有机双光子材料的研究进展
随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。
一、双光子吸收的基本概念
双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。
图1 单、双光子吸收和发射机理示意图
和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点：
（1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。
（2）双光子吸收具有高度的空间选择性。双光子诱导的电子跃迁几率与入射光强度的平方I2成正比，并且只有入射激光的峰值功率密度(光强)达到一定的闽值，才会有双光子吸收现象。在激光束紧聚焦条件下，双光子吸收效应局限于材料内部相当于入射波长立方λ3的微小区域内，而在焦点以外的地方，入射光的峰值功率密度可控制在激发阈值以下，则不会有双光子吸收，从而实现了双光子吸收效应的高度空间选择性。
（3）双光子吸收与单光子吸收的量子选择定则不同。对于中心对称的分子，其电子态具有明确的宇称，分别标记为g(gerude)或u(ungerude)。通常单光子吸收的选择定则为g-u或u-g，而双光子吸收的最大特点在于其选择定则是g-g或u-u，分子的宇称奇偶性保持不变[2]。
二、有机双光子吸收材料的研究现状
双光子吸收技术的发展很大程度上依赖于在人们所希望的波长范围内具有大的双光子吸收截面分子的合成，在共轭链的两端对称地或不对称地接上给电子基团或受电子基团都可获得有效的双光子吸收材料。目前，研究最多的双光子吸收材料的分子结构是π共轭单元两边对称地或不对称地接上供电子取代基或吸电子取代基，形成D- π- D、A- π- A或D- π- A型的分子结构。通过改变供电子取代基或吸电子取代基, 增加共扼链的有效长度，或在共轭单元上引入各种基团而使分子的电荷重新分布，都可以增强分子的双光子响应强度。
虽然最先研究的双光子吸收材料是无机材料，但是同无机双光子吸收材料相比，有机双光子吸收材料具有许多优点：（1）成本低；（2）易于进行器件制作和集成；（3）性能可通过结构修饰进行调节；（4）光学损伤阀值高；（5）非线性光学响应快速；（6）具有相对于无机铁电晶体高一到两个数量级的非线性光学系数。研究表明：双光子吸收材料的双光子吸收截面和化合物的结构有很密切的关系，如：分子的共平面性、分子的维数、π连接的长度等。现有的有机双光子吸收分子按照其化学结构及空间维数可分为：一维线性双光子吸收分子，多枝状双光子吸收分子和聚合物双光子吸收分子等[3-5]。
1、一维线性双光子吸收分子
一维线性双光子吸收分子是人们最先研究的有机双光子吸收材料。一维线性双光子吸收分子可以分为对称的一维线性双光子吸收分子（D-π-D,D-A-D,A-π-A,D-π-A-π-D,D-π-D-π-D,A-π-A-π-A等,D 表示电子给体，π表示共轭键桥，A表示电子受体）和不对称的一维线性双光子吸收分子（D-π-A）两种类型。常见的π中心为：苯、二联苯、芴、噻吩和蒽等。
与二苯乙烯（R1）相比，其它化合物（R2-R5）的双光子吸收截面值（σ2）明显增大。M.Albota 等人通过计算认为，主要原因是取代基上推电子基团使电子离域增加，分子被激发后，电荷重新分布，增大了S1和S2态的跃迁矩。
为了提高一维分子的双光子吸收截面，可以从以下几个方面来改进：（1）增大共轭链的长度。（2）增加双光子吸收有机发色团的数密度。（3）增大分子的共平面性。（4）改变有机分子共轭桥的密度或者
引入极性更大的π电子共轭桥。（5）增大末端的电子给体或电子受体的强度有助于增加双光子吸收截面。一般而言，电子给体、受体的强度越大，越有利于形成电荷转移的共振态，扩大π电子流动范围，使分子在外场作用下更易发生分子内电荷转移而有利于增强分子的双光子吸收截面。
图2 有机双光子吸收材料
2、多枝状双光子吸收分子
探索多维树枝状的强双光子吸收材料是目前研究的热点之一。这类分子主要是以同一结构单元为中心，例如：三苯胺及其衍生物（R6-R8）、三苯取代苯、苯环和芳香杂环等，各种常见的电子给体和电子受体的发色基团为支链形成树枝状或三维网状结构的大共轭体系的分子。增加分子维数形成多枝结构，利用协同增强效应可以有效的提高分子的双光子吸收截面。同时一维线形分子的双光子吸收特性和分子的结构之间的关联也适用于多枝类型的分子，给受体强度的增强和分子共轭链长度的增加，有利于双光子吸收截面的提高，增大共轭桥的可极化程度，促进分子内电荷转移，增大共平面性等都有助于增大分子的双光子吸收截面。
3、聚合物双光子吸收分子
聚合物结构的双光子吸收材料报道的相对较少，K.D.Belfield小组和A.Hohenau小组分别报道了几
种以芴的衍生物为单元的聚合物作为双光子吸收材料,化合物R9和R10的双光子吸收截面分别达到420和72000 GM。
三、双光子技术的应用
双光子吸收有着明显不同于单光子吸收的特点，这使得具有强双光子吸收的材料在许多方面具有很好的应用前景。诸如光限幅、激射、双光子聚合微加工、双光子三维存储，光动力学医疗、可控药物释放等[4-5]。下面将简单介绍下双光子吸收材料在显微成像和光动力学治疗中的应用。
图3 双光子技术的应用
双光子激光扫描共焦显微技术是结合双光子过程和扫描共聚焦显微成像系统的新型显微成像技术。通常的单光子荧光显微成像是一个柱面，而双光子荧光显微成像是一个点，因而双光子荧光显微术具有其独特的优点：（1）只有焦点处汇集足以产生双光子吸收的光强度，因而可获得高的分辨率；（2）用比生物材料的本征吸收长一倍的近红外光进行激发，大大降低了样品的漂白和降解，提高了样品的存活率，甚至可以获得深层活组织的影像，这使得在活细胞中研究复杂的过程如DNA的复制成为可能；（3）由于瑞利散射产生的背景噪声只有单光子荧光时的1/16，图像对比度高；（4）激发光和信号光波长的差别显著，易于滤波探测；（5）用可见光区的光学元件，可获得紫外光区的衍射极限分辨率，降低了光学元件在紫外区的色散[6]。
用光动力作用治病的方法称为光动力疗法，全称为Photodynamci ThePary，缩称PDT。光动力作用是指在敏化剂参与下，经光激发，可使有机体、细胞或生物分子发生机能及形态变化，严重的可致受伤或坏死。而这个作用过程必须有氧参与，因此又称光敏氧化作用，化学上称光敏化作用。2000年，P. N. Prasad等人在800nm下利用双光子材料转移能量给光敏剂然后产生单线态氧从而可以应用于光动力学治疗疾病, 这为高效的单线态氧双光子敏化剂的分子设计提供了新思路[7]。2001年，丹麦科学家P. R. Ojilby 等人合成了两种有机环境下的双光子单线态氧发生剂，基于单线态氧磷光检测证实了双光子诱导产生单线态氧的方法具有深度贯穿性和高空间选择性的优点[8]。通过红外强双光子激光光敏剂的光动力学治疗，波长800-1100nm的红外光能够深入病灶区，杀死隐藏的病变细胞，而双光子激发空间定位性高，可以保证了PDT用于切除肿瘤时，不会对体内正常组织造成损害。
参考文献
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我今天讲解的文献题目是对生物组织中过氧化氢进行比率成像的一种双光子荧光探针。 背景知识：过氧化氢是活性氧族中的重要一员，活性氧族包括（超氧阴离子自由基、过氧氢自由基、羟基自由基、过氧自由基、单线态氧、次氯酸等）在生物组织的生理衰老及病理方面有着重要的作用。但是超过细胞正常水平的过氧化氢会引起DNA损伤、突变以及遗传的不稳定性。 1.与其他探针作比较：主要讲了采用硼酸盐机理保护的探针对过氧化氢具有较高的选择性，并在细胞中稳定成像，但是这些探针大多用于单光子显微镜并要求短波长激发，以上这些都限制了它在深入组织中的成像的应用。 与单光子探针比较。双光子显微镜比单光子显微镜具有穿透力强、定位激发以及延长观察时间等大量优点而在检测活细胞组织中的过氧化氢方面具有很好的应用前景。 2.探针设计要求：对过氧化氢高效的双光子探针应具有以下特点：在水溶液缓冲剂中具有足够大的溶解性、对过氧化氢具有较高的选择性、有较高的双光子活性横截面和在生物PH范围内有较稳定的光谱性质。 探针的合成：通过过氧萘引入含有硼酸基的氨基甲酸酯合成了AN1。与过氧化氢相连的硼酸盐与缺电子的氨基甲酸酯分离会得到富电的AN1，引起更多红移荧光散射。并在模拟生理环境下表征它的光学特性以及AN1的光学特性，而且PN1相对AN1发生了50nm的蓝移。AN1相对PN1有较大的位移是因为更稳定的电荷转移激发前荧光团的形态包括给电子基和吸电子基。 荧光性能测定：PN1与过氧化氢的反应主要通过发射荧光和液相色谱-质谱仪检测，产物AN1是主要的荧光物。 其他性能测定：1然后我们估测PN1在双光子模式下对过氧化氢的探测能力。 2PN1要比其他活性氧类对过氧化氢有更高的选择性。 2接下来力图利用PN1做双光子探针来检测细胞环境里过氧化氢含量的变化。 为了进一步建立PN1在生物成像领域的应用，我们也做了这个新探针在检测活的组织中过氧化氢含量变化的能力。 结论：最后我们得出结论，我们研究的这种新型双光子探针PN1具有大的荧光活性面、对过氧化氢有一个很明显的有蓝变绿的一个颜色变化过程、对活性氧类具有较好的选择性、低细胞毒性、对生物活性体内PH的变化不敏感等优点。这个新的探针可以对活细胞以及活组织中的过氧化氢深度范围成像而不受其他生物活性氧类的干扰。当前的努力主要是利用PN1以及对过氧化氢在复杂生物样本内的荧光成像化学过程的研究。
７ 前 言 荧光比率技术是荧光分析中的一项重要技术。该技术在生物染色剂中，可被紫外线或蓝紫光（短波长光）激发而发射荧光的染料，称为荧光染料（荧光色素）。可被长波长光激发，这些荧光色素常称为荧光探针。荧光探针通常用于固定组织和细胞的染色，以及或活细胞中的应用， 此外还包括应用于体内荧光探针。 分子荧光探针按用途分类包括离子探针、极性探针、粘度探针、ＰＨ值探针、膜荧光探针、细胞活性探针、细胞器探针、位点特异性荧光探针等等。探针通过与分析物（如生命金属离子）进行结合后，引起荧光特性发生变化，通过测定荧光的激发波长、发射波长、荧光强度、峰位、荧光寿命、荧光量子产率和各向异性等，获得相关信息。 荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发或发射光谱移位的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，称为比率测量。因为通过二个选择性的波长的荧光强度变化可作为定量的依据， 通常指在波长范围内有荧光强度明显的变化。同普通荧光探针相比，比率测量探针可以被分为两部分。 一种是荧光比率效果是通过原来荧光谱的迁移。通常，这些迁移的背景是荧光探针激发态的电子转移。它被激发通过改变发色团同周围分子或原子交互作用的能量改变（溶剂化显色迁移），同外部电场的交互作用（电致显色迁移）和在发色团中的双电弛豫（双电弛豫迁移）。 另外一种结合探针，荧光谱包括２个或更多的谱带。通常，是这些谱带相对强度的改变，激发态同荧光探针发色团反应。这些反应在不连续的能量状态。 荧光比率探针及其应用研究进展 杨柳＊ ，郭成海，张国胜 （防化研究院第四研究所，北京 １０２２０５） 摘要 本文介绍了荧光比率探针，包括阳离子探针、阴离子探针、ｐＨ值探针、极性探针、氧化性和分子的比率测量探针的应用及近几年的研究进展。关键词 荧光分析，比率测量 ＊作者简介：杨柳（１９７５－），男，助理研究员，博士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｌｉｕｊｉｎｊｉｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 所以在初始和产物状态都随着能量转移而发射荧光。 荧光比率测定法可消除光漂白和探针负载和留存及设备因素（照明稳定性）引起的数据的失真。如阴离子探针可通过有机离子载体从细胞排除，如ＡＭ酯可被Ｐ糖蛋白多药载体排出荧光比率测定法可减少探针渗漏对实验结果的影响。探针与离子结合后，出现激发或发射光谱移位的探针可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率校准，可克服由于离子浓度的变化而造成的荧光信号人工假象。 Ｂｒｉｇｈｔ等（１９８９）发现比率测量减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度、和检测效率。消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、细胞厚度、探针在细胞内（区室化作用引起）或不同细胞群之间（负载效率差异造成）的不均匀分布。 比率测量探针已经应用于不同的测量领域：离子探针（阳离子探针Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋，Ｚｎ２＋，Ａｇ＋等）阴离子探针（Ｃｌ－，ＣＮ－，Ｆ－等），膜探针、活性氧和一氧化氮探针，极性探针、ＰＨ值探针等等。 １应用比率测量的阳离子探针： 各种各样的阳离子在生命活动中起重要的作用， 如构成细胞和生物体某些结构的重要成分，参与并调节生物体的代谢活动等，荧光方法通常用来测定阳离子在生物体不同组织的含量和分布。阳离子比率测量探针也在不断发展。 １．１ Ｃａ２＋检测的比率测量探针： 探针与Ｃａ２＋结合后出现光谱移位的探针可进行比率测量。主要包括：Ｆｕｒａ－２、双－ Ｆｕｒａ－２、Ｆｕｒａ－４Ｆ、Ｆｕｒａ－５Ｆ、Ｆｕｒａ－６Ｆ、 ｉｎｄｏ－１、ｉｎｄｏ－５Ｆ、ｍａｇ－Ｆｕｒａ－２
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报告目录 报告核心要素......................................................................................................... I 一、主题简介 (1) 二、主题相关科研产出总体分析 (1) 2.1 文献总体产出统计 (1) 2.2 学术关注趋势分析 (2) 三、主题相关科技论文产出分析 (2) 3.1 中文期刊论文 (2) 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 (2) 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 (3) 3.1.3 发文较多期刊 (4) 3.1.4 发文较多的机构 (4) 3.1.5 发文较多的人物 (4) 3.1.6 核心期刊分布数量对比 (4) 3.1.7最近相关中文期刊论文 (5) 3.1.8被引较多的相关期刊论文 (6) 3.2 学位论文 (7) 3.2.1 近十年学位论文年代分布列表 (7) 3.2.2 学位论文增长趋势 (8) 3.2.3 硕博学位论文数量对比 (8) 3.2.4 发文较多的机构 (9) 3.2.5 发文较多的人物 (9) 3.2.6 最近相关学位论文 (9) 3.3 中文会议论文 (10) 3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表 (10) 3.3.2 中文会议论文增长趋势 (10) 3.3.3 中文会议论文主办单位分布 (11) 3.3.4 发文较多的机构 (11) 3.3.5发文较多的人物 (11) 3.3.6最近相关中文会议论文 (12) 3.4 外文期刊论文 (12) 3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表 (12) 3.4.2 外文期刊论文增长趋势 (13) 3.4.3 最近相关外文期刊论文 (13) 3.5 外文会议论文 (13) I
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201920375721.9 (22)申请日 2019.03.22 (73)专利权人 中国科学院苏州生物医学工程技 术研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城 科灵路88号 (72)发明人 徐欣 高峰 张欣 金幸杰 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 韩飞 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) (ESM)同样的发明创造已同日申请发明专利 (54)实用新型名称 光学相干层析和双光子荧光同步成像系统 (57)摘要 本实用新型公开了一种光学相干层析和双 光子荧光同步成像系统，包括双光子光源、快轴 扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫 描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光 子荧光成像模块以及成像显微物镜。本实用新型 的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，通 过将双光子扫描成像技术和光学相干层析成像 技术相结合，采用共光路共振镜同步扫描成像方 法有效减少了系统硬件，实现了光学相干层析技 术和双光子荧光扫描成像扫描速度的有效利用， 达到了样品荧光快速面成像和断层成像的目的。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 209946009 U 2020.01.14 C N 209946009 U
权 利 要 求 书1/2页CN 209946009 U 1.一种光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，包括双光子光源、快轴扫描模块、慢轴扫描模块、第一二向色镜、共用扫描模块、光学相干层析模块、第二二向色镜、双光子荧光成像模块以及成像显微物镜； 所述光学相干层析模块中发出的样品光经过所述慢轴扫描模块后透射所述第一二向色镜，所述双光子光源发出的飞秒激光经过所述快轴扫描模块后被所述第一二向色镜反射，与透射所述第一二向色镜的样品光相结合，共同经过所述共用扫描模块后透射所述二向色镜，再经过所述成像显微物镜后照射到样品上；飞秒激光激发样品产生的荧光经所述成像显微物镜后被所述第二二向色镜反射至所述双光子荧光成像模块进行荧光成像，样品光照射到样品上被反射形成的成像光沿原路返回，依次经所述成像显微物镜、透射第二二向色镜、共用扫描模块、透射第一二向色镜、慢轴扫描模块后进入所述光学相干层析模块进行层析成像。 2.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述双光子荧光成像模块包括沿光路依次设置的成像聚焦透镜、滤光片和探测器，样品被激发后发出的荧光经所述第二二向色镜反射后，依次经所述成像聚焦透镜、滤光片后由所述探测器接收，进行荧光成像。 3.根据权利要求2所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描模块包括快轴扫描振镜和快轴聚焦透镜，所述慢轴扫描模块包括慢轴扫描振镜和慢轴聚焦透镜。 4.根据权利要求3所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述共用扫描模块包括依次设置的共用扫描振镜、共用聚焦透镜和中继透镜组。 5.根据权利要求4所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述快轴扫描振镜的扫描轴方向与共用扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述快轴扫描振镜的扫描轴分别与所述双光子光源发出光的光轴以及快轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述慢轴扫描振镜的扫描轴方向与快轴扫描振镜的扫描方向相互平行，且所述慢轴扫描振镜的扫描轴分别与所述光学相干层析模块发出光的光轴方向以及慢轴聚焦透镜的光轴垂直； 所述共用扫描振镜与所述快轴扫描振镜的扫描方向相互垂直，且所述共用扫描振镜的扫描轴分别与所述共用聚焦透镜、中继透镜组的光轴垂直。 6.根据权利要求5所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述慢轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述慢轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置；所述快轴聚焦透镜和共用聚焦透镜构成4f系统，所述快轴扫描振镜和共用扫描振镜位于4f系统的透镜焦点位置。 7.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述光学相干层析模块包括谱域光学相干层析系统或者扫频源光学相干层析系统。 8.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第一二向色镜截止波长为900nm，长波反，短波通，其透射所述光学相干层析模块发出的样品光以及样品反射的成像光均，且反射所述双光子光源发出的飞秒激光。 9.根据权利要求1所述的光学相干层析和双光子荧光同步成像系统，其特征在于，所述第二二向色镜截止波长为650nm，长波通，短波反，其透射所述双光子光源发出的飞秒激光、 2
相关技术指标与进口必要性 双光子显微镜的独特优势有以下几点： 1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。 2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。更加适合活体 下微弱荧光信号的观察。 3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。 4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。 主要技术指标： 1 显微镜 1.1 适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度≥23 cm； 1.2 显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式 对样品进行定位和观察； 1.3 显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程≥35 mm，步进≤100 nm； 1.4 配备长寿命落射荧光光源； 1.5 配备可观察FITC和DsRed的滤色块； 1.6 配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直
《生物工程进展》2000,Vol.20,No.2 荧光探针研究新进展 章晓波 徐 洵 (国家海洋局第三海洋研究所,厦门 361005) 摘要 自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(hetero2 geneous assay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneous assay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。 关键词 荧光探针 分子信标探针 荧光PCR 1 常规荧光探针 固相杂交中,探针非特异结合于支持物表面,降低了灵敏度。Heller等(1982)以及Heller和Morri2 son(1985)[3]最早进行了同相杂交试验,同相杂交不需支持物,减少了固定目的DNA及除去未杂交探针等操作。他们的试验中使用了两个探针,这两个探针分别与目标DNA的两个相邻区域互补,第1探针在3′末端标记,第2探针在5′末端标记,根据标记物的光谱特性,使第1标记物为第2标记物的能量供体。当探针与目标DNA杂交时,二探针彼此靠近,光吸收或化学反应激发供体标记物,通过能量转移引起受体标记物的激发,这样,第1标记物发射光的减少以及(或)第2标记物发射光的增加标志着目标DNA的存在。 后来Morris on等[3]扩展了这一方法,他们使用的两个探针互补且相应于目标DNA上同一碱基序列,一个探针在5′末端标记荧光素,另一互补探针在3′末端标记荧光素发射的淬灭剂芘丁酸(pyrenebutyrate)或磺基若丹明101(sulforhodamine101)。无目标DNA 时,两探针结合,荧光素的能量转移至淬灭剂,不产生荧光。存在目标DNA时,探针与目标DNA之间竞争杂交,由于探针与目标DNA的结合,在494-496nm 光照下,产生荧光,目标DNA浓度越高,荧光信号越强,最低可检测到4pM的目标DNA,此方法得到一些应用[2,4,5]。Cardullo等[4]在应用Morris on方法的同时,提出在两个互补探针的5′末端分别标记荧光素和四甲若丹明(T etramethylrhodamine),因为荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy trans ferr FRET)的效率随供体和受体之间距离的-6次方而减少,当两者相距20个核苷酸(70!)即产生不明显的能量转移,因此此方法中所使用的探针长度较短,特异性降低。 2 分子信标探针 同相杂交一般同时采用两个标记探针,Tyagi 和Kramer(1996)[6]首次建立了分子信标探针(molecular beacon probe),在同一寡核苷酸探针的5′末端标记荧光素、3′末端标记淬灭剂(DABCY L)。分子信标探针能形成发夹结构,探针的噜扑环与目的DNA碱基互补,噜扑环两侧为与目的DNA无关的碱基互补的臂。无目的DNA时,探针形成发夹结构,荧光素靠近淬灭剂,荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂,DABCY L吸收能量后以热量形式消失,结果不产生荧光。当探针遇到目的DNA 分子时,形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交,探针自发进行构型变化,便两臂分开,荧光素和淬灭剂随之分开,此时在紫外照射下,荧光素产生荧光。 影响分子信标探针构型变化的参数主要有[6]:臂长、臂序列GC含量、噜扑环长度和溶液盐浓度,尤其是二价阳离子如Mg2+对两臂形成的杂交茎有较强的稳定作用,在Mg2+存在条件下,4～12个核 41
双光子荧光显微镜的原理特点 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。 双光子激发的基本原理是： 在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。 双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。 这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100飞秒，而其周期可以达到80至100兆赫。 在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。 为形态学、分子细胞生物学、神经科学、和药理学等研究领域中重要的研究手段。 1.双光子显微镜出现的背景----传统激光共聚焦显微镜的两大局限: 1)一是光毒性现象： 因为共聚焦的针孔必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得
足够的信噪比; 而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 2)光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。 在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 2.为什么说双光子显微镜一般不需要配备紫外激发激光器? 双光子显微镜技术是建立在双光子激发效应的基础上的一种荧光激发技术：荧光染料分子可以同时吸收低能量的两个光子而被激发(两个光子到达荧光分子的时间间隔小于1飞秒)，其激发效果可以等同于吸收一个1/2波长的高能量光子。 例如，吸收两个红色波长的光子，相当于一个吸收紫外的分子。长波长的光子不易被细胞吸收，因此对活细胞的光毒性减少，也降低了光漂白。这样即起到紫外激发的功能，又避免了紫外光线对样品的伤害。 3.双光子显微镜的激光器有何特别之处? 双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在10-18秒内到达)。双光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。 因此所用激光器多为钛宝石激光器，可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度，且具有非常高的峰值功率和较低的平均功率，从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。
双光子显微镜 https://www.doczj.com/doc/7413322087.html,/view/1428311.htm?fr=ala0_1 双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新 技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100 飞秒，而其周期可以达到80 至100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点：1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。 激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题： 一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像，而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，相应的，激发光必须足够强以获得足够的信噪比；而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色，荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。 光毒作用是另外一个问题，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。 在传统荧光显微镜中，一个荧光团吸收一个光子，该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态，也可以通过同时吸收两个较低能量（即更高的波长）的光子激发荧光。例如，吸收两个红色波长的光子，可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程，对激发光强度有平方依赖关系。
有机双光子材料的研究进展 随着以光电子学为中心的信息时代的到来，具有特殊信息处理功能和超快响应的光电材料将成为未来信息材料发展的主体，而非线性光学材料就是其中发展较为迅猛的一种。非线性光学是强光光学，研究的是物质在强光作用下产生的输出光强度与原入射光的非线性关系。非线性光学材料在强光作用下，反映介质性质的物理量（如极化强度P等）不仅与场强E的一次方有关，而且还决定于E的更高幂次项，从而导致许多在线性光学中不能解释的新现象，表现出独特的非线性光学性质。双光子吸收属于三阶非线性光学效应的一种，有着独特的光学和电学效益，使得双光子技术在未来光电子集成、生物分子探测、医学诊断等领域具有巨大的应用潜力和广阔前景[1]。 一、双光子吸收的基本概念 双光子吸收属于三阶非线性光学效应，该理论最早是由Goeppert- Mayer于1931年首次提出的。它是指在强激光激发下，利用近两倍于样品的线性吸收波长的光源激发该样品，使其通过一个虚中间态(virtue state)直接吸收两个光子跃迁至高能态的过程，所吸收的两个光子的能量可以相同(ω1=ω2，简并吸收)，也可以不同(ω1≠ω2，非简并吸收)，其机理如图1所示。 图1 单、双光子吸收和发射机理示意图 和单光子吸收和发射相比，双光子吸收和发射有以下本征特点： （1）在材料中高的穿透深度。单光子荧光过程是短波激发长波发射，吸收和发射所涉及的基元光物理过程服从Stark-Einstein定律。而双光子荧光是长波激发短波发射，所用激发光的波长红移近一倍，一般位于600-900nm，远远低于单光子过程紫外辐照光(波长为250-400nm)的光子能量。这一波段的光具有很好的穿透性，Rayleigh散射小，背景光干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。
1.设备名称 双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜 2.数量 1套 3.设备用途说明 4.工作条件 电源220V±10%，50HZ 室温：20~25℃ 其他：防尘，除湿，抗震动 工作台：牢固，稳定，防震 5.规格、技术要求及参数 5.1 双光子飞秒激光器部分 5.1.1Ar激光：458nm、488nm、514nm，25mW 5.1.2HeNe激光：543nm，1mW 5.1.3HeNe激光：633nm，5mW 5.1.4405激光：405nm，30mW 5.1.5*红外飞秒脉冲激光器，波长范围:680-1080nm, 包含负色散补偿功能 5.1.6根据标本的情况利用飞秒激光器的双光子可观看800微米深度样品数据。 5.1.7*稳定的可见光AOTF，同时控制激光各波长的激光强度，8通道，切换时间<5 微秒。AOTF对激光强度的控制连续可调（0~100%），步进0.1%）。 5.1.8每支激光器通过独立的光纤连接到扫描器部分，光纤即插即用，无需校准。 5.1.9光纤末端具有可对激光进行聚焦的集光镜，电动调节。 5.1.10具有8个激光光路接口和红外飞秒激光器直接耦合端口。 5.2扫描器 1
5.2.1扫描器（含检测器）与显微镜直接连接于显微镜端口（非光纤连接），一体化设 计，一体化像差及色差校正。 5.2.2*整个光路的光学设计适用波长范围为360nm～1000nm全光谱范围。 5.2.3每个荧光检测器具有独立的10级可调数码增益。 5.2.4有可调大小的针孔，调节范围为连续调节，免维护。 5.2.5*光栅分光方式，并且具有减少信号损失的循环光路设计。 5.2.6各荧光检测通道均不采用发射光滤光片，荧光信号经光栅分光后可直接到达检 测器。 5.2.7*共聚焦成像通道：具备34个荧光检测通道，可以同时采集10个荧光通道和 1个透射光通道图像，10种荧光染料可同时分离成像，1个透射光通道（明场DIC效果） 5.2.8*扫描器（含检测器）必须内置高灵敏度GaAsP spectral 检测器，而且该仪 器能够整合FCS技术，使影像品質(S/N ratio)信噪比有2X提升，具有检测微弱的单分子荧光的功能。 5.2.9一个可用于明场和DIC观察的透射光检测通道。 5.2.10*两个独立的电动的10位滤光片转轮，通过滤光片导入激发光、透过荧光并阻 断从样品反射回的激光，可提供多至50种激发光波长组合。其中一个转轮可由用户自由更换滤光片，满足系统升级扩展的需要。 5.2.11可对荧光光谱进行分析，拆分光谱重叠的不同标记的信号，可以解决同时使用 多种荧光标记时，如GFP/YFP双标记，激发光或发射光波长重叠造成的串色问题。 5.2.12具有实时计算机系统（Real time computer ）监控扫描过程、同步及数据采 集，可选择使用16位、12位和8位A/D转换的动态范围。 5.2.13采用X、Y轴独立的双镜扫描，扫描为线性扫描。 5.2.14*扫描分辨率：可以在4 x 1至6144 x 6144之间自由选择。所有通道同时使 1
第46卷第7期2018年4月广 州 化 工 Guangzhou Chemical Industry Vol.46No.7Apr.2018 谷胱甘肽荧光探针的研究进展 * 石 磊1,2,黄 玲3,龚盛昭1,2 (1广东轻工职业技术学院轻化工技术学院,广东 广州 510300;2广东省绿色日用化工工程技术研究中心,广东 广州 510300;3佛山市安安美容保健品有限公司,广东 佛山 528099) 摘 要:谷胱甘肽在生物体的许多生理过程中发挥着重要作用,所以细胞内谷胱甘肽含量的检测对细胞功能研究和病理分 析都具有重要的意义三以荧光探针为基础的荧光分析法因其操作简便二灵敏度高和专一性强等优点而备受大家关注,并且有机小分子荧光探针还可以应用于活体细胞和生物体的成像技术三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的研究现状,并按照谷胱甘肽与探针识别基团的识别机理分类阐述,同时对谷胱甘肽荧光探针的未来发展趋势进行了展望三 关键词:谷胱甘肽二荧光探针二识别机理二检测 中图分类号:O657.3 文献标志码:A 文章编号:1001-9677(2018)07-0023-06 * 基金项目:广东轻工职业技术学院人才类项目(项目编号:KYRC2017-0031)三第一作者:石磊(1985-),男,博士,讲师,主要从事荧光探针的合成与应用三通讯作者:龚盛昭三 Research Progress on Fluorescent Probes for Glutathione * SHI Lei 1,2,HUANG Ling 3,GONG Sheng -zhao 1,2 (1School of Chemical Engineering and Technology,Guangdong Industry Polytechnic,Guangdong Guangzhou 510300;2Guangdong Engineering Technical Research Center for Green Household Chemicals,Guangdong Guangzhou 510300; 3Foshan Anan beauty &Health products Co,Ltd,Guangdong Foshan 528099,China)Abstract :Glutathione plays an important role in many physiological processes of life system,and the detection of glutathione in cell is significant for the research of cell function and pathological analysis.Fluorometric analysis based on fluorescent probes has attracted much attention due to its advantages,such as simple operation,high sensitivity and specificity.Moreover,the organic fluorescent probes could also be applied to bioimaging technology for living cells and organisms.The research progress on glutathione fluorescent probes was introduced and classified according to the recognition mechanism between glutathione and recognition groups of probes,and the developing trends of fluorescent probes for glutathione were prospected. Key words :glutathione;fluorescence probe;recognition mechanism;detection 谷胱甘肽(Glutathione,缩写GSH)是一种含有巯基二氨基和γ-酰胺键的三肽,主要由谷氨酸二半胱氨酸和甘氨酸组成三谷胱甘肽是细胞内一种重要的调节代谢物质;它不仅能够清除体内的过氧化物及其他自由基,促进肝脏酶活性二解毒和维持红细胞膜完整性等作用,同时还具有维持DNA 的生物合成和细胞免疫等多种生理功能[1-2]因此,检测生物体中的GSH 含量对于一些疾病的预防二研究和治疗都具有十分重要的作用,故而引起了诸多科研工作者的高度关注[3-4]三 相比于分光光度法二色谱法二毛细管电泳法二电化学法等传统检测方法,以荧光探针为基础的荧光分析法具有测试简单二选择性高二响应时间短等优点三更重要的是,荧光探针还能应用于生物体内的实时监测和生物成像研究,故而被广泛应用于生物医学二分析化学和化学生物学等诸多领域[5-6]三 近年来,基于谷胱甘肽的荧光探针得到了迅猛发展;若按照谷胱甘肽与荧光探针识别基团的识别机理进行分类,可以将 其分为加成反应取代反应和还原反应三本文主要综述了近年来谷胱甘肽荧光探针的设计合成与应用进展,并分类阐述如下三 1 加成反应 加成反应是利用GSH 中具有亲核性的巯基与不饱和双键(主要是碳碳双键)发生加成反应,使得探针的荧光发射光谱发生变化,从而实现对检测对象的识别与检测三 1.1 马来酰亚胺类 自Kanaoka [7]首次报道了以马来酰亚胺作为生物硫醇识别基团的荧光探针以来,基于马来酰亚胺的香豆素二BODIPY二喹啉二萘酐等[8-10]荧光探针陆续涌现出来,并成功应用于生物体内GSH 的选择性识别(图1)三然而,按此原理构建的大部分荧光探针对半胱氨酸(Cys)二同型半胱氨酸(Hcy)和GSH 均有响应,很难对这三者进行区分;仅少许报道是例外三其中,
胰腺细胞悬浮液样品适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况 目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化 原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为 1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙 震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。 Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。 方法： 1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃ 避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic F-127备用。 2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10 umol/L 染料液1 ml，置于37℃的CO2孵箱里避光温育30 min。 3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1 ml DMEM液后置于 20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。 4.启动LSCM，选择488 nm 氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp 2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30 sec）、扫 描次数（300次），开始扫描。 5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。 1)如果直接做活细胞观察,可以把细胞直接seed在放在6 well中的盖玻片上,然后培养,等观察时用镊子把盖玻片取出,倒扣在载玻片上就行了. 2)需要做免疫荧光染色的,可以做完染色,然后把细胞悬浮起来,滴一滴到载玻片上,盖上玻片观察. 如果是用探针孵育活细胞，可以先做成细胞爬片，在相关处理后，探针避光孵育，完毕后，用镊子把细胞爬片取出,倒扣在载玻片上就行了. 买国产玻片就可以，不过要泡酸过夜后再灭菌，之前可以按自己需要切片，根据大小，然后在30mm培养皿，中间打孔，用泡酸洗好的大玻片粘好，用时细胞种在切片上，切片放在皿小孔中，罐流都可以的。我们实验室十几年这种方法，不过如果活细胞工作站要求皿可以订制，很便宜，细胞可种在大玻片上，这样透光好。1、盖玻片买国产的就可以，不过有时背景较脏。你最好拿弱酸，如稀盐
金纳米棒用于双光子荧光成像 2016-04-18 12:31来源：内江洛伯尔材料科技有限公司作者：研发部 金纳米棒受激发后光物理过程 对活体生物组织的实时成像是人们一直追求的目标。实现活体成像的一个难点是如何提高深层组织的检测信号强度。由于一般激光和发射光很难透过组织，自身背景荧光的干扰及光在体内组织上的散射等因素都会降低活体深层组织成像的灵敏度，而加大激发光的强度又会对生物体产生伤害。因此，具有在近红外区光学性质可调控的金纳米棒可以在一定程度上解决这一问题。 新型荧光成像技术探索的道路上面临着两个难题：一是细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；二是对所研究分子很难进行长期荧光标记观察。这就迫切需要研制开发光稳定性好的近红外荧光探针。 目前，双光子激发有以下优点： (1) 由于用近红外光激发，所需能量低于破坏活体细胞能量阀值几个数量级，对活细胞的损伤很小，适于活体观察，光漂白作用也小； (2) 在组织中由于600～900 nm近红外光比可见光的透过率高，可达几个厘米，因此可观察样品中更深层的荧光像, 能够进行体外或在体内的非破坏、非介入性分析； (3) 许多原本只能在可见区甚至是紫外区使用的荧光探测试剂也可以应用在近红外区域。 (4) TPL信号能很好的与组织自发荧光区分。 Boyd等人最早于1986年报道了金纳米结构的双光子荧光性质(TPL)，但金膜的光电发射效率很低。金纳米棒在受到激光脉冲激发后能发出强烈的TPL, 特别适合做基于TPL的成像试剂。图为金纳米棒受激发后光物理示意图。近红外激光照射金纳米棒，诱导纵向等离子体共振激发，导致大部分光被吸收，少量散射。吸收双光子后，d轨道电子跃迁到sp轨道，形成空穴-电子对，空穴和电子分别再结合后发出双光子荧光。发热也是由电子振荡造成的。
医药化工化 工 设 计 通 讯 Pharmaceutical and Chemical Chemical Engineering Design Communications ·204· 第44卷第6期2018年6月香豆素又名苯并-α-吡喃酮，广泛存在于自然界中，并且 在许多植物中也存在大量的香豆素类衍生物[1]。香豆素类化合 物不仅在抗肿瘤药物的开发方面进行研究，并且以香豆素为骨架的基团也常作为荧光探针中最优的荧光团之一，其具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与修饰、良 好的荧光量子产率和好的光稳定性等特点。本文通过以香豆素为骨架的荧光探针对待测物的选择性不同进行分类，对近几年报道的香豆素类荧光探针进行了概述。 1 二氧化硫衍生物荧光探针 二氧化硫溶于水中，形成亚硫酸盐和亚硫酸氢盐之间的 平衡[2]。高浓度的亚硫酸盐会导致过敏反应、哮喘、胃肠疾病及皮肤过敏等疾病[3]。因此，用荧光探针技术来检测细胞中HSO 3-/SO 32-具有重要意义。Zhao 等将香豆素和苯并咪唑通过C —C 双键连接得到荧光探针1[2]，亚硫酸盐与该探针的α，β-不饱和酮之间的发生迈克尔加成反应，导致π共轭被阻断，荧光发生改变。该探针利用单光子荧光成像技术成功的实现了对活细胞中亚硫酸盐的检测。Feng 课题组以氮杂香豆素-半花菁偶联物为母核，设计合成比率型近红外荧光探针2[4]。该探针在条件温和的水溶液中对HSO 3-有好的选择性和高的灵敏度，成功应用于活 细胞中内源性和外源性亚硫酸氢盐的荧光成像研究。Li 课题组设计合成了以香豆素-丙二腈衍生物为骨架，以缺电子的C —C 双键为HSO 3-的反应位点的比率型荧光探针3[5]。该探针对 HSO 3-有高的选择性和敏感性，并且成功应用于对MCF-7细胞中HSO 3-荧光成像的研究。2 活性氧荧光探针活性氧（Reactive Oxygen Species ，ROS ）包括了超氧阴离子（O 2-）、过氧化氢（H 2O 2）、羟基自由基（·OH ）、次氯酸（HOCl ）以及一氧化氮等，这些物质的活性较高，在人类健康和疾病中有着重要的作用[6]。Liu 等以双光子可激发的香 豆素基团为荧光团，苯偶酰为荧光淬灭和H 2O 2的特异性识别基团设计了荧光探针[7]。该探针在H 2O 2的存在下，苯偶酰基团可以通过Baeyer-Villiger 反应转化为苯甲酸酐，然后苯甲酸酐水解得到苯甲酸，并释放荧光团。该探针成功运用单光子和双光子进行了实验，表现出对H 2O 2的选择性要高于其他活性氧分子，具有高灵敏度。运用单光子显微镜和双光子显微镜实现了其在MKN-45细胞中对H 2O 2的成像研究。Yoon 等以香豆素-半花菁染料为骨架，通过C —C 双键连接设计合成了荧光探针[8]。荧光探针中的双键被ONOO -氧化，大的共轭被阻断，从而导致ICT 过程被破坏，并成功应用于细胞中内源性和外源性ONOO -的检测。Zhao 课题组基于FRET 机理以香豆素-苯乙烯基-苯并噻吩为母核设计合成了靶向于线粒体基团的荧光探针[9]。并且该探针可靶向于细胞的 线粒体，成功应用于RAW264.7细胞中内源性和外源性ClO -的检测。Lin 等以苯并吡喃-香豆素为骨架设计合成了选择性检测ClO -的荧光探针[10]。次氯酸盐与该探针的α，β-不饱 和羰基发生反应导致π共轭体系中断从而产生香豆素基团的荧光性质，该探针具有低的细胞毒性及成功应用于Hela 细胞中次氯酸盐的荧光成像研究。3 硫醇化合物荧光探针硫醇类化合物与人类的生活、健康和疾病有着密切的联系。例如，半胱氨酸（Cys ）、高半胱氨酸（Hcy ）和谷胱甘肽（GSH ）等生物小分子硫醇在维持氧化还原稳定、生物催化、结合金属和翻译后的修饰中起着重要的作用[11]；硫化氢（H 2S ）是一氧化氮（NO ）和一氧化碳（CO ）之后的第三种气体信号分子[12]。在血管舒张、血管生成、细胞凋亡、炎症、神经调节和保护缺血再灌注的损伤等生理过程中起重要作用[13]。因此，在生理条件下硫醇化合物进行检测具有重要的意义。 Feng 等以香豆素-TCF 骨架为荧光团，丙烯酸酯为反应基团得到荧光探针[14]，在GSH/Hcy 存在下该探针也可特异性的检测Cys ，该探针的细胞毒性较低且成功用于对HeLa 细胞中 Cys 的检测和荧光成像研究。Guo 等设计了含有氯基团的香豆素-半花青素荧光探针[15]，该探针基于不同的发射波长来检测Cys 和GSH 。Zhang 等以N ，N-二乙基香豆素为荧光团，2，4-二硝基苯磺酰胺为苯硫酚的识别基团和荧光淬灭基团设计 合成了荧光探针10[16]。该结构可以阻断N ，N-二乙氨基的扭曲来增加荧光团的荧光。 4 其他类型荧光探针以香豆素衍生物为骨架的荧光探针在N 2H 4、H +、溶剂极性及金属离子等检测方面也被广泛应用。Y u 等设计了第一个用于 实时监测线粒体pH 的比率型型荧光探针[17]。该探针的酚羟基 是一个pH 敏感的基团，在酸性或中性条件下，羟基是弱的供 电子基团；在碱性条件下羟基去质子化得到O -，是强的供电子基团。因此，酚羟基的质子化和去质子化可导致发射波长的变化。5 结语 以香豆素为骨架的基团作为荧光探针中最优的荧光团之 一，具有荧光强度高、溶解性与细胞渗透性好、易于合成与 修饰、好的荧光量子产率和好的光稳定性。荧光探针对基础 生物学研究以及对疾病的诊断和治疗都具有重要的作用，为 “可视化”提供了可能，因此，对荧光探针的研究受到了越来越多的关注。然而，在荧光探针的研究中也面临着更多的挑战。首先，开发真正高选择性和敏感性的探针仍具有挑战性，例如，摘 要：香豆素类化合物不仅具有广发的生物活性，同时香豆素类化合物具有荧光强度高、溶解性和细胞渗透性好及易于合成的优点。因此，香豆素类化合物也是优良的荧光团之一。综述了近几年利用香豆素片段为荧光团，对待测物进行荧光成像研究的荧光探针，同时对这些荧光探针的设计、机理及特点进行了概述。 关键词：香豆素；荧光探针；荧光成像 中图分类号：O631.3 文献标志码：A 文章编号：1003–6490（2018）06–0204–02 Research Progress of Coumarin Fluorescent Probes Qiu Yang ，Wen Kai ，Wang Zheng-long ，Zhou Xiang Abstract ：Coumarin compounds not only have broad biological activity ，but also have the advantages of high fluorescence intensity ，good solubility and cell permeability ，and easy synthesis.Therefore ，coumarin compounds are also one of the excellent fluorophores.In this paper ，fluorescence probes for fluorescence imaging of analytes using coumarin fragments as fluorophores are reviewed.The design ，mechanism and characteristics of these fluorescent probes are summarized. Key words ：coumarin ；fluorescent probe ；fluorescence imaging 香豆素类荧光探针研究进展 邱?洋，温?锴，王郑龙，周?湘 （中国药科大学有机化学教研室，江苏南京?210009） 收稿日期：2018–04–10 作者简介： 邱洋（1992—），男，山东淄博人，硕士研究生，主要研 究方向为靶向抗肿瘤小分子药物的设计及合成。