药 物 生 物 技 术
Pharm aceutical Biotechno logy 2008,15(2):129～132
双水相萃取法分离纯化白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的研究＊张佰鹏,高美风,徐 雯,付金香,孔 毅,吴梧桐
(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏南京210009)
摘 要 采用PEG/(N H4)2SO4双水相系统萃取α-淀粉酶抑制剂,考察了PEG浓度、(N H4)2SO4浓度和NaCl溶液浓度对α-淀粉酶抑制剂分配系数、相比和活力回收率的影响。确定了白芸豆中α-淀粉酶抑制剂提取的最佳条件,即P EG质量分数为12.0%,(N H4)2SO4的质量分数为13.3%,NaCl质量分数为0.003%时,分配系数、相比和活力回收率分别为4.40,0.57,71.41%。
关键词 双水相萃取;α-淀粉酶抑制剂;分离纯化
中图分类号:R914 文献标识码:A 文章编号:文章编号:1005-8915(2008)02-0129-04
自从上世纪40年代Bow man首先从豆类中提取α-淀粉酶抑制剂(alpha-Amy lase Inhibitor,α-AI)以来,人们对不同来源的α-AI的提取工艺、结构、以及理化性质做了大量的研究工作[1]。α-AI 广泛存在于植物尤其是麦类和豆类植物的种子中。白芸豆中的α-AI是一种热稳定的糖蛋白,在细胞内质网上合成,储存在液泡内,要经过蛋白水解酶水解作用才能成为有活性的α-AI[2]。与其它种类的α-AI相比,白芸豆中的α-AI具有较高的比活力[3],可以抑制哺乳动物唾液淀粉酶、胰淀粉酶以及昆虫体内α-淀粉酶的活性,但不能抑制植物、真菌和细菌α-淀粉酶的活性。可以用来治疗糖尿病、减肥以及干扰内源性甘油三脂的合成[4,5],还可以用作杀虫剂。
近年来,对双水相萃取(Aqueous Tw o-phase Extraction,A TPE)的研究日益增多。双水相体系含水量可达80%以上,萃取环境温和,生物大分子在萃取过程中可保持其活性及构象;两相之间的传质和平衡速度快,分相时间短;萃取过程采用常温常压操作,设备要求低,易于放大和进行连续性操作。双水相萃取法已经渐渐发展成为一种适合于大规模生产、经济简便、快速高效的分离纯化技术,现已广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品尤其是蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离和纯化。
进行α-AI初步的纯化后,为了尽量保持α-AI 的生物活性而得到有效的α-AI,A TPE是一种非常可靠的生物大分子的纯化方法,其应用前景广阔。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料 白芸豆(购自本地超市);α-淀粉酶(美国Sig ma公司);可溶性淀粉(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);聚乙二醇(分析纯,广东汕头市西陇化工厂);(NH4)2SO4(分析纯,南京化学试剂一厂);其它试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器 J2-HS型大容量离心机(美国Beckm an公司);752型紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
1.2 方法
1.2.1 活性检测方法 蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝G250结合法。α-淀粉酶抑制活性的检测采用碘比色法。
碘比色法:取一定量的α-淀粉酶和α-AI于0.5m l磷酸缓冲液中,在37℃条件下预反应30min后,加入1ml的0.04%的淀粉溶液再反应15min,用0.3m l的2m ol/L盐酸中止反应, 3.5m l蒸馏水稀释反应液,加0.2ml0.01mol/L 的碘液显色,在660nm处测定吸光度值。
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＊收稿日期:2007-11-05 修回日期:2007-11-26作者简介:张佰鹏,男,1983年生,河北邢台人,硕士。 ＊通讯作者:吴梧桐,教授,博导,Tel:025-********。
配制不同浓度的淀粉溶液,分别取1ml淀粉溶液,加0.3m l2m ol/L的盐酸,4.0ml的蒸馏水,再加入0.2ml0.01mol/L的碘液显色,以蒸馏水为空白,在660nm处测定吸光度值。以淀粉浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标作标准曲线。
α-淀粉酶活力单位:在37℃条件下,1min内水解1m g可溶性淀粉所需淀粉酶的量。α-AI活力单位:在相同条件下,抑制1活力单位的淀粉酶所需抑制剂的量。
1.2.2 α-淀粉酶抑制剂的分离纯化[6] 称取
500g白芸豆粉碎成粉末(过60目筛),并倒入2L 烧杯中,烧杯中加入1500m l1%的NaCl溶液搅拌1h。离心(10000r/min,15min),上清液70℃水浴15min,其间不断搅拌。冷却至室温后离心(10000r/min,15min),上清液(α-AI粗提液)即采用双水相体系萃取,将上相液(PEG溶液)装入透析袋中透析,冷冻干燥。
1.2.3 PEG/(NH4)2SO4双水相系统相图的测定方法及计算公式的定义 双水相系统相图的测定方法[7]:将15m l PEG溶液装入试管中,然后用(NH4)2SO4溶液滴定,随着(N H4)2SO4溶液的加入,试管溶液由均相变为浑浊,记录加入(NH4)2SO4溶液的量,然后再向试管中加入适量水,溶液又澄清,继续滴加(NH4)2SO4溶液,溶液又变浑浊,计算此时系统的总组成,以此类推即得。
在考查PEG溶液对抑制剂活力产生的影响时,反映其影响程度的的抑制剂活力活性比X= (PEG溶液中的抑制剂活力/空白试剂的抑制剂活力)×100%。
分配系数k=(分相后上相抑制剂活力)/(分相后下相抑制剂活力)。
双水相相比R=(分相后上相体积)/(分相后下相体积)。
抑制剂活力回收率η=R k/(1+R k)×100%。2 结 果
2.1 不同相对分子质量PEG的选择
将PE G2000、PE G4000、PE G6000、PEG10000、PEG20000分别配成30%的溶液,准确吸取5ml 不同分子质量的PEG溶液,分别加入1m l样品液,混匀10min,测定不同分子质量PEG中的样品
比活。准确吸取5ml蒸馏水并加入1ml的样品液作为对照,以α-AI活力活性比(X)为指标,考察成相物质对α-AI活性的影响。
抑制剂活力活性比X的结果分别为97.8%, 98.2%,98.4%,96.6%,93.2%。有报道[8]称PEG的分子质量越大,所成双水相中酶在上相(PEG溶液)中的分配系数就越小,故选取PEG2000为双水相系统成相物质。
2.2 PEG2000/(N H4)2SO4双水相系统相图
由PEG2000与(N H4)2SO4组成的相图见图1。
Fig1 Phase diag ram o f PEG2000and(N H4)2SO4 2.3 在PEG2000/(NH4)2SO4双水相系统中,PEG
浓度对分配系数、相比和活力回收率的影响 取5m l不同浓度的PEG2000溶液,分别加入(NH4)2SO40.6g使其最终百分含量为10.0%,再分别加入1m lα-AI粗提液,振摇充分,静置测定结果。以PEG的质量分数为横坐标,以相应的相比、分配系数和活力回收率的值为纵坐标作图,结果如图2所示。
F ig2 Effect on parameter s by co ncentratio n o f PEG
当(NH4)2SO4的浓度确定为10.0%不变时, PEG的浓度为10%时不形成双水相体系,PEG的浓度为36%时(N H4)2SO4溶解不完全。由图2可知,随着PEG浓度的增加分配系数k和活力回收率η逐渐减小,相比R逐渐增大。在PEG溶液浓度为12%时,分配系数最大为3.86,活力回收率最大为69.23%,相比为0.58。
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2.4 在PEG/(NH4)2SO4双水相系统中, (NH4)2SO4浓度对分配系数、相比和活力回收率的影响
由图2分析当PEG浓度为12%时,分配系数k和活力回收率η为最大。因此用不同浓度的(NH4)2SO4溶液与12%的PEG构成PEG/ (NH4)2SO4双水相体系,再分别加入1m lα-AI粗提液,振摇充分,静置测定结果。以(NH4)2SO4的质量分数为横坐标,以相应的相比、分配系数和活力回收率的值为纵坐标作图如图3所示。
Fig3 Effect o n par ame te rs by concentr ation of(N H4)2SO4由图3可知,当PEG的浓度确定为12.0%时,随着(NH4)2SO4量的增加,相比R逐渐减小,分配系数k逐渐增加,中间略有起伏,活力回收率总体趋势为减小。当(NH4)2SO4浓度为20%时,分配系数k最大为4.22。当(NH4)2SO4的浓度为13.3%时,活力回收率η最大为69.47%,分配系数和相比分别为4.21和0.54。
2.5 在PEG/(NH4)2SO4双水相系统中,NaCl质量分数对分配系数、相比和活力回收率的影响以PEG200012.0%和(NH4)2SO41
3.3%建立双水相体系,并加入NaC l溶液使之具有不同盐浓度,再分别加入1m lα-AI粗提液,振摇充分,静置测定结果。以NaCl的质量分数为横坐标,以相应的相比、分配系数和活力回收率的值为纵坐标作图如图4所示
。
Fig4 Effect o n pa rameters by different concent ratio n of N aCl
由图4可知,PEG200012%和(NH4)2SO4 13.3%建立的双水相体系中,当NaCl浓度增大,相比R基本不变,分配系数k基本呈增加趋势,活力回收率η先增大后减小。当NaC l浓度为0.003%时,活力回收率η最大为71.41%,分配系数和相比分别为4.40和0.57。
综上所述,当双水相体系中PEG2000、(N H4)2SO4和NaC l的浓度分别为12.0%, 13.3%和0.003%时,双水相体系中上相液(PEG 溶液)中α-AI的回收率最大。故采用此条件的双水相体系对粗提液进行萃取。
2.6 α-AI的分离纯化及各步骤蛋白总量、总活力、比活和回收率的测定
依1.2.2所述的方法分离纯化α-AI,其中双水相体系中PEG2000、(NH4)2SO4和NaCl的浓度分别为12.0%,13.3%和0.003%。测定各步骤中提取物的蛋白总量、总活力、比活和回收率,结果见表1。
T ab1Purificatio n ofα-A I
Steps and pro cedures P ro tein co ntent(mg)T o tal activ ity(u)Specific activity(u/mg)Reco very(%) Crude ex tract(500g of beans)629003042004.8100
Hea t treatment(70℃×15min)322002068567.468
Ex tract of A T P E19921673108455 Dialysis and Ly ophilization13891372519945
通过研究可得,优化后的白芸豆α-AI提取工艺为:1500ml1%的N aCl溶液中加入500g白芸豆粉末(过60目筛)并搅拌1h,离心(10000r/m in, 15min),上清液70℃水浴15min,其间不断搅拌。冷却至室温后离心(10000r/min,15min),上清液(α-AI粗提液)采用双水相体系(PEG2000、(NH4)2SO4和NaCl的浓度分别为12.0%,13.3%和0.003%)萃取,将上相液(PEG溶液)装入透析袋
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张佰鹏等:双水相萃取法分离纯化白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的研究
中透析,冷冻干燥。
以此工艺分离纯化白芸豆中的α-淀粉酶抑制剂,500g白芸豆粉末最终得到α-淀粉酶抑制剂1.39g,回收率为45%,比活提高了19.6倍。
3 讨 论
研究表明,采用PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取α-AI是可行的,当双水相体系中PEG2000、(N H4)2SO4和NaCl的浓度分别为12.0%,13.3%和0.003%时,α-A I的活力回收率η最大,达到71.41%。
当(N H4)2SO4的浓度不变时,随着PEG2000浓度的增加,α-AI在上相(PEG溶液)中的分配系数变化很大,从3.86降低到0.50。而当PEG2000的浓度不变,(NH4)2SO4的浓度变化时,α-AI在上相(PEG溶液)中的分配系数变化不明显,从3.84增加到4.22。这是因为α-AI主要分配于上相中,因此PEG的浓度对α-A I具有较大的影响,而(N H4)2SO4的浓度对其影响较小。
当PEG的浓度确定时,随着(N H4)2SO4量的增加,活力回收率η先增大后减小的原因是相比R 不断减小而分配系数k不断增大。
在双水相体系中,一般来说适当增加离子浓度可以加快分相速度,但是PEG2000/ (NH4)2SO4体系成相速度很快,增加离子浓度并不能显著地改变成相速度。盐浓度对分配系数的影响主要反应在相间电位和蛋白质疏水性的影响,本试验中,随着NaCl溶液的加入,α-AI在上相中的分配系数呈增加趋势,这可能是因为无机盐离子的加入影响了两相间的电位。另外还可能影响α-AI的羧基和氨基的解离,使α-AI更利于进入PEG相。
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Study on Purification of Alpha-Amylase Inhibitor by Aqueous Two-phase Extraction,from the Kidney Bean,Phaseolus Vulgaris
ZHANG Bai-peng,GAO M ei-feng,XU Wen,FU Jin-xiang,KONG Yi,WU Wu-tong (S chool o f L if e Science and Technology,China P harm aceutical Univ ersity,Nanjing210009, China)
A bstract Ex tractio n of alpha-Amy lase Inhibitor by Aqueous Tw o-phase Ex traction w as studied.Effect of the Concentration of PEG,(NH4)2SO4and NaCl on ex traction w as investig ated.The result indicated that the partitio n coefficient of4.40and the recovery of to tal activity of71.41%could be obtained under the conditions o f PEG2000(12.0%),(N H4)2SO4(13.3%)and NaCl(0.003%).
Key words Aqueo us Tw o-phase Ex tractio n,alpha-Am ylase Inhibitor,Purification
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