实验总结报告
摘要
1、通过PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳回收得到外源基因parb,进行BglⅡ和
Xba I 双酶切；抽提质粒pIJ86601，进行BamH I和Xba I 双酶切；将两者的酶切产物通过连接转化，培养后抽提质粒进行电泳，测序，检测重组质粒是否构建成功。测序结果显示未构建成功。
2、用相同的方法构建表达载体PGEX-sco3330，由于时间问题尚未完成。
3、诱导蛋白表达，蛋白纯化，蛋白脱盐，bradford法进行蛋白含量测定以及SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验（Western Blotting）。
实验内容：
一、构建质粒pIJ86601-parb
(一)获取外源基因parb
1.PCR扩增
PCR体系：200μl体系中，高保真pfuDNA聚合酶10X buffer，40 μl；10mM Mixed dNTP，5 μl；PrimerA，5 μl；PrimerB，5 μl；高保真pfu酶，2 μl；
DMSO，20 μl；双蒸水，120 μl；模板1μl。
PCR程序设定Temp[℃] Time next turns Gradient[℃]
1: 98.0 10min
2: 98.0 30S
3: 60.0 30S 30.0
4: 72.0 30S 2 3 4
5: 72.0 10min
6:16.0 1h
2.琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的DNA
1)通过电泳将目的片段与其他DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下
含需回收DNA的琼脂块,放入1.5ml离心管中。
2)按每300μl/100mg的比例加入Binding Buffer,置于50-60℃水浴中10分
钟,使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。
3)将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，12,000rpm
室温离心2 min。
4)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl Wash
Solution,12,000 rpm室温离心30秒。
5)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl Wash
Solution, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心30秒。
6)取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心
2min。
7)将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30μl水，室温或37℃放置2
分钟。
8)12,000 rpm室温离心2分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，
可立即使用或保存于-20℃备用。
(二)抽提质粒pij86601（OMEGA Plasmid Mini Kit）
1.挑取适量含质粒pij86601的菌株接种于5ml 加有阿伯拉抗生
素的LB液体培养基中，37℃培养12-16小时。
2.取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。
3.倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混
和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
4.往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
5.往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数次
混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
6.室温下，≥12000 x g 离心10min。
7.将液转移到放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温离心
30秒。
8.取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA
Wash Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
9.取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA
Wash Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
10.取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心
2分钟。
11.将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水
(PH>7.0)，室温或42℃放置2分钟。
12.12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为提取的载体质粒，
可立即使用或保存于-20℃备用。
(三)外源基因与载体连接
1.对目的基因parb进行BglⅡ和Xba I 双酶切，37℃60分钟。酶切体系
（100μl）：
10 x Buffer 10μl，BglⅡ1μl，Xba I 1μl，加ddH2O至100μl。酶切后电泳
回收。
2.对载体pij86601进行BamH I和Xba I 双酶切，37℃60分钟。酶切体系
（100μl）：
10 x Buffer 10μl，BamH I 1μl，Xba I 1μl，加ddH2O至100μl。酶切后电泳
回收。
3.用T4 ligase 对酶切后的目的基因和载体进行16℃连接过夜，连接体系
（10μl）：10X Buffer 1μl，T4 ligase 1μl, 目的基因7μl，pIJ86601 1μl。
(四)重组DNA 导入宿主菌及检测
1.Kcm法转化
1)在EP管中加入80μlddH2O,20μl 5*kcm,1μl连接产物，混匀后加入到
100μl DH5α感受态中，冰浴30min。
2)转入42℃水浴热激90s。
3)再置于冰水浴1-2min。
4)加入800μL培养基后，37℃保温45-50min。
5)将转化菌液涂于含终浓度为100μg/mL阿伯拉霉素的BL平板上。
6)培养后挑单克隆涂于新的含抗阿伯拉霉素的BL平板上。
2.快抽质粒：
在转化后，挑单克隆菌可进行快抽质粒检测是否连进外源。
1)加含有溴酚蓝的Solution I 30μl。
2)加Solution II 15μl，75℃加热15分钟。
3)加酸酚10μl，震荡。
4)12000r,3min 离心。
5)取上层进行凝胶电泳。
3.普通抽提质粒（OMEGA Plasmid Mini Kit）
1)选取质粒大小正确的单克隆菌，接种于5ml加有抗生素的LB液体培
养基，37℃培养12-16小时。
2)取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。
3)倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混
和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
4)往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
5)往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数
次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
6)室温下，≥12000 x g 离心10min。
7)将液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温
离心30秒。
8)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA
Wash Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
9)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA
Wash Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
10)取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离
心2分钟。
11)将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水
(PH>7.0)，室温或50℃放置2分钟。
12)12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的质粒，可立
即使用或保存于-20℃备用。
4.质粒交由伯尚公司测序验证表达载体构建是否成功。
二、构建表达载体PGEX-sco3330
(一)获取外源基因sco3330
1.PCR扩增
PCR体系：200μl体系中，FastpfuDNA聚合酶10X buffer，40 μl；10mM Mixed dNTP，5 μl；sco3330-E-F2，5 μl；Sco3330-K-R，5 μl；Fastpfu酶，2 μl；
DMSO，20 μl；双蒸水，120 μl；模板1μl。
PCR程序设定Temp[℃] Time next turns Gradient[℃]
1: 98.0 10min
2: 98.0 30S
3: 58.0 30S 30.0
4: 65.0 30S 2 3 4
5: 65.0 10min
6:16.0 1h
2.琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的DNA
1)通过电泳将目的片段与其他DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下
含需回收DNA的琼脂块,放入1.5ml离心管中.
2)按每300μl/100mg的比例加入Binding Buffer,置于50-60℃水浴中10分
钟,使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。
3)将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，12,000rpm
室温离心2 min。
4)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl Wash
Solution,12,000 rpm室温离心30秒。
5)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl Wash
Solution, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心30秒。
6)取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心
2min。
7)将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30μl水，室温或37℃放置2
分钟。
8)12,000 rpm室温离心2分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，
可立即使用或保存于-20℃备用。
(二)抽提质粒PGEX（OMEGA Plasmid Mini Kit）
a)挑取适量含质粒PGEX的菌株接种于5ml 加有氨苄抗生素的LB液体培
养基中，37℃培养12-16小时。
b)取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。
c)倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混和
液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
d)往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
e)往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数次混
匀，直至形成白色絮狀沉淀。
f)室温下，≥12000 x g 离心10min。
g)将液转移到放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温离心30
秒。
h)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA Wash
Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
i)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA Wash
Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
j)取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心2分钟。
k)将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水(PH>7.0)，室温或42℃放置2分钟。
l)12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为提取的载体质粒，可立即使用或保存于-20℃备用。
(三)外源基因与载体连接
1.对目的基因sco3330和载体PGEX进行EcorI和Xho I 双酶切，加入Xho I
2h 后再加入EcorI，置于37℃60分钟。对载体PGEX 进行去磷化处
理。酶切体系（100μl）：10 x Buffer 10μl，EcorI 1μl，Xho I 1μl，加
ddH2O至100μl。酶切后电泳回收。
2.用T4 ligase 对酶切后的目的基因和载体进行16℃连接过夜，连接体系
（10μl）：10X Buffer 1μl，T4 ligase 1μl, 目的基因7μl，PGEX 1μl。
(四)重组DNA 导入宿主菌及检测
1.Kcm法转化
1)在EP管中加入80μlddH2O,20μl 5*kcm,1μl连接产物，混匀后加入到100μl
DH5α感受态中，冰浴30min。
2)转入42℃水浴热激90s。
3)再置于冰水浴1-2min。
4)加入800μL培养基后，37℃保温45-50min。
5)将转化菌液涂于含终浓度为100μg/mL氨苄抗生素的BL平板上。
6)培养后挑单克隆涂于新的含抗氨苄抗生素的BL平板上。
2.快抽质粒：
在转化后，挑单克隆菌可进行快抽质粒检测是否连进外源。
1)加含有溴酚蓝的Solution I 30μl。
2)加Solution II 15μl，75℃加热15分钟。
3)加酸酚10μl，震荡。
4)12000r,3min 离心。
5)取上层进行凝胶电泳。
3.普通抽提质粒（OMEGA Plasmid Mini Kit）
1)选取质粒大小正确的单克隆菌，接种于5ml加有抗生素的LB液体培养
基，37℃培养12-16小时。
2)取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。
3)倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250μl SolutionⅠ/RNaseA 混和
液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。
4)往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。
5)往上述混和液中加入350μl solution III，并温和地上下颠倒离心管数次混
匀，直至形成白色絮狀沉淀。
6)室温下，≥12000 x g 离心10min。
7)将液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，,12,000rpm室温离心
30秒。
8)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA Wash
Buffer,12，000 rpm室温离心15秒。
9)取下UNIQ-10柱,倒废液，将柱放回同一收集管, 加入500μl DNA Wash
Buffer, 12,000 rpm，静止放置一分钟，室温离心15秒。
10)取下UNIQ-10柱,倒废液, 将柱放回同一收集管，12,000 rpm室温离心2
分钟。
11)将柱放在一新的EP管中, 在柱子膜中央加30μl Elution Buffer或水
(PH>7.0)，室温或50℃放置2分钟。
12)12,000 rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的质粒，可立即
使用或保存于-20℃备用。
4.质粒交由伯尚公司测序验证表达载体构建是否成功。
三、蛋白表达、纯化及浓度测定
(一)蛋白表达
1.挑取阳性单克隆于5ml有氨苄抗生素抗性LB培养基中，37℃震荡培养过
夜，抽质粒转化到BL21感受态中，将转化菌液涂于加有氨苄抗生素的
BL平板中过夜培养。再按1%的量接种到250 ml氨苄抗生素LB培养基，
37℃震荡培养4小时，使菌体生长到OD值0.4。
2.加入1/1000IPTG诱导蛋白表达，16℃低温震荡12小时。
3.诱导培养后，培养液冰浴30分钟，取菌液于大离心管中，4℃4000r 离
心10min，弃上清，加入30ml细胞裂解液悬浮菌体，4℃4000r 离心
10min，弃上清，再用30ml细胞裂解液悬浮菌体，加入40μl的蛋白酶抑
制剂PMSF，置于冰盒中，超声破碎99个循环。
4.将破碎后的细胞裂解液收集入离心管，4℃13000r 离心40min，取上清，
存放于4℃。
(二)蛋白纯化
1.将Ni-NTA柱料混匀后，吸取1ml装入纯化柱，用10ml双蒸水洗柱料2次，
再用细胞裂解液平衡柱料2次。
2.将平衡后的柱料与超声破碎后的细胞液混合加入Corning管，用混合器
4℃结合2小时。
3.将结合好的柱料加入纯化柱，用洗杂液I洗柱2次，用洗杂液II洗柱2次，
加入3ml的洗脱液，静置10分钟，收集纯化蛋白液。
(三)蛋白脱盐
1.透析袋的制备
1)把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段。
2)在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋
煮沸10分钟。
3)用蒸馏水彻底清洗透析袋。
4)放在1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将之煮沸10分钟。
5)冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取
用透析袋是必须戴手套。
6)用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。
2.透析脱盐
用镊子取出透析袋，用双蒸水清洗一次，再用透析液清洗一次，加入
蛋白液，夹紧夹子后，放入透析液，用磁力搅拌器4℃搅拌30分钟，换
透析液；换液3次后，收集蛋白，并分装，存放于-70℃。
(四)蛋白质含量测定
采用bradford法对蛋白进行含量测定。取900μl bradford工作液于EP
管中，加入一定量的待测蛋白，混匀后用ddH2O补至1000μl。设定空
白对照，用NanoDrop ND2000C超微量分光光度计进行测定。
(五)SDS-PAGE电泳
1.根据所要分离蛋白质分子量的大小，配制适当浓度的SDS-PAGE胶，常
用浓度为12％。将收集的不同蛋白样品（或细胞裂解液）置于凝胶加
样缓冲液中，在100 ℃加热10分钟以使蛋白质变性；设计加样顺序，
作好实验记录，按预定顺序加样，需要时加入Protein Marker；电泳装
置与电源连接好，电流应流向阳极，先将电压调至80 V电泳20min，待
溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶界面处，改用100V电压电泳约1 h，待溴
酚蓝迁移到分离胶底部0.5 cm处，关闭电源；
2.用考马斯亮蓝染色1小时，回收染色剂。
3.用脱色液脱色3次，每次30分钟。
4.用双蒸水洗净后，拍照。
(六)免疫印迹试验（Western Blotting）
1.SDS-PAGE电泳。
从电泳装置上卸下SDS-PAGE凝胶玻璃板，用去离子水冲洗干净，准备
进行免疫印迹操作。
2.转膜
在容器中加入转膜缓冲液，将2块海绵、硝酸纤维素膜（NC膜）和4张
普通滤纸浸泡约10min（若用PVDF膜，则首先要将PVDF膜置于甲醇中
浸透10min，然后和硝酸纤维素膜同样使用）；从黑色面开始依次将海
绵、滤纸、SDS-PAGE胶、膜、张滤纸、海绵叠放在一起，成三明治状，注意对齐并赶出其中的气泡；将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴
极，对于黑色面)；接通电源，在冰浴中进行转膜，恒流300毫安（或恒
压100伏）转膜1 h，或恒压30V转膜过夜。
3.封闭和杂抗
以下各步均置于摇床上进行：
将转好的膜浸于5％脱脂牛奶（用1×TBST配置，4 ℃保存一周内使用）
中，在4 ℃封闭60min；将膜浸于含有一抗（根据需要1：1000-1：3000
稀释）的5％脱脂牛奶中室温1-2 h或者4 ℃过夜；用1×TBST将膜浸洗
3次，10min/次；将膜浸于含有二抗（根据需要1：3000-1：10000稀释）
的5％脱脂牛奶中室温60min；用1×TBST将膜浸洗3次，10min/次，膜即
可用于显色反应。（注：若使用偶联酶标抗体，则在牛奶封闭后, 将膜
浸于含有抗体的1×TBST 中1 h，然后用1×TBST 将膜浸洗3 次，10min/
次，膜即可用于显色反应。）
4.显色
目前主要使用底物化学发光ECL-PLUS试剂盒进行显色：将膜表面的液
体略微沥干；以40：1的比例混匀Solution A：Solution B（通常用量为
400 μl/膜），混匀后均匀覆盖于膜的表面，避光放置3-5min；将膜表面
的液体略微沥干后，用Typhoon扫描显影；如需要固定于暗盒中压X光
片时，用干净的保鲜膜包裹膜，不要有皱纹，压片时间可适当调节；
显影，定影，分析结果。
实验结果与分析：
基因测序结果表明pIJ86601-parB 重组质粒未构建成功。
可能的原因有：
1、BglⅡ和Xba I 的酶切Buffer 选用NEB Cutsmart，影响了BglⅡ的活
性，因为BglⅡ在NEB Cutsmart 中的活性仅为10%。综合考虑两种酶，
应该选用NEB3 Buffer，BglⅡ在其中的活性为100%，
Xba I 在其中的活性为75%也基本能满足要求。
2、载体酶切后未进行去磷处理，可能产生自连，影响外源跟载体的连
接效率。
3、感受态保存时间过长，可能影响转化效率。
致谢
在中科院植生所实习的近一个月时间里，得益于各位师兄师姐的帮助，让我对实验室工作有了更多的了解，实验技能得到了一定提高，特别是对分子生物学相关的理论知识和实验技能方面有了更多的了解。
同时，也非常感谢赵老师和王老师在生活上对我的关心和学习上对我的指导。
感谢你们让我有了一段充实而愉快的实习经历！
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
实验实习总结 实验室教学是培养应用人才的关键环节，关于实验室实习的总结该怎么写。下面是我为大家整理的实验实习总结，希望对大家有帮助。 实验实习总结篇一 时间过的真快，转眼间，在实验室为期两个月的毕业实习结束了，留下的是满满的收获和不舍。 在这两个月的时间，我学到了很多东西，不仅有学习方面的，更学到了很多做人的道理，对我来说受益非浅。在老师和师兄师姐的帮助下，我很快融入了这个新的环境，这对我今后进入研究生阶段是非常有益的。除此以外，我还学会了如何更好地与别人沟通，如何更好地去陈述自己的观点，如何从更多的人那里获取对自己有用的信息。相信这些宝贵的经验会成为我今后实验的最重要的基石。实习是每一个打算进入研究生阶段的学生必须拥有的一段经历，它使我们在实践中了解专业，让我们学到了很多在课堂上根本就学不到的知识，也打开了视野，增长了见识，为我们以后更好地从事科研工作、探索大自然的奥秘打下了坚实的基础。 现实的脚步声却是那么地清晰、有力。在一次次理论与实践相结合的过程中，在老师们悉心指导下，我不但生物实验有了系统的理解，从无数次的失败中吸取了宝贵的经验教训，而且随着时间的推移，自己的意志也得到了磨练，恐惧心理也逐渐地消失了。我时刻提醒自己，唯有不断努力，才能与时俱进。总之，这次实习的意义，对我来说已不再是完成学分、完成毕业实习的任务，而是在开启"生命之旅"大门的过程中迈出了第一
步。我一定会好好地珍惜这个机会，并为自己所喜爱的方向努力贡献自己的聪明才智。 在为期两个月的以实验为主的的实习中，我受益匪浅，我不仅学习到了专业知识，更重要的是收获了经验与体会，这些使我一生受用不尽，记下来以时刻自勉： 1.手脚勤快，热心帮助他人。初来匝道，不管是不是自己的份内之事，都应该用心去完成，也许自己累点，但你会收获很多，无论是知识与经验还是别人的称赞与认可。毕竟师兄师姐们也都是从我们这个时候过来的，对于他们而言，哪些学生是认真的，哪些学生只是混时间，他们一眼就能看出。因为态度决定一些，一些小事，如刷培养皿、刷试管，大家都是从这里开始的，不能因为好高骛远就偷懒。只有用心地，以良好的态度做好这一件件小事，才能获得大家的认可，也只有这样，才有师兄师姐愿意更深入的教给我们一些技术和方法。 2.多学多问，学会他人技能。学问学问，无问不成学。知识和经验的收获可 以说与勤学好问是成正比的，知识总是垂青那些善于提问的人。由于之前没有学过分子生物学，必然没有这方面的知识基础，很多东西不懂也是很正常的。所有的知识也都有一个从不懂到懂的过程，所以没有什么好丢脸的，不懂装懂才是真正的傻。此外，有一些经验上的东西，可能是关于细节的，在已知的基础上根据每个实验室的实验环境等因素进行了一些优化，这就需要我们及时的询问，才能少走弯路。 3.善于思考，真正消化知识。有知到识，永远不是那么简单的事，
结合着下载的资料复习吧~~~~ 绪论 分子生物学的发展简史 Schleiden和Schwann提出“细胞学说” 孟德尔提出了“遗传因子”的概念、分离定律、独立分配规律 Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离出DNA Morgan基因存在于染色体上、连锁遗传规律 Avery证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体 McClintock首次提出转座子或跳跃基因概念 Watson和Crick提出DNA双螺旋模型 Crick提出了“中心法则” Meselson与Stah用N重同位素证明了DNA复制是一种半保留复制 Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子模型 Arber首次发现DNA限制性内切酶的存在 Temin和Baltimore发现在病毒中存在以RNA为模板，逆转录成DNA的逆转录酶 哪几种经典实验证明了DNA是遗传物质? (Avery等进行的肺炎双球菌转化实验、Hershey 利用放射性同位素35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质外壳和DNA) 第二章染色体与DNA 第一节染色体 一、真核细胞染色体的组成 DNA：组蛋白：非组蛋白：RNA = 1：1：(1-1.5)：0.05 （一）蛋白质（组蛋白、非组蛋白） （1）组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 功能：①核小体组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）作用是将DNA分子盘绕成核小体
②不参加核小体组建的组蛋白H1，在构成核小体时起连接作用 （2）非组蛋白：包括以DNA为底物的酶、作用于组蛋白的酶、RNA聚合酶等。常见的有（HMG蛋白、DNA结合蛋白） 二、染色质 染色体：分裂期由染色质聚缩形成。 染色质：线性复合结构，间期遗传物质存在形式。 常染色质（着色浅） 具间期染色质形态特征和着色特征染色质 异染色质（着色深） 结构性异染色质兼性异染色质 （在整个细胞周期内都处于凝集状态）（特定时期处于凝集状态）三、核小体 由H2A、H2B、H3、H4各2 分子组成的八聚体和绕在八聚体外的DNA、一分 子H1组成。八聚体在中央，DNA分子盘绕在外，由此形成核心颗粒。,H1结合在核心颗粒外侧DNA双链的进出口端，如搭扣将绕在八聚体外DNA链固定，核心颗粒之间的连接部分为连接DNA。 核小体的定位对转录有促进作用
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
Section A 细胞与大分子 简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。 Section C 核酸的性质 1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些？ A 发生在闭环双链DNA分子上 B DNA双链轴线高卷曲，与简单的环状相比，连接数发生变化 C 当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时，DNA变得紧绷，为正超螺旋，反之变得松弛为负超螺旋。自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的，因为能量最低。 2.简述核酸的性质。 A 核酸的稳定性：由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定 B 酸效应：在强酸和高温条件下，核酸完全水解，而在稀酸条件下，DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸 C 碱效应：当PH超出生理范围时（7-8），碱基的互变异构态发生变化 D 化学变性：一些化学物质如尿素，甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的 而使核酸变性。 E 粘性：DNA的粘性是由其形态决定的，DNA分子细长，称为高轴比，可被机械力和超声波剪切而粘性下降。 F 浮力密度：1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析 G 紫外线吸收：核酸中的芳香族碱基在269nm 处有最大光吸收 H 减色性，热变性，复性。 思考题：提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质？ 质粒是抗性基因，，在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。 Sectio C 课前提问 1.在1.5mL的离心管中有500μL，取出10 μL稀释至1000 μL后进行检测，测得A260=0.15。 问（1）：试管中的DNA浓度是多少？ 问（2）：如果测得A280=0.078, .A260/A280=？说明什么问题？ (1)稀释前的浓度：0.15/20=0.0075 稀释后的浓度：0.0075/100=0.75ug/ml （2）0.15/0.078=1.92〉1.8，说明DNA中混有RNA样品。 2.解释以下两幅图
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)
一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。
二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白
真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C 值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。
分子生物学 第一章绪论 分子生物学研究内容有哪些方面？ 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、Tm(熔链温度)：DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分 9、DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0.34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。 特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列 11、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成：由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 复制型转座：整个转座子被复制，所移动和转位的仅为原转座子的拷贝。 非复制型转座：原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。 第三章DNA Replication and repair 1、半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱
分子生物学实习总结 三天的分子生物学实习，我能认真听老师的讲解和很好的按照老师的安排完成实验。期间，接触和学习到了很多有关分子生物学实验的方法、仪器的使用、技术，而且对分子生物学实验有一个大致的了解，学习到很多以前没有接触过的知识。 这几天来做的不足的地方有： 1.预习不够充分。只是浏览了实验报告上的原理、操作等内容，并没有深入了解每一个步骤的操作会对实验有什么的作用和影响。实验失败了，不能自主找到原因。 2.实验操作过程不够细心。实验要求十分细心，严谨和专注。实验中很多细小的地方还是没有很好的注意到。 3.遇到不懂的没有及时发问。实验就是一个让我们实操的过程，一边操作一边巩固书本上的知识。过程中，遇到不明白的地方应该及时问别人活着自己翻阅资料，力求把实验弄透彻。 但是我还是有很多收获的： 1.对分子生物学实验有了了解。例如实验的基本的流程和操作，常用的方法等基础知识已经有了一定了解，对以后的实验会有一定的帮助。 2.最基本的移液枪、离心机、涡旋器等的使用还有实验中的PCR仪、电泳等有一定的认。 3.学会了严谨和细心。实验所用的材料都是比较昂贵的，而且实验只要一步错了，就得重做。所以需要非常严谨。不仅仅是分子生物学实验，其他实验也要求，所以培养这个有点对以后的实验非常有好处。 4.学会了坚持。很多次因为实验做的时间很长，大家都会很累，但是，还是要坚持，一点点累都受不了是不能把实验做好的。开始慢慢了解到做科研的人员的辛酸，长时间整天呆在实验室做实验，这需要很大的毅力。 5.把握实验机会，让自己学得更多。实验过程中，只要有实操的机会，我都会去操作。因为说和做是不一样的。而且在操作中能加深巩固知识和学得更加深入。 三天的分子生物学实习虽然很累，因为要天天去院楼，而却实验时间都比较长。但是 还是很有意义的，因为学习到很到东西，收获了很多。 老师也为我们准备了很多的材料和准备，实验才做得那么快和顺利，其实，实验室简 化了很多了，而且我们所做的实验都是已经设计好的，按照操作做就行了。如果时间和资 金允许，应该设立一些自主完成的实验，这样可以培养我们更加多的能力，开阔知识面和 拓宽思维。
分子生物学总结完整版 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、 DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、 Tm(熔链温度)： DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、 C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分
9、 DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为 3、4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0、34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列1 1、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成： 由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复
一目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取 （一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头 （二）试剂 1）溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶（现用现配） 100ug/ml RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 4）氯仿：异戊醇（24：1） 5）3mol/L NaAc(pH5.2) 6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇 8) TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0 (三)实验步骤 1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。 3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。 4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。 5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10
分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。 6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。 7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。 8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。 9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 植物DNA的SDS提取法： （一）试验试剂： 1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。 4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。 5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6）氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8) SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9) 1mol／LHCl。 10) 0.2mol/LNaOH。 11) 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。 12) 1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13) 0.05mol/LNaOH。 14) DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。 （二）实验步骤：
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
第一章、基因的结构与功能实体及基因组 1、基因定义 基因(遗传因子)就是遗传的物质基础,就是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称,携带有遗传信息的DNA序列,就是具有遗传效应的DNA分子片段,就是控制性状的基本遗传单位,通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复(DNA repairing)就是细胞对DNA受损伤后的一种反应,这种反应可能使DNA结构恢复原样,重新能执行它原来的功能;但有时并非能完全消除DNA的损伤,只就是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来(如细胞的癌变等),但如果细胞不具备这修复功能,就无法对付经常在发生的DNA 损伤事件,就不能生存。对不同的DNA损伤,细胞可以有不同的修复反应。 3、DNA损伤 DNA损伤就是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。情况分为:substitutation (替换)deletion (删除)insertion (插入)exon skipping (外显子跳跃)。DNA损伤的改变类型:a、点突变:指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition);嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。b、缺失:指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入:指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不就是3的整倍数,则发生读框移动(reading frame shift),使其后所译读的氨基酸序列全部混乱,称为移码突变(frame-shift mutaion)。d、倒位或转位:(transposition) 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。e、双链断裂:对单倍体细胞一个双链断裂就就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组,(Homologus Recombination)就是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Holiday Juncture Structure) 的形成与拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成与Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除(geneknockout),就是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其它顺序相近基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外,还包括引入新基因及引入定点突变。既可以就是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)就是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导人基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组就是发生在两条DNA链特异位点上的重组,重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点;attachmentsite,att)与位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,因而重组具有特异性与高度保守性。 5、碱基错配对修复