中国科学技术大学
硕士学位论文
聚多巴胺接枝聚乙二醇毛细管涂层的制备及其用于生物大分子
分离的研究
姓名：曾容菊
申请学位级别：硕士
专业：高分子化学与物理
指导教师：王延梅
2011-04-18
摘 要
毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）具有高效、快速、微量以及经济环保等优点，在多肽、蛋白质、DNA等生物大分子的分离方面应用非常广泛。但是由于生物大分子与毛细管内壁之间静电及疏水等相互作用的存在，使得生物大分子尤其是碱性蛋白质极易吸附在毛细管壁上。从而造成蛋白质分离效率下降、重现性差、峰形展宽等问题，严重制约了毛细管电泳在该领域的应用。
目前，最有效且用得最广泛的抑制蛋白质吸附的方法是管壁的惰化。其中，聚乙二醇（PEG）因其良好的亲水性、优异的抗蛋白质吸附能力、无毒以及很好的生物相容性而备受青睐。聚乙二醇及其共聚物已成功地应用于毛细管电泳分离蛋白质、多肽、DNA等生物分子。然而，由于PEG具有很强的亲水性，与毛细管内壁作用力很弱，使用多次后容易被缓冲溶液冲出毛细管，对蛋白质吸附的抑制作用减弱。从而导致分离效率降低，涂层管寿命缩短，不能长期使用。
小分子多巴胺在碱性环境下，在氧气的作用下能自发氧化聚合形成具有强粘附性能的聚多巴胺。聚多巴胺不仅具有强粘附性，而且还含有丰富的官能团能够通过迈克尔加成反应或希夫碱反应接枝具有-SH、-NH2等基团的聚合物。因此，聚多巴胺涂层表面可以形成有机物质层,从而改善材料的表面性能。
本论文通过强粘附性的聚多巴胺涂层将具有强抗蛋白吸附性能的PEG牢牢地键合在毛细管内壁，形成有效而稳定的聚合物涂层应用于蛋白质和双链DNA （dsDNA）的分离。主要进行了以下的研究工作：
1. 聚多巴胺接枝聚乙二醇（polydopamine-graft-PEG）涂层毛细管的制备及表征
首先，将羟基聚乙二醇还原成更具活性的氨基聚乙二醇，反应产物的结构采用核磁共振氢谱（1H NMR）和红外光谱（FTIR）表征。然后，采用简单而有效的两步法将氨基聚乙二醇通过与聚多巴胺涂层发生迈克尔加成反应或希夫碱反应，从而键合在毛细管内壁，形成polydopamine-graft-PEG涂层。涂层的化学组成及形貌分别采用X射线光电子能谱（XPS）和扫描电子显微镜（SEM）来表征。
2. Polydopamine-graft-PEG涂层毛细管在分离蛋白质中的应用
聚多巴胺涂层能够牢牢地将PEG键合在毛细管内壁，提高了PEG涂层的稳定性。聚合物涂层在起到稳定电渗流作用的同时，在一定的pH值范围内能实现对三种碱性蛋白质（细胞色素C（Cytochrome C）、溶菌酶（Lysozyme）和核糖核酸酶A（Ribonuclease A））的快速及高效分离。此外，还分别比较了polydopamine-graft-PEG涂层毛细管与商业涂层毛细管分离六种酸碱中性混合蛋白的性能以及在不同pH下分离三种碱性蛋白质的性能。考察了polydopamine-graft-PEG涂层毛细管连续200次分离碱性蛋白质的分离结果。实
验结果证明了polydopamine-graft-PEG涂层能有效地调节EOF的大小以及抑制蛋白质的吸附，是一种非常稳定，性能优异的涂层。
3. Polydopamine-graft-PEG涂层毛细管在食品分析中的应用
Polydopamine-graft-PEG涂层能有效地抑制蛋白质的吸附，且具有很好的稳定性。因此，Polydopamine-graft-PEG涂层能够应用于奶粉中三种主要乳清蛋白质（α-lactalbumin、β-lactoglobulin A、β-lactoglobulin B）的定性定量分析。此外，该涂层还能有效地分离鸡蛋清蛋白质和无脂花生蛋白质。通过与未涂覆的毛细管比较，说明了该涂层能有效地应用于食品蛋白质的分析。
4. LPA的合成及其应用于polydopamine-graft-PEG涂层毛细管中分离dsDNA
Polydopamine-graft-PEG能有效抑制dsDNA在毛细管内壁的吸附，LPA具有优良的筛分性能。结合两者的优点，研究了以LPA作为polydopamine-graft-PEG 涂层毛细管内的筛分介质用于dsDNA的分离分析。考察了分离电压、LPA的分子量以及LPA的浓度对dsDNA分离的影响。结果表明用浓度为4%（m/v）的0.47 MDa的LPA分离dsDNA能够取得最理想的分离效果。
关键词：毛细管电泳 DNA分离蛋白质分离聚乙二醇聚多巴胺涂层聚多巴胺接枝聚乙二醇
ABSTRACT
Capillary electrophoresis (CE), which shows high separation efficiency, short analysis time, low sample consumption, economic and environment process, has a wide range of application for the analysis of a wide variety of biomolecules such as polypeptide, protein and DNA. Unfortunately, in the bare fused-silica capillary environment, because of the coulombic and hydrophobic interactions, the analysis of biomolecules such as proteins have a propensity to strong adsorb onto the surface of the capillary, altering performance with potentially hazardous outcomes such as lower separation efficiency, poor repeatability and additional peak broadening. These phenomena restrict the application of CE.
Recently, coating the capillary with polymer has been proved to be a very efficient and simple approach to control the wall-protein interactions. One of the most extensively studied antifouling polymers are PEG and its grafted copolymers, water soluble polymers with low toxicity and outstanding biocompatibility, which have widely been used to separate the protein, polypeptide and DNA by CE. However, PEG is ineffective to prevent the protein adsorption after several consecutive runs because of the PEG coating is easy to be washed away from the capillary wall due to its high hydrophilicity.
The small molecule dopamine can be spontaneous oxidation to form a sticking polydopamine coating with oxygen over the pH range 7-9. The polydopamine coating coatains catechol and quinine functional groups, which can react with amine or thiol via Michael addition or Schiff base reaction. Therefore, through proper choice of secondary reactants, polydopamine coating can be transformed into surfaces that have specific chemical properties.
In this paper, the antifouling PEG coating, attributed to the firmly anchored onto the capillary surface by sticking polydopamine coating, and was used for protein analysis and dsDNA separation. Working was on the following aspects: 1．Procedure and characterization of polydopamine-graft-PEG coating
Firstly, the terminal hydroxyl groups of the PEG were converted into more reactive primary amino groups. The structure and composition of the amine functionalized PEG was characterized by 1H NMR and FTIR. Then, using a simple yet effective two-step approach, anchored the PEG onto the surface of capillary through
polydopamine coating. During the process, polydopamine-graft-PEG copolymer was formed via Michael addition or Schiff base reaction. The copolymer coating was observed using X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and scanning electron microscopy (SEM). And both of them indicated the formation of the copolymer coating.
2． Polydopamine-graft-PEG coating for protein separation by CE
The PEG coating was anchored firmly onto the capillary surface by polydopamine coating which enhanced the stability of PEG on the capillary wall. The copolymer coating was shown to be capable of stabilizing and suppressing the EOF. Meanwhile, highly efficient and rapid separation of three basic proteins (i.e. Cytochrome C, Lysozyme, Ribonuclease A) has been obtained within a broad pH range. Furthermore, the separation performance of three basic proteins and six proteins mixture using a polydopamine-graft-PEG coated capillary and a commercial capillary was compared. To study the stable performance of polydopamine-graft-PEG coating, the 200 consecutive separations of basic proteins was performed by montoring the separation efficiency and migration time repeatability. The results proved that the polydopamine-graft-PEG coating, providing effective suppression of EOF and minimized adsorption of proteins, was a coating of excellent stability and good properties.
3. Polydopamine-graft-PEG coating for qualitative and quantitative analysis of food proteins by CE
Polydopamine-graft-PEG coating can provide minimized adsorption of proteins and excellent stability. So it has been used to qualitative and quantitative analysis of the three whey proteins: α-lactalbumin, β-lactoglobulin A and β-lactoglobulin B in milk powder. Furthermore, the coated capillary is also well suitable for the analysis of egg white proteins and peanut proteins. The effectiveness of a polydopamine-graft-PEG coated capillary was evaluated in comparison with that of a bare capillary. The results demonstrated the coating has many advantages such as excellent reproducibility of migration times, lower relative standard deviation values and long service life.
4. Polydopamine-graft-PEG coating for dsDNA separation by CE
Polydopamine-graft-PEG and LPA can be potentially applied to separate dsDNA because LPA can provide superior sieving ability. Additionally, the copolymer polydopamine-graft-PEG coating has excellent antifouling ability which is important
to stabilize and suppress the EOF during the separation. The effects of LPA solution concentration, LPA molecular masses and the applied electric field strength on dsDNA sample separation performances were studied in detail. The best separation result was achieved when the 4% (m/v) LPA (4.70 MDa) was applied to separate dsDNA.
Key Words: capillary electrophoresis, DNA separation, protein separation, PEG, polydopamine coating, polydopamine-graft-PEG
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第一章 绪 论
1.1 引言
毛细管电泳是近几十年发展起来的一种应用于生物大分子例如蛋白质、DNA、多肽等领域的分析技术[1, 2]。对蛋白质检测极限浓度的追求、干扰蛋白质检测分析杂质的存在、毛细管壁对被分析物的吸附、被分析蛋白质的变性等等，这些都是毛细管电泳技术急需解决的难题。蛋白质结构的复杂性意味着毛细管电泳技术不仅仅局限于将蛋白质从其他的分析物中分离出来，毛细管电泳技术更重要的任务是对蛋白质其他特性的表征例如：蛋白质分子量、蛋白质的等电点、蛋白质构象的测定、主要氨基酸序列的测定等等。应用毛细管电泳技术时，我们关注的一般是背景电解质的组成以及被高效分离的分析物。毛细管电泳技术分析蛋白质时，管壁对蛋白质的吸附会导致分析效率的降低，甚至无法检测被分析蛋白质的信号峰。
本章主要综述毛细管电泳技术的基本原理、几种基本分离模式的进展以及毛细管电泳技术在蛋白质分离及DNA分离等领域的应用。重点介绍了应用于毛细管内壁抗蛋白质吸附的聚合物涂层以及应用于双链DNA（dsDNA）分离的无胶筛分介质。此外，本章还详细地综述了具有多功能性的聚多巴胺涂层的形成机理及其在各个领域的应用进展。
1.2 毛细管电泳的概述
1.2.1 毛细管电泳的基本原理
图1.1是毛细管电泳仪的简易装置示意图。毛细管电泳仪主要是由高压电源、毛细管、样品检测器、进样及清洗系统、温控系统以及数据采集器等部分组成。其中操作电压一般是控制在5-30 kV的范围。毛细管一般采用的是外壁涂有聚酰亚胺涂层的熔融石英管。毛细管电泳仪中常用的检测器有以下几种：紫外吸收检测器、激光诱导荧光、电化学检测器以及质谱仪等等。
Figure 1.1 Normal instruments of Capillary Electrophoresis [3]
带电粒子置于电场作用中时，会受到电场力（F ）的作用。F 正比于其有效电荷（q ）和电场强度（E ）：
E q
F · = (1.1)
F ——电场力
E ——电场强度
q ——电压
带电粒子在电场力的作用下定向迁移，同时又受到一个与粒子大小、形状、背景电解质粘度等因素有关的粘滞阻力（F’）的作用力。球形粒子F’的大小服从Stokes 定律：
v r F πη6'= (1.2)
F’——介质阻力
r ——球形粒子的半径
η——背景电解质的粘度
v ——电泳的速度
带电粒子匀速运动时，F ='F ，从而有：
πηνr E q 6· = (1.3)
E v
=μ (1.4)
μ——电泳迁移率
由式1.3和1.4得：
πη
μr q 6= (1.5)
1.2.2 毛细管电泳的基本分离模式
随着对毛细管电泳分离介质和分离原理的不断探索，毛细管电泳的基本分离模式也不断增加。
1 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis, CZE ）
毛细管区带电泳是毛细管电泳中最基本同时也是应用最为普遍的一种分离模式。毛细管区带电泳常应用于蛋白质、氨基酸、多肽等带电物质的分离[4]。在毛细管区带电泳中，被分析样品在电场力的作用下，根据各被分离物质的荷质量比间的差异而被依次分离。
2 胶束电动毛细管色谱
（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography, MECC ） 在电泳缓冲溶液中添加一定浓度的表面活性剂，当这个浓度超过临界胶束浓度时，这些表面活性剂会形成带负电荷的胶束。这些带电胶束在电场作用下产生泳动现象。胶束电动毛细管色谱技术就是依据分析物在缓冲溶液水相和胶束相间的相分配差异而进行分离的一种色谱技术。分析物在水相和胶束相中的分配系数不同，经过两相间的多次分配之后，疏水性强的粒子由于与胶束结合比较牢固，洗脱时间较长，从而得以与水溶性较好的粒子分离。MECC 技术与CE 技术在分离原理的基本思想及检测方法方面是一致的。两者之间的差异在于胶束电动毛细管色谱技术中所采用的缓冲溶液包含表面活性剂，且此表面活性剂的浓度大于其临界胶束浓度以胶束的形式存在。
在缓冲溶液中添加一些手性表面活性剂可以提高毛细管电色谱技术的选择性，扩大其应用范围。目前，MECC 技术在电中性的农药杀虫剂分析、食品中长链氨基酸的分析、草本药物中的碳水化合物及酒精含量的分析等方面有着广泛的
应用。此外，
MECC 还将有望应用于组合化学分析领域。但是在蛋白质分析领域，MECC 技术还存在一些不足。MECC 中最常用的表面活性剂为十二烷基磺酸钠（SDS ），一般的蛋白质分子都比较容易束缚在SDS 的表面形成SDS-蛋白质化合
物，从而难以实现分离。
3 毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）
毛细管凝胶电泳是将传统的凝胶电泳技术应用于毛细管电泳领域，完美地结合了两种技术的优点，是一种具有高效率的分离技术[5]。毛细管凝胶电泳是在毛细管内填充聚合物凝胶，这些具有筛孔的筛分介质允许具有相似荷质之比的分析物通过，从而实现对分析物的分离。CGE中常用两种凝胶介质，一种是交联的筛分介质，另一种是非交联的筛分介质，即无胶筛分介质。这两种筛分介质都具有理想的筛分性能，能减少溶质的扩散、限制谱带展宽，得到理想的分离效率[5, 6]。毛细管凝胶电泳技术在基因治疗分析、寡聚核苷酸纯化、蛋白质分子量的测量等方面得到了很好的应用[6]。
4 毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing, CIEF）
CIEF被广泛地应用于研究蛋白质热稳定性、探讨蛋白质与磷酸酯间的相互作用力以及对蛋白质结构的分析等方面。此外，毛细管等电聚焦也应用于对蛋白质的二维结构特征的研究。采用CIEF技术分析蛋白质时，在缓冲溶液里添加30% 的丙三醇，可以改善蛋白质的疏水性，提高分离效率。CIEF在分析结构复杂的异构体及蛋白质如血红蛋白、免疫球蛋白等生物样品方面显示了其独特的优越性[9]。
5 毛细管等速电泳（Capillary Isotachophoresis, CITP）
在毛细管区带电泳中，蛋白质的分离是根据蛋白质在两端电场的作用下迁移速度的差异而分离。相反，而在毛细管等速电泳中，蛋白质的电泳迁移速度却是一致的。蛋白质的分离与缓冲溶液体系有着密切的关系，CITP中有两种电解质，一种是电泳淌度高于任何分离组分的前导介质，另一种是电泳淌度低于任何分离组分的尾随介质。CITP中被分析物的电泳淌度介于两种电解质的淌度之间，以同一速度向前迁移，实现组分的分离。在CITP中，最初，毛细管内的电流大小是由前导离子所决定的，因为前导离子决定了每个区带的离子浓度。电场强度会随着区带的移动而发生变化，并且区带的长度是随着分析物的种类增多而增长。
6 毛细管电色谱（Capillary Electro Chromatography, CEC）
毛细管电色谱是一种新的混合的分离技术。毛细管电色谱综合了毛细管电泳的高效性及液相色谱的高选择性的优点。毛细管电色谱技术有着巨大的发展潜力，特别是在药学和生物医药等领域的分析。毛细管电色谱的分离机理分别含有电泳迁移原理以及色谱固定相的保留机理。
1.3 毛细管电泳在蛋白质分离中的应用
1.3.1 毛细管电泳分离蛋白质的原理
被分析物在毛细管内迁移的速度差异，是毛细管毛细管电泳技术的分离的依据。蛋白质是带有可电离基团的两性生物分子，当蛋白质处于特定的环境中时可以带正电荷或者是负电荷（当环境的pH值高于蛋白质等电点时，蛋白质会带上负电荷，反之则带正电荷）。带电的蛋白质分子在毛细管电泳两端高压电源的作用下发生电泳迁移。各种蛋白质分子所带的电荷差异、体积大小的差异等因素导致了蛋白质在毛细管内的迁移速度的不同。因此，不同的蛋白质得以实现在毛细管内被依次分离、分析和鉴定。
1.3.2 蛋白质的吸附和控制
蛋白质在毛细管内壁的吸附分为可逆吸附和不可逆吸附。如果蛋白质在毛细管固体表面的停留时间很短则可以认为这种吸附为可逆吸附，如果蛋白质在固体表面的吸附时间延长则蛋白质需经历由“疏松状”到“紧密状”或为不可逆的状态。蛋白质与毛细管的吸附最主要是通过静电和疏水性相互作用力。在毛细管电泳中，可逆吸附和不可逆吸附都可能发生。静电相互作用主要依赖于毛细管表面电荷和蛋白质表面电荷的数量，而这两者电荷的多少同时依赖于缓冲溶液的组成和pH值。蛋白质的组成、立体构象、结构的稳定性、电荷数等这些因素都可能影响蛋白质的吸附量。蛋白质的吸附会造成分离效率低、谱带展宽、重现性差、定性定量分析困难甚至无法实现分离等严重的后果。因此，解决蛋白质的吸附是发展毛细管电泳技术的关键。
1.3.
2.1 缓冲溶液的处理
缓冲溶液性质的改变会影响毛细管内壁的状态，可以起到抑制蛋白质在毛细管内壁吸附的目的。目前，缓冲溶液处理法抑制蛋白质的吸附最简单的方法就是极端pH值法。控制缓冲溶液的pH值使其远远高于或远远低于蛋白质的等电点。当缓冲溶液的pH值远远低于蛋白质的等电点时，毛细管内壁的硅羟基不会发生解离，从而避免了通过静电作用吸附蛋白质的可能。当缓冲溶液的pH值远远高于蛋白质的等电点时，蛋白质带负电荷。此时，毛细管内壁的硅羟基几乎全部解离，毛细管内壁呈现带负电荷的特性，静电排斥作用同样起到了抑制蛋白质吸附的目的[10]。然而，采用极端pH值法仍然无法克服毛细管壁与蛋白质之间因疏水等非静电作用造成的吸附。此外，采用极端pH值法存在使蛋白质变性的风险。
缓冲溶液处理以抑制蛋白质的吸附除了采用极端pH值，还可以采用添加剂技术。添加剂技术即在缓冲溶液中添加中性聚合物（聚乙烯醇、聚环氧乙烷、羟
乙基纤维素以及纤维素衍生物等）或者合适的阳离子化合物（溴化十六烷基三甲基铵、聚乙烯亚胺、聚胺类等）。添加的中性聚合物可以屏蔽硅羟基的解离，同时会增加双电层的粘度，从而实现降低电渗流和抑制蛋白质吸附的目的。添加的阳离子化合物可以与蛋白质竞争吸附位点，从而克服或抑制蛋白质样品的吸附[11]。这种方法的优点是简单经济，缺点是添加的许多添加剂不纯，会因此抬高紫外检测的背景，严重者可完全掩盖蛋白质的检测信号。
1.3.
2.2 毛细管内壁的惰化
目前，使用最多同时效果也最理想的方法就是采用管壁的惰化法，即在毛细管内壁涂覆一层聚合物涂层以改变毛细管内壁的性状，一般是将毛细管内壁的疏水性改变成亲水性。聚合物涂层可以通过物理吸附或化学作用键合在毛细管内壁，有些聚合物也可以通过物理-化学联合作用键合在毛细管内壁。每种键合方法都有其各自的特点：物理涂覆是聚合物通过较弱的作用力（氢键、静电作用、疏水作用等）吸附在毛细管内壁，操作简单，涂层可再生，同时也存在涂层使用寿命短的特点；化学共价涂层是聚合物通过化学反应键合在毛细管内壁，屏蔽毛细管内壁的硅羟基，具有涂层稳定性好，使用寿命长，分离效率高等优点，同时也存在制备过程繁琐，工艺复杂等特点[10-12]。物理涂层制备工艺简单，涂层可再生，但是其使用寿命远小于共价涂层；共价涂层虽然稳定性好，涂层使用寿命长，但是其存在制备工艺繁琐的缺点。因此，没有哪种涂覆方法是完美的，每种方法都有其各自的优缺点，都有其各自发展的空间。
管壁惰化采用的涂层材料一般有中性聚合物、阳离子聚合物以及两性化合物。目前，使用最多的管壁惰化聚合物主要有以下几种：
聚乙二醇（PEG/PEO）
PEG既可以通过化学键合在毛细管内壁[13-15]，也可以通过物理作用吸附在毛细管内壁[16-18]。共价键合的长链PEG涂层能在很广的pH值范围内有效控制电渗流的大小以及抑制蛋白质的吸附，涂层使用寿命长。从而实现对酸碱混合蛋白质以及多肽样品的高效分离。但是短链的PEG-600涂层在高pH环境下，蛋白质的分离效率急剧下降，蛋白质峰变形[13]。此外，通过物理吸附作用（氢键作用）吸附在毛细管内壁的PEG涂层也可以在较广的pH范围内实现对蛋白质的分离[16-18]。研究发现PEG涂层的分子量越高，管壁上的PEG就越难解吸附，形成的涂层在动力学上就越稳定[16, 17]。但是，这种物理涂层在高pH值环境下不稳定，难以实现对蛋白质的有效分离[18]。
聚丙烯酰胺 (PAM)
拥有良好亲水性能的聚丙烯酰胺可以通过化学键合或物理涂覆的方法结合在毛细管的内表面。PAM涂层可以有效地改善毛细管内壁的疏水性，从而起到抑制蛋白质吸附及控制电渗流的作用。丙烯酰胺通过原位聚合在毛细管内表面形成一层薄的、结构规整的聚丙烯酰胺涂层。共价键合的PAM涂层能够很好地控制电渗流的大小并有效地抑制蛋白质的吸附[19, 20]。Huang等人通过活性自由基聚合得到表面平滑、规整、性能稳定的聚丙烯酰胺涂层，能有效地实现对碱性蛋白质的分离 [21, 22]。此外，预聚体交联聚合法也可以制备交联的PAM涂层。制备过程如下：首先，用1 M的NaOH水溶液冲洗毛细管1 h，水洗后用1%（m/v）的醋酸溶液冲洗2 h；其次，在清洗后的毛细管内填充含1%硅烷化试剂的溶液，两端密封后在室温下反应至少24 h；最后，在硅烷化后的毛细管内填充丙烯酰胺溶液，两端密封后将毛细管置于高温下反应18 h，在此过程中交联反应和键合反应同时进行，从而成功地制备了能快速有效分离酸性蛋白质和无机阴离子的高交联度的聚丙烯酰胺涂层[23]。直接键合法可以免去预处理等繁琐的步骤，制备过程简单。具体制备过程如下：首先，将硅烷交联剂聚甲基丙烯基硅二醇铺展在毛细管内表面，引发交联反应，在毛细管内表面形成一层稳定的聚丙烯基硅二醇亚层。其次，在毛细管内通入丙烯酰胺溶液，利用暴露在毛细表面的乙烯基进一步引发丙烯酰胺的交联聚合。最后，除去毛细管内未反应的丙烯酰胺溶液。随后在毛细管内填充pH=10的甲醛溶液，在甲醛的作用下，交联的聚丙烯酰胺接枝在毛细管内表面。接枝的聚丙烯酰胺涂层能高效地分离酸碱蛋白质、多肽和DNA分子（106 plates/m）。并且涂层非常稳定，在连续分离600次后，蛋白质的迁移时间和分离效率几乎不变[24]。
聚乙烯醇（PV A)
共价键合的PV A涂层能高效地分离碱性蛋白质，连续分离1000次后，蛋白质迁移时间的相对标准偏差（RSD）小于1.2%，分离效率几乎不变[25]。
PV A不仅能以化学键合的形式，也能以物理吸附的形式涂覆在毛细管壁上[26, 27]。Duchet等人采用含有PV A（0.05%, w/w）的缓冲溶液冲洗毛细管。冲洗过程
中PV A通过氢键等物理作用吸附在毛细管内表面，这种动态涂覆的PV A涂层在很广的pH值范围内都能有效地抑制电渗流[27]。
聚N, N-二甲基丙烯酰胺（PDMA）
用PDMA溶液冲洗毛细管15 min，随后便可在毛细管内壁形成一层聚N, N-二甲基丙烯酰胺涂层。在pH=4.4、8.4的缓冲溶液介质中，PDMA涂层能有效地稳定电渗流并抑制蛋白质的吸附，但是在连续分离50次后，分离效率急剧下降，迁移时间的重复性也变差。这是因为PDMA涂层使用多次后，抑制蛋白质吸附的
能力减弱，蛋白质在毛细管内壁形成了不可逆吸附[28]。PDMA中甲基的存在增加了涂层的疏水性，降低了抗蛋白质吸附能力，因而一般利用PDMA的共聚物（如PDMA-b-PEG-b-PDMA）来改善PDMA的抗蛋白吸附性能[29]。
除了以上提到的最常用的几种聚合物涂层外，还有其他种类的聚合物（带电聚合物、聚电解质等）也被广泛应用，例如聚胺[30-32]、N, N-二甲基丙烯酰胺和乙基吡啶丙烯酰胺的共聚物（DMA-EpyM）[33, 34]、以及阳离子化的羟乙基纤维素[35]和阳离子化的支链淀粉[36]等等。这些聚合物也被应用于毛细管电泳分离蛋白质，并取得了理想的分离效果。
1.4 毛细管电泳在DNA分离中的应用
1.4.1 DNA无胶筛分介质
毛细管电泳技术不仅在蛋白质的分析领域得到广泛的应用，在DNA的分离和测序领域同样得到了理想的应用效果。其中，毛细管凝胶电泳和无胶筛分电泳这两种电泳技术是在DNA的分离和测序中用得最多的技术。这两种电泳技术的区别在于毛细管内筛分介质的不同。前者以交联凝胶为筛分介质，而后者一般是以非交联的线性高分子聚合物溶液为筛分介质。在过去的几十年中，毛细管凝胶电泳由于其拥有分离效率高、使用寿命长、重复性好等优点在DNA分离和测序领域得到了广泛的应用。然而，后期发展起来的无胶筛分电泳拥有凝胶电泳无法比拟的优点（制备工艺简单、操作简便、筛分能力强等）而备受科学家的青睐。
无胶筛分介质的粘度、筛分能力以及动态涂覆能力等因素直接影响了筛分介质对DNA的分离效果。一些合成高分子拥有很好的筛分能力和动态涂覆能力在DNA分离领域得到很好的应用。下面对于常用的一些无胶筛分介质做简要的综述。
均聚物
线性聚丙烯酰胺（LPA）具有良好的筛分性能，很早开始就应用于DNA分离的高分子聚合物[37, 38]。但是由于其存在自身粘度大，自涂覆能力差等缺点。PDMA 拥有良好的筛分能力和自涂覆能力，能有效地抑制电渗流，在DNA分离领域得到广泛的应用[39]。
具有良好筛分能力的聚乙氧基丙烯酰胺（PAAEE）、聚丙醇基丙烯酰胺（PAAP）、聚N-羟乙基丙烯酰胺（PHEA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚环氧乙烷（PEO）也被广泛地应用于DNA的分离[40-45]。PVP筛分介质能够有效地应用
于DNA的分离及测序：检测的碱基数目多，分离度大并且跟李效果高[43]。高分子量PEO筛分介质能获得有效的DNA分离，但是分离度较低，提高PEO的浓度能够提高DNA分离的分离度，但是随着介质浓度增加的同时会伴随介质粘度增大等问题的出现[42]。添加低浓度的纤维素衍生物（0.5%），LPA涂层能在17 min 内有效地分离大片段1200 bp的碱基对，而添加高浓度的纤维素衍生物（0.7%），能分离50-1000 bp的碱基对，分离度非常高（106 plates/m）[45]。Tian等考察了PEO、HEC、HPC、LPA及PDMA等筛分介质分离DNA的性能。实验发现在高pH值的环境下，含HEC的缓冲溶液能有效地降低EOF，抑制DNA的吸附，能对60-587 bp 的DNA片段有效分离。且其对DNA的分离效果优于PEO。在相同的分离条件下，HPC溶液的粘度远远低于HEC的溶液粘度。此外，HEC链的硬度远远优于PEO、LPA、PDMA，具有更强的相互缠绕能力和筛分能力[46]。
共聚物
共聚物包括以下几种：
无规共聚物：结合PAM的高效筛分能力和PDMA的良好自涂覆能力，能够合成一系列的P（AM-co-DMA）无规共聚物。虽然共聚物能结合各均聚物的优点，但是无规共聚物中PDMA的浓度和分子量会影响共聚物的相容性。共聚物的相容性同时又会影响筛分介质对DNA的分离效率。研究表明采用2.5%（w/v）PAM （2.2 x 106）—0.2%（w/v）PDMA（8000）组分的无规共聚物能得到最理想的相容性，充分地结合PDMA的动态涂覆能力及PAM的优异筛分能力，高效地分离DNA（106 plates/m）[47]。
接枝共聚物：接枝共聚物也常用作筛分介质分离DNA。接枝共聚物HEC-graft-PDMA具有良好的自涂覆能力及筛分性能，从而能有效地应用于双链DNA（dsDNA）的分离[48]。实验发现在相同浓度条件下，其中较低接枝密度的HEC-graft-PDMA对dsDNA有较高的分离度。但是聚合物溶液粘度也较大、分离时间也随之延长[48]。Bokias将接枝共聚物LPA-graft-PNIPAM用坐DNA分离的筛分介质。研究发现高分子量的LPA接枝少量的低分子量的PNIPAM能在1 h 能完成对800 bp DNA进行的碱基对分离，分离度达到0.5。此外，研究还表明此类新型的接枝聚合物具有明显的热粘度效应，接枝共聚物的粘度随着温度的变化有明显的改变。低温下聚合物粘度较低方便毛细管填柱，而在高温下，聚合物的粘度增加并且筛分能力提高。因而，选取合适的温度一方面利于进样操作，另一方面利于DNA的分离[49]。
嵌段共聚物：将具有良好的筛分能力和自涂覆能力的嵌段共聚物PEO99PPO69PEO99用作dsDNA分离的筛分介质。能在很短的时间将双链DNA的11个片段有效分离。PEO99PPO69PEO99的存在形态可以通过调节体系的温度和浓度
来控制，当温度低于15 ℃，聚合物的浓度为21.2%时，体系的粘度非常低（低于50 cP），聚合物形成胶束结构，形成具有一定大小的网络结构，利于dsDNA的分离（RSD小于2%）[50]。
混合物
混合物是另一种被广泛研究的筛分介质，通过聚合物的混合可以结合各种聚合物的优点进一步提高聚合物的筛分能力。
不同分子量HEC的混合物被成功地用于DNA的分离[51]。Yueng等用不同分子量的PEO混合物分离dsDNA[52]和单链DNA（ssDNA）[53]。将不同分子量的PAM 混合，在短时间内分离的DNA片段范围达1300 bp，且分离度和分离效率都非常理想[54]。
此外，由两种或两种以上聚合物相互贯穿而形成的准聚合物网络也可以用于DNA的分离[53, 55]。互穿聚合物网络是由非交联的多种聚合物相互贯穿而成的，聚合物相互贯穿而形成均相的共混物。避免了相分离的现象，同时又结合了不同聚合物的各优良性能具有优异的筛分性能[55]。准互穿聚合物网络其实也属于一类混合物，但又不同于简单混合物，具有简单混合物无法比拟的优点。Song等人将具有良好筛分能力的线性聚丙烯酰胺和具有良好涂覆能力的聚N, N-二甲基丙烯酰胺形成的准互穿聚合物网络用作dsDNA的分离介质。研究发现由低分子量LPA优于高分子量LPA和PDMA组成的准互穿聚合物网络对dsDNA链段的分离度[55]。
1.5 聚多巴胺涂层的形成原理及其应用进展
多巴胺又名4（2-乙胺基）苯-1, 2-二酚（Dopamine, DA），是一种可以用来帮助细胞传送脉冲的神经传导物质。多巴胺在治疗帕金森氏病[56-60]及阿尔茨海默氏症[61]中起着非常重要的作用，从而引起了人们的广泛关注。
目前，对聚多巴胺涂层的研究是一个热点，这种涂层是受生物蚌类的启发而产生。聚多巴胺是一种类似蚌类分泌的粘性蛋白，它能够在各种有机和无机材料表面形成一层薄的、强粘性的涂层[62]。此外，聚多巴胺不仅拥有强粘性而且富含各种官能团，可以进一步转化成各种功能性表面。例如：将涂有聚多巴胺涂层的各种形状、材质的物体浸渍在金属盐溶液里，一段时间后能自发在涂层上面沉淀一层金属层；选择合适的聚合物能将聚多巴胺涂层转变为具有特殊化学性能的表面。
1.5.1 聚多巴胺涂层的形成机理及其表征
1.5.1.1 聚多巴胺涂层技术是一种仿生技术
聚多巴胺涂层技术起源于生物蚌类分泌物的启发。Coyne 等人[63]研究发现蚌类能够分泌一种可以粘附在各种材料表面的粘性蛋白。Lee 等人认为这种粘附性能与粘性蛋白的氨基酸组成成分有着非常重要的关系。形成粘性蛋白的主要组分是含有邻苯二酚基团的左旋多巴（Levodopa, DOPA ）和含有氨基基团的赖氨酸
[64]。这两种组分相互反应形成具有强粘性的物质，其中起关键作用的是两种组分中的邻苯二酚以及氨基基团。而能够自发氧化形成聚多巴胺的多巴胺也含有同样的官能团（如图1.2），此外，多巴胺通过氧气自发氧化聚合而成的聚多巴胺也能很好地粘附于各种有机或无机材料表面。
聚多巴胺涂层技术不仅仅是受生物蚌类分泌物的启发，瘀伤的香蕉给这种技术带来更直接的启示。在日常生活中吃的水果——香蕉中富含这种生物分子多巴胺，当香蕉开始变质的时候，多巴胺能自发氧化成聚合物，这种聚合物通过粘连纤维素和其他的纤维组织以固定开始变质的组织，同时能够减少细菌的入侵，减缓香蕉的变质过程，这种固定作用与聚多巴胺涂层技术非常相似[65]。
OH OH NH 2NH 2OH OH
NH 2
NH 2NH 2NH 2NH 2NH 2NH 2NH 2
NH 2NH 2NH 2NH 2
NH 2NH 2NH 2OH OH HO
HO OH OH HO
HO OH OH OH
OH
OH OH OH OH HO HO OH OH OH OH NH 2
A
B Figure 1.2 (A) Schematic illustration of mussels’ adhesive protein; (B) Schematic illustration of
dopamine
1.5.1.2 聚多巴胺涂层的形成机理
2007年，美国西北大学的Lee 等[62]报道了将少量的多巴胺溶解在10 mM 的Tris-HCl pH=8.5的缓冲液里，然后将所需涂层的材料浸渍在此多巴胺溶液里，在氧气的作用下自发氧化聚合形成聚多巴胺。聚合过程示意图如图1.3：
Figure 1.3 Possible structural evolution and polymerization mechanism of dopamine, and organic ad-layer formation mechanisms
在碱性环境及氧气的作用下多巴胺中的邻苯二酚基团去质子化，氧化成多巴胺-苯醌[62, 66, 67, 68]，这步反应涉及到酚与醌在水介质中存在的平衡过程，在碱性条件下，平衡向醌方向移动[67]。因此，碱性环境有利于多巴胺的自发氧化反应。随后多巴胺-苯醌发生分子内环化形成leukodopaminechrome，leukodopaminechrome分子可进一步氧化形成粉红色的中间产物dopaminechrome，通过观察多巴胺碱性溶液的颜色变化（无色迅速变成粉红色）可以得知此步反应非常迅速。但是粉红色的dopaminechrome不稳定，会进一步发生氧化重排反应生成5, 6-二羟基吲哚。5, 6-二羟基吲哚发生分子间、分子内重排，交联形成深褐色的多巴胺氧化聚合物——聚多巴胺。这种聚合物在水环境中类似蚌类分泌的粘性蛋白，具有很强的粘附性。Bernsmann[69]等人采用X射线光电子能谱（XPS）分析沉淀在二氧化硅表面的多巴胺氧化产物，发现这种沉淀物的组成元素与黑色素的组成元素是一致的。这种聚合物涂层在酸碱条件下（pH=1.0-12.0）都很稳定，唯有在强碱条件下（pH=13.0）才能够将聚多巴胺从材料表面去除。
Lee等[62]研究发现将所需涂层的材料一直放置在同一多巴胺溶液里，获得一个稳定厚度的聚多巴胺涂层需要15-20小时；而Bernsmann[69]等人研究发现如果将所需涂层的材料多次放入刚配置的新鲜的多巴胺溶液里，则在15-20分钟就能达到一个稳定厚度的涂层。Bernsmann等人认为产生如此巨大差异的原因是多巴胺单体或多巴胺氧化的中间产物在聚多巴胺自发沉淀在物体表面的过程中起了特别重要的作用。将涂层物质多次放入刚配置的多巴胺溶液里能够提供引发聚合物沉淀的引发剂——多巴胺单体或者聚合过程的中间产物[69]。
1.5.1.3 聚多巴胺涂层的表征
聚多巴胺涂层的表征通常采用以下几种方法：X-射线光电子能谱（XPS）[62,69,70]、飞行时间二次离子质谱法（TOF-SIMS）[62]、傅里叶变换红外光谱法（FTIR）和拉曼光谱（Raman）[71]等等。XPS表征聚多巴胺涂层可以得到C、N、O三种元素的光电子信号峰（C：～285eV；N：～389.5eV；O：～532.5eV）。TOF-SIMS 表征聚多巴胺涂层的原子组成，图谱上显示存在来自于聚多巴胺的碎片特征峰：5, 6-二羟基吲哚的三聚体、二羟基及苯环等基团的特征峰。IR和Raman也可以用于表征聚多巴胺涂层的结构，聚多巴胺的红外谱图只存在强烈的芳环特征峰（约1615cm-1）和邻苯二酚中羟基的特征峰（约1580cm-1）。
此外，一般采用透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）[70, 72, 73]和原子力显微镜（AFM）[62, 70, 73]分析聚多巴胺涂层的微观形貌及涂层厚度。
1.5.2 聚多巴胺涂层的应用
聚多巴胺不仅具有强粘附性，能够粘附在各种有机和无机材料表面，而且还含有丰富的官能团能够通过迈克尔加成反应或希夫碱反应接枝具有-SH、-NH2等基团的聚合物[68, 74]以及一些生物分子[75]，从而在聚多巴胺涂层表面形成有机物质层改善材料的表面性能。此外，聚多巴胺涂层与金属有很好的亲和性可以在聚多巴胺涂层上面涂覆一层金属层修饰涂层材料[62, 71]，扩大其实际应用领域。1.5.2.1 聚多巴胺涂层的形成
1. 有机材料上聚多巴胺涂层的形成
聚多巴胺能粘附在有机材料表面的机理目前还不清楚，可能是通过共价键键合在有机材料的表面[67]。Lee[62]等将各种合成聚合物：聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯等十几种有机聚合物分别浸渍在多巴胺的碱性溶液里。反应一段时候后用XPS表征各物体表面，结果表明各物质表面均涂覆一层聚多巴胺涂层。此外，聚多巴胺涂层还可以在聚乳酸[73]，聚吡咯[76]等有机聚合物的表面上形成，赋予聚合物表面强的粘附性能。
在碱性溶液中，多巴胺能在各种疏水性微孔膜（如：聚乙烯（Polyethylene）[77]、聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethene）[78]、聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene difluoride）[70]）表面自发地形成一层粘附性的涂层。可以很好地改善多孔薄膜的亲水性、附着性以及离子交换能力。此外，将多孔尼龙膜浸渍在多巴胺的碱性溶液里。反应一段时间后在多孔尼龙膜表面能够自发形成一层黑色的多功能性的聚多巴胺涂层[79]。聚多巴胺修饰后的多孔尼龙膜具有多功能性能够进一步接枝各种聚合物，形成孔径可控、结构规整、具有环境敏感性的多孔尼龙膜[79]。Ye等人[80]首次采用表面引发开环异位聚合（SI-ORMP）的方法制备了一种低表面能