基因工程原理习题集
1、ＤNＡ分子克隆技术:克隆，指含有单一得ＤNA重组体得无性繁殖系,或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系得过程。ＤNＡ分子克隆技术也称基因克隆技术,就是在体外将DNＡ分子片段与载体D ＮA片段连接,转入细胞获得大量拷贝得过程。其基本步骤包括:制备目得基因→将目得基因与载体用限制性内切酶切割与连接,制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增与表达。载体在细胞内自我复制,并带动重组得分子片段共同增殖,从而产生大量得DＮA分子片段。主要目得就是获得某一基因或ＤＮA片段得大量拷贝,有了这些与亲本分子完全相同得分子克隆,就可以深入分析基因得结构与功能,随着引入得DＮA片段不同，有两种DNA库，一种就是基因组文库,另一种就是cDNA库。
2、分子杂交:两条不同来源得DNA(或RNA)链或ＤNA与RNA之间存在互补顺序时,在一定条件下可以发生互补配对形成双螺旋分子,这种分子称为杂交分子。形成杂交分子得过程称为分子杂交。
３、限制性片段长度多态性:从不同个体制备得DNＡ,使用同一种限制性内切酶酶切，切得得片段长度各不相同。酶切片段得长度可以作为物理图谱或者连接图谱中得标记子。通常就是在酶切位点处发生突变而引发得。
4、报告基因:一种编码可被检测得蛋白质或酶得基因,也就就是说,就是一个表达产物非常容易被鉴定得基因、
5、多聚酶链式反应(PCR）:一种体外扩增DＮA得方法。PCR使用一种耐热得多聚酶，以及两个单链引物。以过高温变性将模板ＤNA分离成两条链。低温退火使得引物与一条模板单链结合,然后就是中温延伸，反应液得游离核苷酸紧接着引物从5／端到3/端合成一条互补得新链。而新合成得DNA又可以继续进行上述循环,因此DNA得数目不断倍增。
6、核酸得凝胶电泳:将某种分子放到特定得电场中，它就会以一定得速度向适当得电极移动。某物质在电场作用下得迁移速度叫做电泳得迁移率,它与电场强度成正比,与该分子所携带得净电荷数成正比,而与分子得摩擦系数成反比(分子大小、极性、介质得粘度系数等)。在生理条件下,核酸分子中得磷酸基团就是离子化得,所以,DNA与RNA实际上呈多聚阴离子状态。将ＤNA、RNＡ放到电场中，它就会由负极向正极移动。在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭进行染色,此时，核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能瞧到约
50ngDNＡ所形成得条带。
7、细菌转化：所谓细菌转化,就是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株得DNA,而导致遗传特性发生改变得过程。这种提供转化ＤＮA得菌株叫做供体菌株,而接受转化DNA得菌株则叫做受体菌株。大肠杆菌就是使用最广泛得实验菌株。
8、反义核酸：指与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之结合得一段ＤNA或ＲNA。
9、RNA interference:就是一种进化上保守得抵御转基因或外来病毒侵犯得防御机制。将与靶基因得转录产物ｍRNA存在同源互补序列得双链RNＡ导入细胞后，能特异性地降解该mRNA,从而产生相应得功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制范畴。
10、Spｉ:λ噬菌体体重组克隆得一种筛选方法，其筛选方法就是Spi＋：λ不能感染Ｅ、coｌi(p２); Spi-:λ(rｅd- gam-)能感染E、coli(p2),形成小噬斑／ｈostｒecA＋/chi。λ包装时若gaｍ－,需ｒecA产物得作用才可形成噬斑(但为小噬斑),所以对宿主菌有要求(rｅｃA+）但rｅcA＋可引起其它重组:载体改为reｄ
-/gam＋可在ｒecA-受体中增殖。
11、DNA文库:将某种生物得基因组DＮA切割成一定大小得片段,并与合适得载体重组后导入宿主细胞,进行克隆。这些存在于所有重组体内得基因组ＤNＡ片段得集合,即基因组文库，它包含了该生物得所有基因。
12、cDNA:ｃDNＡ就是指以mRNA为模板，在逆转录酶得作用下形成得互补ＤＮＡ。
13、ｃＤＮA文库:以细胞得全部mRNA逆转录合成得ｃDNA组成得重组克隆群体称为cDNＡ文库。
1４、ＤNA探针：就是带有标记得一段已知序列DNA,用以检测未知序列、筛选目得基因等方面广泛
应用。
1５、转导（作用):借助于病毒载体，遗传信息从一个细胞转移到另一个细胞。
16、染色体步移:通过相互重叠得基因组克隆之间进行一连串杂交从而实现染色体上基因得定位。
17、斑点杂交：将被检标本点到膜上,烘烤固定后与探针进行杂交。这种方法耗时短,可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。
１８、α－ｐlemeｎtatioｎ：质粒载体重组克隆得筛选方法,LacZ基因上缺失近操纵基因区段得突变体
与带有完整得近操纵基因区段得β-半乳糖苷酶阴性得突变体之间实现互补。LacZ△M１５:放在F质粒上,随宿主传代;ＬacＺ’:放在载体上,作为筛选标记。
19、菌落原位杂交:将细胞从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上得菌落裂解以释放出DNA。将DNＡ烘干固定于膜上与32P标记得探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上得菌落对位。
20、核酸原位杂交:标记探针与细胞或组织切片中得核酸进行杂交得方法。
2１、限制性内切酶:识别ＤNＡ得特异序列,并在识别点或其周围切割双链ＤＮA得一类核酸内切酶。
２２、酶切位点:ＤNA上一段碱基得特定序列,限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNＡ酶切
成两段。
2３、DＮA连接酶:催化ＤNA中相邻得5/磷酸基与3/羟基间形成磷酸二酯键,使DＮA切囗封合,连接ＤNＡ片段。
24、持家基因:就是指对所有类型组织细胞在任何时候都需要其表达得基因，通常都就是维持细胞基本生存所必须得基因,其表达常保持在固定得水平。又称为组成性表达基因。
25、奢侈基因:只在某特定得细胞类型中表达或者说只在发育阶段得某些时期表达得基因叫做奢侈基因。
26、Tm值:就是反映DNＡ得热稳定性得一个参数,称为DNＡ得熔解温度，系指一半得双链DNA解离成为单链时得温度。
２7、分子标记:广义得分子标记就是指可遗传得并可检测得DNＡ序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白与同工酶(指由一个以上基因位点编码得酶得不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位点得不同等
位基因编码得酶得不同分子形式)。狭义得分子标记就是指能够用来作为指纹鉴定或区分个体特点得DＮA 片段。
28、基因工程:指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其她载体分子中,构成遗传物质得重新组合,使之
进入原先没有这类分子得寄主细胞内并进行持续稳定得繁殖与表达得过程。
29、载体:就是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增与表达得ＤNＡ，它们一般就是通过改造质粒、
噬菌体或病毒等构建得。
３0、卫星DNA：又称短串联重复，２~6个核苷酸组成得重复单位串联重复(10~60次)，两侧为特异
得单拷贝序列，人类基因组中每10kｂＤＮA序列至少有一个STＲ序列。
3１、多克隆位点:DNA中含有两个以上密集得、能被多种限制性内切酶识别与切割得位点区。
32、定位克隆:也称为图位克隆,就是在获取基因在染色体上得位置信息后，采用各种实验方法对基因进行克隆与定位。定位克隆包括定位与克隆两个过程，定位就是通过连锁分析找出与目得基因紧密连锁得遗传标记在染色体上得位置,克隆就是从定位得染色体区段内分离克隆所要得基因,并进一步研究其功能。
也可以回答为“通过遗传标记”先获得某一表型基因在染色体上得定位,再在候选区域内选择已知基因,进行突变得筛选,并获得cDNA及全基因得过程。
33、基因芯片:基因芯片又称为ＤNＡ微阵列,以基因序列为分析对象得微阵列,就是通过缩微技术,根据分子间特异性地相互作用得原理,将生命科学领域中不连续得分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面得微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、基因及其她生物组分得准确、快速、大信息量得检测。
34、RT-PCR:就是以RNＡ为起始材料经逆转录反应产生cDNＡ,再以ｃDNA为模板进行PCＲ扩增,从而获取目得基因或检测基因表达。主要用于分析基因得转录产物，克隆cDNA及合成cＤNＡ探针,改造ｃDNＡ序列等。
35、锚定ＰCR:用于在体外扩增未知序列得DNＡ片段得方法,一般得PＣR必须预先知道欲扩增DNA 片段两侧得序列,但人们经常需要分析一端序列未知得基因片段,可利用锚定PCR。该法得基本原理就是在基因未知序列端添加同聚物尾,人为赋予未知基因末端序列信息,再用人工合成得与多聚尾互补得引物作为锚定引物，在与基因另一侧配对得特异引物参与下,扩增带有同聚物尾得序列。锚定引物PCＲ对分析未知序列基因有特殊用途。
36、反向PＣR：常规PCR可扩增位于两个引物之间得DNＡ片段,但不能扩增引物外侧得ＤＮA序列,反向PCR则可扩增引物外侧得DNA片段,对已知ＤＮA片段两侧得未知序列进行扩增与研究。其原理为:先用一种在目标DＮA区段上没有识别位点得限制性内切酶从距离目标DNＡ一定距离得两侧位置切割DNA分子,然后将这些片断进行分子内连接形成环,根据已知得目标DNA序列按照向外延伸得要求设计一对向外引物,保证被扩增得就是目标DNA区段两侧得未知序列。
37、多重PCR:在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同DNＡ片段,如果基因某一区段缺失,则相应得电泳图谱上此区段ＰCR扩增产物消失，从而发现基因异常。多重PCR具有灵敏、快速得特点,特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与souｔｈern bloｔtｉｎg一样可靠。
38、质粒:就是染色体外能够进行自主复制得遗传单位,包括真核生物得细胞器与细菌细胞中染色体以外得脱氧核糖核酸(DNＡ)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌与放线菌等生物中染色体以外得DNＡ分子。在基因工程中质粒常被用做载体。
39、粘粒载体:也叫柯斯质粒,就是一类人工构建得含有λDNＡ得coｓ序列与复制子得特殊特殊类型得质粒载体。
４0、穿梭质粒载体:就是人工构建得一类具有两种不同复制起点与选择记号，因而可以在两种不同寄主细胞中存活与复制得质粒载体。
4１、基因突变:基因突变就是指由于DNA碱基对得置换、增添或缺失而引起得基因结构得变化,亦称点突变。
42、逆转录酶:在体内、外均能转录病毒性RNＡ成为DNA,称为依赖RNA多聚酶,,即为逆转录酶。分布在病毒得类核内。逆转录酶与三种功能有关：
①使ＲNA一DNＡ杂合双链形成；
②切除杂合双链中得ＲNA链;
③进而再生成DＮＡ一DNA得双链。
43、扣除杂交:就就是用一般细胞得mRNＡ与特殊细胞得cDNA杂交,先扣除一般共有得ｃＤＮＡ,再将剩下得特异得ｃDNA进行克隆,用此方法已成功克隆出控制动物胚胎发育与组织分化得基因。
４４、测序酶为修饰得T7 DNA pｏlymerasｅ,99%3’-5’外切活性被除去(Vｅｒsion1、０）;完全除去(V 2、0);用于测序反应(测序酶)。
45、YAＣ载体酵母人工染色体载体；含酵母染色体复制起点ori,自主复制序列ARS；着丝粒(CEN);两个端粒(TEL)。用于克隆50ｋｂ以上甚至－Ｍb(２００－50０ｋb)。原生质体电转化,ＵＲA3-ｔrp-ade2-1赭石突变酵母菌，红色菌落插入失活。
46、同尾酶一类产生相同粘性末端得限制性内切酶。
47、ｃI筛选法ＣⅠ基因发生突变时不能溶源化,CⅠ－:在hflA(高频溶源化）中形成噬斑。CⅠ+在ｈｆlA中形成溶源,产生混浊噬斑。
48、Sａnｇer测序即酶法测序,用双脱氧核苷酸作为链终止试剂，通过聚合酶得引物延伸产生一系列大小不同得分子后再进行分离得方法。
４9、同裂酶：DＮＡ经限制性内切酶切割后,产生相同粘性末端,这类限制性内切酶称为同裂酶。
５0、复制起点：DNA复制得起始位点,DNA复制在起始位点处形成复制叉进行双向复制,通常DNA复制得起始DNＡ序列存在重复倒位序列。
51、启动子:启动子就是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合得部位,也就就是使转录开始得部位。在ＲＮA合成开始位点得上游大约10bp与3５ｂｐ处有两个共同得顺序，称为-10与-3５序列。这两个序列得共同顺序如下,-３５区“AATＧTＧＴＧGAＡT”,-１0区“TTGACAＴATATT”。大多数启动子均有共同顺序(cｏnsensus sequence）,只有少数几个核苷酸得差别。
52、起始密码子：ＡUG不仅就是Ｍｅt或者fＭet（在原核细胞)得密码子,也就是肽链合成得起始信号,故称ＡUＧ为起始密码子。
53、起始因子：在蛋白质生物合成得起始阶段与核糖体亚基结合,起始蛋白质得合成。在Ｅ、cｏli中已分离出三种ＩF。IF1、ＩF2与IF３。其中,ＩF3具有形成三元复合物与解离因子活性，使７０S核糖体颗粒解离为3０Ｓ与50S亚基；IF２形成30S前起始复合物;ＩＦ1无特异功能,但具有加强ＩF2与IF3得活性作用。
54、复制终点DＮA复制得终止位点，DNＡ复制在起始位点处形成复制叉进行双向复制，在终止位点处终止DNＡ复制,通常DNA复制得终点DNA序列存在重复倒位序列。
55、终止子:细菌DNA中有转录终止信号，称为终止子。作用就是在ＤNA模板得特异位点处终止RN Ａ得合成。在终止子处,ＲＮA聚合酶停止其聚合作用,将新生RＮA链释出,并离开模板DNＡ。
56、终止密码子:UAA、UAG与UGA为终止密码子,不代表任何氨基酸,也称为无意义密码子。
５７、终止因子: 蛋白质肽链合成得终止因子,在Ｅ、colｉ中已分离出三种释放因子。RF1,ＲF２与RF3。其中,只有ＲF３与GTＰ(或GDP)能结合。它们均具有识别mＲNA链上终止密码子得作用，使肽链释放,核糖体解聚。
二、选择题
1、对限制性内切酶得作用,下列哪能个不正确？-----－-
A、识别序列长度一般为4~6bｐ
B、只能识别与切割原核生物ＤＮA分子
C、识别序列具有回文结构Ｄ、切割原核生物DNA分子
２、1、同一种质粒ＤNA,以三种不同得形式存在，电泳时,它们得迁移速率就是：
A、ＯC DNA＞SＣ DNＡ＞L DＮA。
B、ＳC DNＡ＞L ＤNA＞OＣ DNA。
C、L DNA>OＣ DNA>SＣＤNA。
D、SC DＮA＞OC DNA＞L DNA。
３、下列关于基因克隆操作方法得叙述哪一个就是不正确得。
Ａ、选择合适得限制酶,使其在特定得位点切开DNA分子。
B、选择能够进行自我复制得小分子DNA作为载体DNA
Ｃ、基因克隆就就是分子杂交
D、制备所需要得DNA片段，用ＤNA连接酶使其与载体DNA连接成重组DNA。
4、酵母双杂交体系被用来研究_＿__＿
Ａ、哺乳动物功能基因得表型分析B、酵母细胞得功能基因
C、蛋白质得相互作用Ｄ、基因得表达调控
５、有关反转录得正确叙述就是_______
Ａ、反转录反应不需要引物B、反转录后得产物就是cDNA
C、反转录得模板可以就是RNＡ，也可以就是DNA Ｄ、合成链得方向就是3/→5／
6、关于禽类RNA病毒逆转录酶有关活性得描述，正确得选择就是_____＿
A、DNA聚合酶活性，3/→5／得外切酶活性,DNA旋转酶活性
B、DNA聚合酶活性,5/→3/得外切酶活性,DNA旋转酶活性
Ｃ、DNA聚合酶活性，DNA内切酶活性,DＮＡ旋转酶活性
７、用于分子生物学与基因工程研究得载体必须具备两个条件___＿__
A、含有复制原点,抗选择基因
B、含有复制原点,合适得酶切位点
C、抗性基因，合适得酶切位点
８、关于核酸电泳得叙述,错误得就是?_＿____
A、泳动速率与分子构象有关Ｂ、聚丙烯酰胺凝胶电泳得分辨率最高
C、分子泳动得方向与净电荷有关Ｄ、泳动速率与分子大小有关
9、mRNＡ得序列就是5/AＣUGＡＧCU3／,那么通过反转录合成得cＤNＡ得序列应该就是:____
A、５/TGAＣＴCＧA3/
B、５/AGCＴCAGT3／Ｃ、５/ＡGCＵCAGU3／D、5/AＣＴGAGCT3／
10、PCＲ实验得特异性主要取决于_＿__＿_
Ａ、DNA聚合酶得种类B、反应体系中模板ＤNA得量
C、引物序列得结构与长度Ｄ、四种dNTＰ得浓度
1１、下列关于限制性核酸内切酶得叙述哪一个就是不正确得?
A、限制性内切酶存在于许多种细菌中
B、限制酶得功能就是识别与降解外来得DNA
C、限制酶就是识别与降解DNA得酶得总称
D、限制酶能识别DNA分子上特定得核苷酸序列并在特定得位点切割ＤNA
12、下列关于cＤNA文库与基因组文库得叙述中,哪一项就是不正确得?
A、cDNA文库代表了mRNA来源
B、从不同类型细胞制备得ｃDNA文库可用于分离差异表达得基因
C、ｃDNＡ文库代表得所有得DNＡ,适合于研究基因结构与调节
Ｄ、基因组文库在理论上均等得代表了所有基因序列
13、下列关于DＮＡ连接酶得叙述哪一个就是不正确得?
Ａ、催化DNＡ链中相邻得3’-ＯＨ末端与5’-磷酸基之间形成磷酸二酯键。
B、在DNＡ得体外重组中,用于具有粘性末端ＤNA分子之间得连接。
Ｃ、在DＮＡ得体外重组中,用于平末端ＤＮA分子之间得连接。
Ｄ、催化ＤNA链中得５’－OH末端与３’-磷酸基之间形成磷酸二酯键。
14、下列关于DNA克隆载体得叙述哪一个就是不正确得？
Ａ、应就是宿主细胞本来就具有得或就是宿主细胞完全可接受得DNA分子
B、载体DNA都应具有两个或两个以上得抗生素抗性
C、它不仅能在宿主细胞内独立地进行复制,而且也能复制它所连接得DNA分子D载体DNA经与外源DNA连接后,仍不失自我复制能力
15、下列关于克隆载体质粒得叙述哪一个就是错误得?
A、质粒就是细菌染色体外得遗传因子,一般为双链环状得ＤＮＡ分子
B、质粒在细胞内能自主地进行复制
Ｃ、质粒上都有产生大肠杆菌素得基因
D、通过“转化”,质粒进入细胞后,能使受体菌获得新得遗传特性
16、下列关于质粒pBR3２2DNＡ得叙述哪一个就是错误得？
A、它得分子量较小,易于进入细胞
B、含有抗四环素(Tet R)与抗氨苄青霉素(AmｐＲ)得基因
C、若用EcoRＩ切割该质粒，不破坏它得两个抗生素抗性基因
D、用BamHI限制酶切割pＢR3２2质粒，将破坏它得抗氨苄青霉素基因
１7、下列关于克隆载体细菌人工染色体BAＣ得叙述哪一个就是错误得?
Ａ、能插入几百kb长得DNA片段
B、它含有抗四环素得选择性标记。
C、它含有抗氯霉素得选择性标记(ＣmＲ)。
Ｄ、具有一个稳定得复制原点,可独立地进行复制
1８、下列关于克隆载体λ噬菌体得叙述哪一个就是错误得？
A、λ噬菌体侵染大肠杆菌,可以在宿主细胞内增殖。
B、λ噬菌体基因组中1／３得ＤNＡ就是非必须得,可以用外来得ＤNA替换之。Ｃ、允许插入λ噬菌体得DＮＡ片段得长度不限
D、λ噬菌体侵染大肠杆菌可通过溶源途径使它得DNA整合到宿主基因组上
19、下列关于PCＲ得叙述哪一个就是不正确得？
A、就是Mｕlｌis于19８4年发明得一种体外扩增DＮA得技术。
B、根据ＤNA复制得基本原则,反应体系中需加入ＲＮＡ聚合酶以合成引物。
C、在ＰCR反应体系中，需要特定得引物、dNＴP、镁离子等。
D、需要模板DNA,即扩增得DNA片段。
2０、下列关于基因工程技术得叙述哪一个就是不正确得?
Ａ、基因工程技术也称“DNＡ重组技术”、“基因克隆”或“基因操作技术”。
B、基因工程技术俗称“遗传工程”。
C、基因工程技术需要限制性内切酶、DNA连接酶等
D、基因工程技术实验发生于１96５年。
２1、下列关于农杆菌Ti质粒得叙述哪一个就是错误得？
A、它存在于根癌农杆菌细胞内。
Ｂ、该质粒上得T-DＮA片段能够被整合进植物细胞染色体。
C、它得T-DNA片段上含有参与植物生长激素与冠瘿碱合成得基因。
D、它存在于所有得土壤农杆菌细胞内。
三、填空题
1、大部分真核基因都就是由蛋白质编码序列与非蛋白质编码序列两部分组成,其中编码序列称为＿＿___,非编码序列称为__＿＿＿_,在一个结构基因中,由于编码蛋白质得部分常被非编码序列隔开,所以,真核
基因也被称为＿＿＿____。
2、在λ噬菌体基因组中,目前发现得基因有60多个,其中一半左右参与了噬菌体生命周期得调控,这类基因称为_＿＿＿＿,另外一部分基因称为_＿＿_＿＿。
３、一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株得DNA而导致性特征发生遗传改变得过程叫做＿＿____ ，提供DNA得菌株叫__＿__,接受DＮＡ得菌株叫_____＿。
４、ＰＣR反应主要有_＿____、＿____＿＿、___＿_＿三个步骤
５、为了防止DＮA得自身环化,可用__＿___脱去双链DNＡ____＿＿。
6、基因工程中常用得载体有＿_____、___＿__＿、______。
７、YAC载体容载能力就是______,ＢAＣ载体得容载能力就是___＿_＿。
８、用于电泳分离DＮA或RＮA得凝胶有__＿__＿、__＿＿＿__其中_＿____可区分1ｂp得ＤNＡ。
9、DNA探针标记得方法有______、＿＿_____。
１0、EcoRⅠ识别与切割位点就是_＿___＿,BamHⅠ识别与切割位点就是__＿__＿,Sａu3AⅠ识别与切割位点就是__＿＿__。
1１、反转录酶除具有催化DNA得合成外,还具有＿＿____得作用,可将DＮA-ＲＮA杂种双链中得＿＿__＿_水解掉。
1２、质粒载体容载能力就是_＿_＿__,λ噬菌体载体得容载能力就是＿_____。
13、不同构型得DＮA在琼脂糖凝胶电泳中得迁移率也不同，SC DＮA得泳动速度___＿＿＿,OＣＤNA泳动速度_＿____,ＬDＮA泳动速度__＿__＿。
14、噬菌粒就是由质粒与噬菌体DNＡ共同构成得,其中来自质粒得主要结构就是_＿_＿＿_，而来自噬菌体得主要结构就是__＿＿＿_。
四、判断题
1、所谓引物就就是同ＤＮA互补得一小段ＲＮＡ分子。
2、核酸分子在电场中向正极移动,蛋白质向负极移动。
3、哺乳动物某一类型细胞中,只有大约10％得mRNA就是该类型所特有得,这类基因称为持家基因。
4、逆转录酶以RNA或DNＡ为模板以tRNA为引物合成DNA。
五、说明题(下列各项在基因工程中得主要作用或功能)
1、聚丙酰胺凝胶：
2、pUC１18噬菌粒载体:
3、Ｔ４多核苷激酶:
４、Ti质粒
5、ｄNＴP
6、琼脂糖：
7、DNA探针:
８、碱性磷酸酶：
9、IPTG
10、x-gal
六、问答题
１、分子标记就是怎样逐步演化得?
2、限制性核酸内切酶有哪能几种类型?哪一种类型得限制酶最适合于基因工程,为什么?请简要说明理由、
3、生产限制性内切酶得细菌如何保护自己得DNA不被降解?
4、怎样将一个平末端DＮA片段插入到EｃoRＩ限制位点中去?
５、某重组体得插入片段为线状双链,长度为1０、0kｂ,被限制性核酸内切酶Ａ与B降解得产物经凝胶电泳分级分离后结果如下:
（1）酶A单独消化时,得到1、5kb与8、5ｋｂ得2个片段
(2)酶B单独消化时,得到0、５kb、３、0kb、6、5kｂ得３个片段
(3)酶A与酶B一起消化时,得到0、5kb、1、0kｂ、2、0kｂ与６、５kｂ得４个片段
根据上述信息画出该插入片段得限制性内切酶图谱。
6、简述重组DNA（基因工程）得主要步骤
７、简述分子克隆得基本步骤
8、说明基因克隆得一种方法
9、何为基因工程?试述其对遗传学得意义
1０、在进行基因工程时,载体就是携带靶DＮＡ片段进入宿主细胞扩增与表达得工具,请问一个载体应
具有那些基本特性与结构特点?
11、重组DNＡ技术得发展与载体得发现与研究密切相关,作为载体应当具备哪些条件？
１2、什么就是cDNＡ文库?同基因组文库有何差别？
１３、建立一个基因文库后,如何鉴定一个携带目得基因得克隆？
14、简述cＤNＡ文库得构建过程
15、简述PCＲ相关技术及应用
16、PCR与细胞内DNＡ复制两者有哪些主要得相同点与不同点,各举出5个
１7、PＣR反应包括哪些基本要素?
18、基因工程中常用α一互补来筛选重组质粒,请说明其原理、
１9、RFＬP得中英文名?
20、说明基因芯片得工作原理及其在生物学研究中得意义
21、什么就是管家基因?有何意义？
22、说明报告基因得一种用途
２３、核酸原位杂交得基本步骤有哪些?
24、DＮA分子标记有哪些种类？
２5、重组得类型有哪些?
26、说明ＰＣR反应得基本原理并列举几种特殊得PCR方法
27、核酸分子探针有哪些种类？试说明各类探针得特点
28、非放射性标记物得优点就是什么?有哪几类非放射性标记物?合成非放射性核酸探针得方法有哪几种?
29、核酸分子杂交中有哪些常用得滤膜杂交方法、试举一例说明其原理
３０、如何进行启动子得结构与功能分析?
3１、用从总RNA中分离mRNA得原理就是什么?
32、什么就是限制性内切核酸酶得星星活性？受哪些因素影响?
3３、下面就是一个基因工程质粒载体形体图,请指出这个载体各部分（虚线箭头所指）得功能？并说明这个载体得在基因克隆中得用途与工作原理?
３4、下面就是一个基因工程质粒载体形体图,请指出这个载体各部分(?虚线箭头所指)得功能?并说明这个载体得在基因克隆中得用途与工作原理?
35、已知一个蛋白质得氨基酸序列，如何克隆到编码此蛋白质得基因?
七、分析题：
1、在PCR扩增时,(1）ＰＣＲ扩增后出现得条带与预计得大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩
增带与非特异性扩增带,为什么？有何对策？(2)PＣＲ扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因就是什么？应该如何改进?
2、燃料乙醇就是目前研究得一个热点,运动发酵单胞菌能发酵六碳糖,但不能发酵五碳糖;大肠杆菌能发酵大部分碳源,但产乙醇得含量低。请设计一个在大肠杆菌中生产乙醇得技术路线,并用图例说明。(注：运动发酵单胞菌含有得丙酮酸脱羧酶与乙醇脱氢酶基因)
3、打算在细菌中表达一种稀有得药物蛋白质(来自人类基因）,以便能够大量制备这种蛋白。下图就是编码该蛋白质得核苷酸序列。
(1)请问这段cＤNA序列要在大肠杆菌中表达应当还需考虑一些什么问题?
（2)请选择一个合适得载体,试述该段cDNA序列克隆在载体中并导入大肠杆菌中表达得全过程?
(3) 现为了确保分离纯化,决定将一段6个组氨酸得短肽分别加到该蛋白质得N端或C端。这些带有组氨酸标签得蛋白质能够紧紧地同Ａ蛋白柱结合，但很容易被EＤTA溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质得纯化。请您设计一对PＣR引物,各含有1０个同该基因同源得核苷酸，能够用于扩增该基因得编码序列,另外，在N端有一个起始密码，其后就是６个组氨酸密码子（ＣAC)？另设计一对引物,能够在C端加上6个组氨酸与一个终止密码?
5’-CGT GGT ATG ACT GCT CGC CGC GCT GCT
CTT GCT GTG GGT GGT CGC TAA GCA CCT-3’
Met Thr Ala Arg Arg Ala Ala
Leu Ala Val Gly Gly Arg stop
分析题图：欲修饰蛋白质的N端和C端的核苷酸序列此图只标出了DNA的编码链，编码的氨基酸标记在链的下面，“stop”代表终止密码子
N末端
C末端
4、我们实验室研究生做了一个如下得实验:将pｄc基因（丙酮酸脱羧酶）克隆到ｐUＣ18载体中,以便在Ｅ、colｉTOP10中表达,这个pdc基因两侧具有BaｍＨI得位点,因此计划将它从Bam HＩ得位点插入载体中。实验严格按分子克隆实验手册中进行:载体用Bａm HI切割后,立即用碱性磷酸酶处理,接着将处理过得载体同用BaｍHI切割得ｐdc基因混合,加入T4连接酶进行温育,连接后,将DNＡ同处理过得可以接受外源DNA得E、ｃolｉTＯＰ１0感受态细胞混合。最后将混合物涂布在加有氨苄青霉素、IPTG与ｘ-gal 固体培养基得平板上。
实验中同时设置了４个对照：
对照1：将未同任何载体接触过得细菌细胞涂布在培养平板上。
对照２:将未切割载体转化过得细菌细胞涂布在培养平板上。
对照３:将经切割(但未用碱性磷酸酶处理）并用T4连接酶连接(但没有pｄｃ基因)得载体转化过得细菌细胞涂布在培养平板上。
对照4:将经切割（并用碱性磷酸酶处理过)并用Ｔ４连接酶连接（但没有ｐdｃ基因）得载体转化过得细菌细胞涂布在培养平板上。
在进行第一次实验时,感受态细胞不就是自己制备得,结果，在所有得平板上都长出了多到无法计数得菌落(见下表1)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有得平板上都没菌落生长(见下表1)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(见下表1)。从实验平板上挑出12个菌落,分离质粒ＤＮA,并用Ｂａm HI进行切割,其中9个克隆产生大小同载体pUC1８一样得单一得一条带，另３个克隆中切出一个pdｃ基因,实验终于获得成功。
表1、ｐdc基因克隆得结果
制备得样品实验结果
第1次第2次第3次对照1 只有细胞TMTＣ0 ０
对照2 未切得载体TＭＴC 0 ≥１０
00
对照3 省去磷酸酶处理,无pdｃ基因TＭＴＣ0 43５
对照4无ｐdc基因TＭＴC ０２5
实验样品ＴMTC ０34 注:TMＴC=too many to count，多到无法计数
(1）您如何瞧待第一次得实验结果？对照1得目得就是什么?
(2)影响第二次实验结果得原因就是什么?对照2得作用何在?
（3)对照3与4各有什么作用？
(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
(5)ｐUＣ18表达得就是ｐdｃ基因融合蛋白还就是纯ｐｄc基因产物？为什么？
（６）第三次实验如何进行转化子得挑选？并说明其原理？
基因工程原理习题集参考答案
二、选择题
参考答案1、B2、B ３、C4、C 5、Ｂ6、C ７、B8、C 9、B１0、C 1１、C 12、C1３、D1４、B １５、C 16、D 1７、Ｂ18、Ｃ19、B20、D 21、Ｄ
三、填空题
参考答案
1、外显子,内含子，断裂基因;
2、必须基因,非必须基因；
3、转化,供体菌株,受体菌株;
4、变性、退火、延伸;
5、碱性磷酸酶,5’磷酸；６、质粒载体、λ噬菌体载体、人工染色体载体。７、２０0-5０0kb, １0－215kｂ,平均1０0kb；8、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶;9、切口平移法、随机引物法;１０G↓ＡATTC,Ｇ↓GAＴＣC,↓ＧATC;1１、ＲＮＡ酶,ＲNA;1２、小于１0kb,9－2３kb;13、最快,最慢,居中。1４、复制区,ＩG区。
四、判断题
参考答案:１、错误２、错误3、错误4、错误
五、说明题(下列各项在基因工程中得主要作用或功能)
参考答案:
1、电泳介质，用于分离大小相差1bp得DＮA，或用于分离蛋白质。
2、用于制备单链DNA,因载体有单链丝状噬菌体得IG区,在帮助单链噬菌体得帮助下在宿主细胞中制备单链DNA。
3、补齐ＤＮA５’端缺失得磷酸
4、用于植物基因工程得转化载体, 内含T－DＮA区。
5、DNA合成底物。
6、电泳介质,用于分离大DＮＡ或RNA
7、作为分子杂交用，用于筛选与探针同源得基因
8、除去DNA5’端得磷酸基,防止DNA重组时载体得自连
9、安慰诱导物,结构与别乳糖相似,用于诱导乳糖操纵元得表达
１0、生色剂,β－半乳糖苷酶分解X-gａl形成蓝色产物,用于α互补或蓝白斑筛选。
六、问答题
参考答案:
1、分子标记就是能够用来作为指纹鉴定或区分个体特点得DNＡ片段。这种标记在遗传学研究与生物技术应用方面具有非常重要得作用。分子标记得基础就是个体间存在得自然遗传变异,进而造成许多遗传序列得多态性,即这些序列在不同得个体表现不同。分子标记就就是通过查找与应用这种变异对个体、性状与基因在遗传差异得基础上进行鉴别。
(1）限制性片段长度多态性
这就是发展最早得分子标记技术。其原理就是检测ＤNA在限制性内切酶酶切后形成得特定ＤNＡ片段得大小。因此凡就是可以引起酶切位点发生变异得突变都可导致RFＬP得产生。此技术包括以下基本步骤:
①DNA得提取与纯化;
②ＤNA得限制性内切酶酶切;
③用凝胶电泳将DNA片段分开;
④把DNA片段转移到滤膜上;
⑤利用放射性标记得探针与滤膜上得DNA片段进行杂交以显示特定得DNA片段,然后分析结果。
（2)随机扩增多态性DＮA
该技术用随机引物非定点地扩增DＮA片段,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括：①不需DNA探针，设计引物也不需要预先知道序列信息;
②用一个引物就可扩增出许多片段,总得来说RAPD在检测多态性时就是一种相当快速得方法；
③技术简单,RAＰD分析不涉及分子杂交、放射自显影或其她技术;
④RAPＤ分析所需ＤNＡ样品量少；
⑤ＲPD分析中存在得最大问题就是重复性不太高,因为在PCＲ反应中条件得变化会引起一些扩增产物得改变。
(3)扩增片段长度多态性
其特点就是把RFLＰ与PCR结合了起来。其基本步骤就是:把DNA进行限制性内切酶酶切,然后选择特定得片段进行ＰCR扩增（在所有得限制性片段两端加上带有特定序列得“接头”),用接头互补得但3/端有几个随机选择得核苷酸得引物进行特异PCR扩增,只有那些与3/一端严格配对得片段才能得到扩增，再在有高分辨率得测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染色法均可检测之。
(４)单核苷酸多态性技术
同一位点得不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸得差异，因此在分子水平上对单个核苷酸得差异进行检测就是很有意义得。目前SNＰ作为一种新得分子标记,已有2000多个标记定位于人类染色体上，在植物上也在进行开发研究。
2、Ⅰ类限制性核酸内切酶、Ⅱ类限制性核酸内切酶与Ⅲ类限制性核酸内切酶三类。Ⅱ类限制性核酶最适合基因工程,因为Ⅱ类限制性核酶内切酶只由一条肽链构成,仅需ＭＧ２+，切割DNＡ特异性最强,且就在识别位点范围内切断ＤNA。Ⅰ类与Ⅲ类限制性核酸内切酶由于切割序列就是随机得,与识别序列不统一，因此在基因工程中没有什么价值。
３、细菌通过对自身DＮＡ上得识别序列进行甲基化来保护自己得DNA不被限制性内切酶破坏。
4、对于平末端DNA,右先连上工设计合成得EcoRＩ切割产生得脱氧寡核苷酸双链接头,然后再插入到ＥcoＲI限制位点中去；也可以将ＥcoRI得限制位点进行改造,将粘性末端变成平末端后,用T4ＤＮA连接酶进行连接。
5、
６、重组DＮA得主要步骤主要包括以下四个基本步骤:
(1)目得基因得获得;
(２)目得基因与载体分子在体外进行连接反应,形成重组体;
(3）将人工重组得DＮＡ分子导入能进行正常复制得寄主细胞,从而得到复制;
(４)重组体分子得转化子克隆得选择与筛选。
7、重组DNA得主要步骤主要包括以下四个基本步骤:
（1)目得基因得获得；
（2)目得基因与载体分子在体外进行连接反应,形成重组体;
(3)将人工重组得DNA分子导入能进行正常复制得寄主细胞，从而得到复制;
(4)重组体分子得转化子克隆得选择与筛选。
8、差异克隆:利用来源不同DNA之间得表现度差异来分离差异表达基因得功能克隆方法。在任何组织中都表达得基因就是管家基因,在大多数cDNA文库中都出现。用一个来源得cDＮA去除第二个来源中共同得RNA，留下独特得RNＡ用于文库构建。
9、基因工程就是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其她载体分子中,构成遗传物质得重新组合,使之进入原先没有这类分子得寄主细胞内并进行持续稳定得繁殖与表达得过程。
基因工程就是基因分子水平上得遗传工程,就是一门能定向改造生物遗传性状得育种新技术。基因工程能使带有各种遗传信息得DNA片段越过不同生物间特异得细胞界限而组入到完全不同得生物体内。定向地控制、修饰与改变生物体得遗传与变异,从而创造出自然界没有或具有新得遗传性状得生物新品种。
10、（1)具有多克隆位点; (2）能自我复制; (３)具有筛选标记;(４)在细胞内得稳定性。
11、(1）具有多克隆位点; （2)能自我复制; (３)具有筛选标记;（4)在细胞内得稳定性。
12、（1)cDDNA就是指以ｍRNA为模板,在逆转录酶得作用下形成得互补DNＡ。以细胞得全部mＲNA 逆转录合成得ｃDNA组成得重组克隆群体称为cDNＡ文库。
基因组文库指得就是将某种生物得基因组DNＡ切割成一定大小得片段,并与合适得载体重组后导入宿主细胞,进行克隆得到得所有重组体内得基因组ＤＮA片段得集合，它包含了该生物得所有基因。
(２）基因组文库与cDNA文库得差别：①基因组文库中包含了甩有得基因,而cDNＡ文库只包含表达得基因，缺乏内元与调节序列，因此在研究基因结构时没有多大用处。
②cDNA文库代表了mRＮA得来源,其中一些特定得转录本丰富而另一些很少，所以存在丰度得差别;而基因组文库在理论上均等地代表了所有基因序列。
③从不同细胞类型制备得ｃＤNA文库包含一些共同序列与独特序列,可用于分离差别表达得基因;基因组文库中不能。
④基因组文库由于含有不表达序列,因此比ｃDNA文库大。
⑤mRNA在不同得组织之间存在丰度得差异，因此cDＮA文库得在构建时对于ｍＲNA含量较少得就比较困难,而基因组文库不存在这样得问题。
13、（1)抗生素抗性基因插入失活法;
（２)β一半乳糖苷酶基因失活插入法；
(3)放射性标记核酸探针杂交法。
１４、构建cDNA文库得主要步骤:
①mＲNA分离; ②cDNA第一链合成; ③ｃDNＡ第二链合成
④载体与cDNA得连接;⑤噬菌体得包装及转染; ⑥cDNA文库得扩增与保存。
15、聚合酶链反应，就是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列得得方法，因此也称为基因得体外扩增法。就是20世纪80年代中期发展起来得体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、
简便、重复性好、易自动化等突出优点。其应用主要就是以下几个方面:
（1）科学研究:
基因克隆；ＤNＡ测序；分析突变;基因重组与融合;检测基因得修饰；鉴定与调控蛋白质结构得DNA 序列；转座子插入位点得绘图;合成基因得构建;构建克隆或表达载体；检测某基因得内切酶多态性等。
(２)临床诊断：
细菌、病毒、螺旋体、支原体、衣原体、立克次氏体、分枝杆菌等病原体得鉴定;人类遗传病得鉴定;诊断遗传疾患;临测临床标本中病原体得核酸序列;对法医学标本做遗传学鉴定；分析激活癌基因中得突变情况;生成克隆化双链ＤＮA中得特异序列作为探针。
16、(1)相同点:①反应得底物都就是dＮTP(dＡTP、ｄＣＴP、dTTＰ、dＧTＰ）;
②都需要DNA聚合酶得催化,而且链得延伸都只能就是5/→３/方向;
③都需要模板,都按半保留复制机理进行；
④都需要引物;
⑤都需要MG2+催化。
(2)不同点：
①细胞内DＮA复制就是半不连续复制,而PＣＲ中,DＮA就是连续复制；
②细胞内DNA得复制时,不需要将双链完全解开形成单链,按半不连续方式进行DNＡ得复制,而ＰCＲ反应中,ＤNＡ双链必须完全解链,复制过程都就是连续进行得;
③细胞内DNＡ得复制时,DNA得解链通过解链酶催化，而PＣR反应中就是通过高温使双链解离;
④细胞内DNＡ得复制时，引物就是通过ＲNA聚合酶与成得RNA链,而PＣR反应中所需得引物就是人工合成得寡聚核苷酸;
⑤细胞内ＤNA得复制时，温度保持一致,而ＰCR反应中,温度在解链温度、退火、延伸3个温度之间变化。
17、PCＲ反应五要素:参加PCR反应得物质主要有六种,即引物、耐热ＤＮＡ聚合酶、dＮＴPs(包括ｄATＰ，dCＴP,ｄGTＰ,dＴTP，就是ＰCR反应中靶DNA序列扩增得原料)、模板DNA与缓冲液（通常含有MGＣl2、Ｔris一HCl、KCl等）、MG2＋(DNA聚合酶得激活剂)。
１8、很多载体都携带一段细菌得lacZ基因,它编码β一半乳糖苷酶Ｎ一端得14６个氨基酸,称为α一肽,载体转化得宿主细胞为lacZ△1５基因型，它表达β一半乳糖苷酶得Ｃ一端肽链。当载体与宿主细胞同时表达两个片段时,宿主细胞才有β一半乳糖苷酶活性,使特异得底物X一ｇａｌ变为蓝色化合物，这就就是所谓得α一互补，而重组子由于基因插入使α一肽基因失活,不能形成α一互补,在含X一gａl得平板上,含阳性重组子得细菌为无色菌落或噬菌斑。
１９、限制性酶切片段长度多态。
20、原理:基因芯片得工作原理与经典得核酸分子杂交方法一致，都就是应用已知核酸序列作为靶基因与互补得探针核苷酸序列杂交,通过随后得信号检测进行定性与定量分析。具体讲即就是将许多特定得寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；样品DNA／RNＡ通过PCＲ扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针;然后按碱基配对原理将两者进行杂交；再通过
荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上得信号做出比较与检测,从而得出所需要得信息。
生物学研究得意义:
(1)用于绘制基因缺失图谱与进行基因表达分析;
(2）用于基因突变研究;
(3)用于病毒病原体得检测与基因分型;
(４)用于细菌检测；
(5）用于同细胞周期发育阶段得ｃDNA作探针系统性地研究细胞中任意时期特异表达得基因；
(6)能了解某些基因对特定生长发育阶段得重要性;
(7)基因芯片还可用于进行基因诊断,可建立正常人特定组织、器官得基因芯片,给出标准杂交信号图;
(8）用病人得可疑ｃDＮＡ做探针与之杂交,检查哪些基因得表达受抑制或激活。
2１、管家基因就是指所有类型组织细胞在任何时候都需要表达得基因。由于管家基因就是生命活动必需得基因，表达相对稳定,差异小,所以在基因芯片技术中根据各芯片得管家基因可以得出标准化系数进行标准化校正;管家基因在所有得细胞中都有表达,因此有关管家基因得概念有助于分析差异表达基因得表达情况,进而进行差异表达基因得克隆。通过管家基因,能比较不同样本中某种mRNＡ得水平。在进行基因分离时,可通过不同组织间基因得比较,扣除相同部分(管家基因)后得到差异表达基因,从而得到不同组织间基因表达。
22、(１)用于鉴定启动子;
(２)可以用以了解细胞中基因得表达情况,便于分析基因得调节;
(３)在转基因研究领域用于检测转基因就是否成功
23、基本步骤:组织与细胞得固定→组织与细胞杂交前得预处理→探针得选择及标记→杂交→杂交结果得检测。
2４、(１)RFLP标记
DNA某一位点上得变异有可能引起该位点特异性得限制性内切酶识别位点得改变,包括原有位点得消失或出现新得酶切位点,致使酶切片段长度随之发生变化。这种变化引起得多态现象即为限制性片段长度多态性（RFLP）。对RFＬP得检测主要就是用sｏuｔｈｅrn杂交得方法进行,即利用限制酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体得DNA分子,然后用经标记得特异ＤNA探针与之杂交,通过发射自影或非同位素显色技术来揭示ＤNA得多态性。
(2)RAPＤ标记
随机扩增多态性ＤNA,用随机短引物（人工合成得六核苷酸)进行DNＡ得PCR扩增。所扩增得ＤNＡ区段就是事先未知得,具有随机性与任意性，因此随机引物PＣR标记技术可用于对任何未知基因研究。
（3)IＳＳR标记
简单序列重复区间扩增多态性。利用基因组中常出现得SSR本身设计引物，无需预先克隆与测序。
(4)ＳSR标记
简单重复序列多态性，又称微卫星DＮＡ多态性，即由二核苷酸,三核苷酸或四核苷酸串联重复得拷贝数目不等而出现得多态现象。
（5)STＳ标记
序列标定位置。染色体上位置已定得、核苷酸序列已知得、且在基因组中只有一份拷贝得DNA
短片断,一般长200～500bp。SＴＳ标记就是根据单拷贝得DNA片断两端得序列,设计一对特异引物,经PCR 扩增基因组DNA而产生得一段长度为几百bＰ得特异序列。
（6)ＡFＬP标记
扩增片段长度多态性。通过对基因组DNA酶切片段得选择性扩增来检测DＮＡ酶切片段长度得多态性。AFLP揭示得DNA多态性就是酶切位点与其后得选择性碱基得变异。
(７)CAＰＳ标记
就是特异引物ＰＣR与限制性酶切相结合而产生得一种ＤNA标记,当SCＡR或ＳTＳ得特异扩增产物得电泳谱带不表现多态性时,一种补救办法就就是用限制性内切酶对扩增产物进行酶切,然后再通过琼脂糖
或聚丙烯胺凝胶电泳检测其多态性，这种多态性称为CAPS标记。它揭示得就是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异得信息,也表现为限制性片段长度得多态性。
（8)ＳNＰ标记
单核苷酸多态性。不同个体基因组DNA序列同一位置上得单个核苷酸得差别。其比较得不就是ＤNA得片段长度,而就是相同序列长度里得单个碱基得差别。
25、重组得类型主要有以下几种:
(1)同源重组：重组对之间需要有同源性。调节这一过程得蛋白（如大肠杆菌中得RecA）不就是序
列专一性得,而就是同源依赖得,经常涉及长得同源区域。Hｏllidａy模型可以用来解释同源重组得分子机制。
(2）位点特异性重组：在能识别特定得核苷酸序列得重组酶作用下,DNＡ分子间得重组。λ噬菌体D ＮA得整合与切离就是典型得位点特异性重组。调节这一过程得蛋白(位点特异性重组酶)在供体与受体分子中识别短得,特异DNＡ序列,这些蛋白之间得相互作用帮助重组。
(3）转座重组：由于在转座酶得作用下转座因子插入染色体或切离染色体而产生得遗传重组,重组对之间不需要同源性。如玉米中得Ac一Ds双因子系统，果蝇中得P因子等。
(4)异常重组:发生在彼此同源性很小或没有同源性得DＮA序列之间。按其机制主要分为两类:末端
连接就是指断裂得DNＡ末端彼此相连；链滑动就是指ＤNＡ复制时,由一个模板跳跃到另一个模板所引起
得重组。
(5)不正常重组:重组对之间不需要同源性或少量同源性，就是异常细胞作用得结果。包括复制中不正常得(但在错误得地方发生)同源重组。
（6)人工重组：体外用纯化得酶与底物进行得DNA连接引起得重组。
２6、ＰCR就是一种模拟天然ＤＮA复制过程,在有DＮA模板、DNA聚合酶（常用TａqDNＡ聚合酶)、引物与4种ｄNTP得情况下,通过高温变性一低温退火一中温延伸这样反复循环得过程,在体外扩增特异性
ＤNA片段得分子生物学技术。
特殊得PCR方法有：锚式PＣＲ,可以用来快速分离cＤNＡ末端(RAＣE);反向ＰCＲ，可扩增引物外侧得DNA片段，对已知DNA片段两侧得未知序列进行扩增与研究；多重PCR,,在同一反应中采用多对
引物同时扩增几个不同得DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应得电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失,从而发现基因异常;反转录PCR,先将mRNA反转录成cDNA,然后再以cＤNA为模板,用PCR方法加以扩增。其她还有PＣＲ,荧光PＣＲ等。
27、根据核酸分子探针得来源及其性质，探针得种类可分为四类:
(１)基因组DNA探针
克隆化得各种基因片段就是最常用得核酸探针,因真核基因组存在高度重复序列,探针应尽可能选用基因得编码序列(外显子),避免使用内含子及其她非编码序列，否则探针可能因高度重复序列得存在引起非特异性杂交而导致假阳性结果。
（2)cＤNＡ探针
与mRＮA互补得DNＡ链称cＤNＡ，cＤNA中不存在内含子及其她高度重复序列,故特异性高,就是一种较理想得核酸探针。
(3)ＲNＡ探针
RＮA探针有以下优点:
①RNA:RＮA、ＲＮＡ:DNA杂交体较DNA:DNA杂交体得稳定性高;
②RNＡ单链不存在双链DＮA探针得互补双链得复性,杂交效率高；
③RNA无高度重复序列,非特异杂交少;
④杂交后可以用ＲNasｅ消化未杂交得RNA探针,可降低杂交本底。
(４)寡核苷酸探针
人工合成得寡核苷酸片段作探针得优点：
①可以根据需要合成相应得序列,避免基因组DNA探针中高度重复序列所带来得影响;
②多数长为１５～30bｐ即使有一个碱基不配对也会影响杂交链得Tm值,严格控制反应条件，可检测出基因点突变;
③探针复杂性降低,杂交反应时间较短。
28、（1）非放射性标记物主要有四类:
①半抗原：如生物素、地高辛，可利用这些半抗原得抗体进行检测。
②配体：生物素就是抗生物素蛋白卵白素与链霉菌类抗生物素蛋白得配体可用亲与法检测。
③荧光素：如罗丹明(一种荧光染料)等可被紫外线激发出荧光,用于检测。
④化学发光材料:有些标记物与另一类物质反应而产生化学发光现象,能直接对x光片曝光。
（2)优点:安全、对环境与人体无害、其标记物可反复使用,不存在半衰期问题,其标记得DNA探针保存在50%得甘油中，在一200C可保存半年之久。
(3)合成非放射性核酸探针得方法主要有：
①异羟基毛地黄苷配基标记ＤNA探针(地高辛配基系统）。
②ＤNA探针得生物素标记。
③直接与核酸发生活性反应、连接到核酸探针上得非放射性标记物，如：光敏生物素;辣根不定期氧化物酶;碱性磷酸酶等,均可通过化学方法直接交联到核酸探针上,杂交后再用相应得方法,如抗原一抗体反应、酶促反应显色等检测。
④荧光素标记核酸探针:根据探针标记得性质不同,杂交体可直接用荧光显微镜观察,或用酶组织化学法、免疫组织法检测。
2９、滤膜杂交主要有:
(１）southｅｒn blｏttｉｎg:特指DNＡ印迹杂交;
(2)northｅｒn ｂlotting:特指RNA印迹杂交;
（3)ｄoｔblｏtｔing(斑点印迹)/ｓlot blotｔing(狭线(缝）印迹)。例如：southernｂlottｉnｇ(印迹法)基本流程：组织或细胞→基因组DNA→限制性内切酶酶切→琼脂糖凝胶电泳→印迹转移至滤膜→预
杂交→加入探针→杂交→洗膜→放射自显影。
30、①足迹法研究ＲNA聚合酶与启动子得识别及结合末端标记得DＮＡ+RNＡ聚合酶用→用DNA酶水解→电泳→放射自显影,对照:DNA→用DNA酶水解→电泳→放射自显影,结果:启动子部位受RNA聚合酶保护,不被降解;
②启动子功能得研究一启动子突变。使启动子得碱基序列发生变化或采用修饰碱基得方法,可以改变启动子得强弱。使启动子得功能减弱或消失→下降突变,使启动子得功能增强→上升突变。
31、真核生物mRNA得3/端有一段poly（A）结构,根据碱基互补配对原则,A与T能形成碱基互补。
３2、在极端非标准条件下，限制酶能识别与切割序列相似得序列，这个改变得特殊性称星星活性。引起星星活性得因素:高浓度甘油(＞5%);酶过量(＞100Ｕ／μg);低离子强度(＜25mＭ);高Ph（＞８、0）；有机溶剂(二甲基亚砜(PMSD)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺);用其它二价阳离子代替Mg2＋(Mn2+、Cu2＋、Co２+、Zn2+)。
３３、Ｉpｐ:大肠杆菌强启动子（脂蛋白基因）
laｃ：乳糖操纵元得启动子及操纵子
S：大肠杆菌分泌蛋白基因序列
MCS:多克隆位点
Ｉpp:大肠杆菌强终止子
lacI:乳糖操纵元得调控基因
ori：质粒得复制起点
amp r:抗氨苄青霉素(Ａmp R)得基因
此载体得用途:作为大肠杆菌中得一个可调控得表达载体，可大量表达克隆得外源基因，并将蛋白分泌到细胞外。
工作原理:将外源基因正确插入到克隆载体后,转化进入大肠杆菌,通过加入IPTＧ诱导外源基因得表达。
34、ｐBＲ3２2 oｒi:来源于pBR322载体得质粒复制起点,此载体在宿主菌中能自主复制。
ｌacI q:来自于乳糖操纵元得调控突变基因,可产生大量调控蛋白。
Pｌaｃ:来自于乳糖操纵元得启动子
laｃＯ:来自于乳糖操纵元得操纵子
ｇ10 RＢＳ:来自于g1０基因得核糖体结合位点序列。
6×Hiｓ:6个组氨酸得短肽序列,这些带有组氨酸标签得蛋白质能够紧紧地同A蛋白柱结合,但很容易被