以往研究中，对沙门菌第一类整合酶基因阳性菌株的指纹图谱及其检测方法都已有探讨，但是对第一类整合酶基因及耐药基因盒的调控序列研究报道却极少。现已知，一个基因的表达在很大程度上是由它的旁侧序列调控的，克隆基因的旁侧序列已经成为分子生物学研究中的常规工作之一。
如何对细菌耐药基因盒的表达和整合酶基因进行调控，是控制细菌耐药性产生和传播的关键。研究整合子的旁翼序列，使第一类整合子的结构可以更加清晰及明确，有助于进一步分析整合子的调控因子，控制细菌耐药基因的捕获和表达。
在测定已知基因片段的旁测基因序列方法上，常用的有染色体DNA步移、锚定引物PCR、加人衔接头等方法，其中应用染色体DNA步移的方法以其准确性高而常用。反向PCR 技术可以对一个已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究，也称染色体步移。该方法常用于检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件，在分子生物学研究中有广泛应用。
3.6 HLA—AB分型
HLA位于人类第6号染色体短臂6p21.3区域。具有高度的多态性。它在抗原识别和递呈、免疫应答与调控等方面，起着非常重要的作用，是影响造血干细胞移植成败和器官移植物长期存活的关键因素之一，其中HLA—A，B，DR的影响较大。目前，常规采用血清学分型方法用于HLA-AB分型。但是由于抗血清之间存在交叉反应性及高质量的抗血清较难得到，从而导致血清学分型结果不尽如人意，造成分型错误及空白较多。冯明亮等研究采用反
PCR-SSOP方法作HLA—A，B，DR分型，并用于移植前配型。
反向PCR—SSOP方法即通过5’端标记有生物素的特异引物扩增HLA—A，B第二，第三外显子高变区域。再与根据这些高变区序列设计的交联于尼龙膜上的寡核苷酸探针杂交，可检测截至于1998年11月WHO序列文库中的A座位107个等位基因，B座位238个等位基因。
结果发现利用反向PCR - SSOP技术对所有样本分型均获成功,无假阳性和假阴性结果出现,可准确分辨A座位107 个等位基因,B座位238个等位基因和DR 座位251 个等位基因,UCLA室间质控细胞DNA分型结果与UCLA公布的测序结果一致,移植配型标本血清学结果HLA - A 错检率6. 4 % ,HLA - B错检率为7. 4 %。2例白血病病人分别有一个HLA抗原血清学方法不能检出。
反向PCR—SSOP用于HLA基因分型是可靠的，充分体现反向PCR—SSOP方法快速、
敏感、准确的特点。该方法的建立，为HLA基因分型提供了一个极有价值的实验工具，值得在广大配型工作者中推广使用，尤其是在造血干细胞库的建立中。有利于HI A分型结果的标准化。
4. 前景
反向PCR有着自己独特的特点，虽然有不足之处，但它在各学科和各领域都有着重要的作用。随着PCR技术和分子生物学的发展，它在各学科和各领域的作用将会越来越重要，应用也将会更加普遍。
参考文献：
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