紫外可见分光光度法
基本原理和应用方法
1) UV-Vis
2) UV-Vis 3) (UV)为四大波谱之一，是签定许多化合物，尤其是有机化合物的重要
一、分子吸收光谱的形成
过 程：运动的分子外层电子--------吸收外来能量(光、电、热等)------产生电子能级跃迁-----分子吸收谱。 能级组成：除了电子能级(Electron energy level)外，分子吸收能量时将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动能
级(Vibration energy level)和转动(Rotation energy level)能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振-转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化?E 为各种形式能量变化的总和：
r v e E E E E ?+?+?=?
其中?Ee 最大：1-20 eV; ?Ev 次之：0.05-1 eV; ?Er 最小：<0.05 eV
可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级，在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。
不同物质其结构不同。或者说，分子能级的能量(各种能级能量总和)或能量间隔不同，因此不同物质将选择性地吸收不同能量的外来辐射，这是UV-Vis 定性分析的基础；
定性分析具体做法是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度(即吸光度A)，以吸光度A 为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线，据吸收曲线的特性(峰强度、位置及数目等)研究分子结构。
各种能级的高低顺序是：σ<π< n <π*<σ*；几种可能的跃迁包括：σ-σ*；σ-π*；π-σ*；n-σ*；π-π*；n-π*六种。但由于与σ成键和反键轨道有关的四种跃迁：σ-σ*；σ-π*；π-σ*和n-σ*所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。只有n-π*和π-π*两种跃迁的能量较小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，是我们研究的重点。
二、几个概念
a) 生色团(Chromogenesis group)：分子中含有非键或π键的电子体系，能吸收外来辐射时并引起π-π*和n-π*跃迁，可产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。
b) 助色团(auxochromous group) ：含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团，称之为助色团。
c) 红移或蓝移(Redshift or blueshift)：在分子中引入的一些基团或受到其它外界因素影响，吸收峰向长波方向(红移)或短波方向(蓝移)移动的现象。
三、无机物跃迁类型
一些无机物也产生紫外-可见吸收光谱，其跃迁类型包括p-d 跃迁或称电荷转移跃迁以及d-d, f-f 跃迁或称配场跃迁。 电荷转移跃迁(Charge transfer transition)
一些同时具有电子予体(配位体)和受体(金属离子)的无机分子，在吸收外来辐射时，电子从予体跃迁至受体所产生的光谱。
SCN
Fe SCN Fe L M L M h b n h b n -?→?--?→?-++-
-+--+23)1()1(νν εmax 较大(104以上)，可用于定量分析。
对于六价铬Cr(VI): 在无特定高浓度的钼、钒和汞干扰物质下之酸性溶液中，六价铬与二苯基二氨
(Diphenylcarbazide)反应生成紫红色物质，此反应相当灵敏，在波长540 nm下每摩尔铬原子约有40,000吸收指数，产生之紫红色物质在波长540 nm测其吸光度定量之。
配场跃迁(Ligand field transition)
过渡元素的d或f轨道通常情况下为简并轨道(Degeneration orbit)。当与配位体配合时，轨道简并解除，d或f轨道发生能级分裂，如果轨道未充满，则低能量轨道上的电子吸收外来能量时，将会跃迁到高能量的d或f轨道，从而产生吸收光谱。
一般来说，配场跃迁的吸收系数εmax较小(102)，很少用于定量分析；多用于研究配合物结构及其键合理论。
四、吸收光谱的测量-----Lambert-Beer 定律
当强度为I0的入射光束(Incident beam) 通过装有均匀待测物的介质时，该光束将被部分吸收，未被吸收的光将透过(Emergent)待测物溶液以及通过散射(Scattering)、反射(Reflection),包括在液面和容器表面的反射)而损失，这种损失有时可达10%，那幺，
I0=Ie + Is +Ir
因此，在样品测量时必须同时采用参比池和参比溶液扣除这些影响。
Lambert-Beer定律
当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即A=kbc
k为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。
当浓度以g/L表示时，称k为吸光系数，以a表示，即
A=abc
当浓度以mol/L表示时，称k为摩尔吸光系数，以表示，即
A=εbc
ε比a更常用。ε越大，表示方法的灵敏度越高。ε与波长有关，因此，ε常以ελ表示。
偏离L—B定律的因素
样品吸光度A与光程b总是成正比。但当b一定时，A与c并不总是成正比，或者说会偏离L-B定律！这种偏离主要由样品性质和仪器性能决定。
1、样品性质影响
a)待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收能力发生变化---ε变化；
b)试液中各组份的相互作用，如缔合、离解、光化反应、异构化、配体数目改变等，会引起待测组份吸收曲线的变化；
c)溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响；
d)胶体、乳状液或悬浮液对光的散射损失。
2、仪器因素
仪器性能会影响光源稳定性、入射光的单色性等。
a)入射光的非单色性：不同光对所产生的吸收不同，可导致正或负偏差。
设由λ1和λ2两种波长组成的入射光，将Beer定律应用于该波长。
在λ1处：
bc
e I I bc I I A 11
1,0111,01lg εε===或 同理，在λ2处：
bc
e I I bc I I A 22
2,0222,02lg εε===或 综合前两式，得
bc bc I I I I I I I I A 211010lg lg 2,01,02,01,0212
,01,0εε--++=++=
当λ1=λ2时，或者说当ε1=ε2时，有A=ε1bc, 符合L-B 定律；
当λ1≠λ2时，或者说当ε1≠ε2时，则吸光度与浓度是非线性的。二者差别越大，则偏离L-B 越大；
当ε1>ε2，测得的吸光度比在“单色光” λ1处测得的低，产生负偏离；反之，当ε1<ε2，则产生正偏离。
b)谱带宽度与狭缝宽度：“单色光”仅是理想情况，经分光组件色散所得的“单色光”实际上是有一定波长范围的光谱带(即谱带宽度)。单色光的“纯度”与狭缝宽度有关，狭缝越窄，它所包含的波长范围越小，单色性越好。
五、仪器组成
紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成。
1、光源
对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化不大。
分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。
热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯，钨及碘钨灯：340~2500 nm,辐射能量与施加的外加电压有关，在可见光区，辐射的能量与工作电压4次方成正比。这类光源的光电流与灯丝电压的n 次方（n >1）成正比。因此必须严格控制灯丝电压，仪器必须配有稳压装置。
气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯， 160~375nm 连续光源。氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，它是紫外光区应用最广泛的一种光源，其光谱分布与氢灯类似，但光强度比相同功率的氢灯要大3~5倍。
2、单色器(Mnochromator)：
单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散组件、聚焦组件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散组件，起分光的作用。单色器的性能直接影响入射光的单色性，从而也影响到测定的灵敏度度、选择性及校准曲线的线性关系等。能起分光作用的色散组件主要是棱镜和光栅。
棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于350 ~ 3200 nm 的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 ~ 4000nm ，即可用于紫外、可见和近红外三 个光域。
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重迭而产生干扰。
入射、出射狭缝，透镜及准光镜等光学组件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用。狭缝的大小直接影响单色光纯度，但过小的狭缝又会减弱光强。
3、吸收池(Cell)：
吸收池用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃材料两种。石英池适用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。在高精度的分析测定中（紫外区尤其重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。
4、检测器：
检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。
常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。
? 硒光电池：在300~800nm 波长内范围敏感，尤其是500~600nm 最为敏感，这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中。
? 光电管：据阴极上涂渍的光敏物质不同，对不同波长范围的敏感度不同：Sb+Cs(210~625nm); Ag+Cs 2O(625~1000nm) 光电倍增管：光电倍增管是检测微弱光最常用的光电组件。光电管中有多个打拿阴极，阴极电子数不断增加，因而其灵敏度最高，比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。
5、信号指示系统
它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。
特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。
六、分析条件选择
1仪器测量条件
由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。
当相对误差?c/c最小时，求得T=0.368或A=0.434。即当A=0.434时，吸光度读数误差最小！
可见，吸光度测定应控制在0.434左右。通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.15~1.00范围内。2反应条件选择
a)显色剂的选择原则：使配合物吸收系数最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相
差大等。
b)显色剂用量：配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制。
c)溶液酸度：配位数和水解等与pH有关。
d)显色时间、温度、放置时间等。
3参比液选择
●溶剂参比：试样组成简单、共存组份少(基体干扰少)、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比；
●试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比(不加待测物)；
●试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，采用试样作参比(不能加显色剂)；
4干扰消除
●控制酸度：配合物稳定性与pH有关；
●选择掩蔽剂
●合适测量波长
●干扰物分离
七、定量分析
1、单组份定量方法
1) 标准曲线法：通过配置一系列的Cr和二苯碳酰二井显色的标准溶液系列，在546nm处建立工作曲线，然后用该曲线分析和二苯碳酰二井显色的样品萃取溶液即可得到Cr（VI）的浓度。
2) 标准对比法：是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为C s的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由A x=kc x
求出c x
该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且Cx与Cs大致相当时，才可得到准确结果。
具体做法：将a视为干扰组份，现要测定b组份。
a)分别绘制各自的吸收曲线；
b)画一平行于横轴的直线分别交于a组份曲线上两点，并与b组分相交；
c)以交于a上一点所对应的波长λ1为参比波长，另一点对应的为测量波长λ2，并对混合液进行测量，得到：
A1=A1a + A1b + A1s
A2 =A2a + A2b + A2s
若两波长处的背景吸收相同，即A1s= A2s
二式相减，
?A=(A2a- A1a)+( A2b- A1b)
由于a组份在两波长处的吸光度相等，因此，
?A=( A2b- A1b)=(ε2b-ε1b)lc b
可见，吸光度差?A与待测物浓度成正比，从中可求出c b
同理，可求出c a。