微生物限度检验
本章提供了从原材料到成品的试验，包括需氧微生物数量的预测和所有药物条款中规定的微生物种类的预防试验。假如自动化的方法经验证和现在行方法等效或有更好的结果，可以取代现在的试验。在准备和实验中，处理样品时遵守无菌操作。除非有特别说明，样品简单“培养”的地方，应把容器放在30℃--35℃的空气中恒温培养24—48小时。术语“生长”经常用在此处，换言之，指明微生物的存在和预测增殖。
预备试验
在本章实验中实验结果的验证提供了大量充分的论证，用于试验的样品本身在实验条件下不限制可能存在的微生物的生长。因而，用固定成分做试验的预备和环境的需求，接着分别用金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌，铜绿假单孢菌和沙门菌接种检验材料的稀释样品中。可以通过加1毫升不少于10ˉ3浓度的肉汤培养24小时的微生物的稀释液到实验材料的第一步稀释液（PH7.2的磷酸盐缓冲液，大豆酪蛋白消化物培养基或乳糖液状培养基）中和下面的实验过程来实现。在有关培养基中没有微生物生长，检验内容无效，需要变更程序，包括（1）对剩余的相同数量的实验材料增大稀释液的体积，或（2）在稀释液中掺入适宜的灭活剂，或（3）通过（1）（2）的共同作用，使接种物能够生长。下面是一个配料和他们的聚合物的例子，他们可以加到培养基中灭活样品中的抑菌物质：大豆蛋黄素（卵磷脂）。0.5%；聚山梨脂20，4.0%。作为比较，重复上面描述的实验，用液体酪蛋白消化物--大豆蛋黄素—聚山梨脂20培养基来验证实验材料中存在的防腐剂或其他抑制剂的灭活作用。如果抑菌物质存在样品中并且是可溶的，适宜的经验证的程序可以用于薄膜过滤技术（样品的无菌实验）中。
如果加了适量的灭火剂和增大了稀释液体积，仍不能恢复上面描述和不适用于薄膜过滤技术中物品的培养基的活力，能假定分离接种微生物的失败原因可归于产品的杀菌活力。该信息用于显示物品不可能被给定的微生物种类污染。为了确立物品的抑菌谱和杀菌活力，应继续监测。
缓冲液和培养基
培养基可以按下面的准备，或者假若脱水培养基是有供货商或分销商制备，可以被应用，他们与给定比例获得的培养基想比有相似的成分。
用给定的比例成分制备培养基，在水中溶解可溶性固体物，如果需要，加热溶解完全，使用的时候加盐酸或氢氧化钠到溶液中是培养基中的PH适宜。在25±2℃测定PH值。
配方中含琼脂时，使用含水量不超过15%的琼脂。配方中需用水时，使用纯水。
PH7.2盐酸缓冲液
原液——在1000毫升容量瓶中用500毫升水溶解34克磷酸二氢钾，加氢氧化钠（约175毫升）调PH到7.2±0.1，加水到体积线，混匀。分装后灭菌。冷藏储存。用的时候，用水按1：800稀释原液，灭菌。
培养基
除非有其他说明，培养基应该在高压蒸汽灭菌器（见无菌中的蒸汽灭菌法）内加热灭菌，灭菌时间要参考灭菌体积。
1
在96048°-50°的水浴中加热30
分钟使溶解完全。加40毫升吐温20，混匀，按需要的分装。
2
灭菌后PH：7.3±0.2。
3，液体大豆蛋黄素培养基
参照无菌检测下大豆蛋黄素消化物培养基的配制。
4
混匀，加热沸腾1分钟，并快速搅拌使溶解。
灭菌后PH值：7.4±0.2。
5，Baird–Parker
加热并快速搅拌，沸腾1分钟。灭菌，冷却到40°—50°，加入10毫升亚碲酸钾溶液（1：100）和50毫升蛋黄乳液。轻摇混匀，倒入盘子中。（蛋黄乳液：对整个鸡蛋外壳消毒，无菌打开鸡蛋，把蛋黄分离到一无菌量筒中。加无菌盐水TS，得到一个3：7的盐水蛋黄液。加到一无菌搅拌器中，高速混匀5秒钟。）
灭菌后PH值：6.8±0.2。
6，Vogel–Johnson 琼脂培养基
煮沸固体溶液1分钟。灭菌，冷却到45°—50°，加入20毫升无菌亚碲酸钾溶液（1：100）。灭菌后PH值：7.2 ± 0.2.
7，溴棕三甲铵琼脂培养基
在水中溶解固体组分，加丙三醇。加热沸腾1分钟，并快速搅拌使溶解。
灭菌后PH值：7.2 ± 0.2.
8，假单胞菌属琼脂培养基（用于氟化荧光素的检出）
在水中溶解固体组分，加丙三醇。加热沸腾1分钟，并快速搅拌使溶解。
灭菌后PH值：7.2 ± 0.2.
9，假单胞菌属琼脂培养基（用于绿脓菌素的检出）
在水中溶解固体组分，加丙三醇。加热沸腾1分钟，并快速搅拌使溶解。灭菌后PH值：7.2 ± 0.2。.
10，乳糖液状培养基
灭菌后尽可能快的冷却。
灭菌后PH值：6.9 ± 0.2.
11，流体亚硒酸盐-胱氨酸培养基
最终pH: 7.0 ± 0.2.
混匀，加热溶解。在流动的蒸汽中加热15分钟，不可以灭菌。
12，液体Tetrathionate 培养基
加热固体溶液至沸腾。在使用的时候，加入配制好的碘液20毫升（在20毫升水中溶解5克碘化钾和6克碘）。接着加入10毫升亮绿溶液（1：1000），混匀。加入亮绿溶液后不可以加热培养基。
13，亮绿琼脂培养基
煮沸固体溶液1分钟。临用前灭菌，融化培养基，倒入培养皿中，允许冷却。
灭菌后PH值：6.9 ± 0.2.
14,木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂培养基
最终：pH: 7.4 ± 0.2.
回旋摇动加热固体和水的混合物到液体沸腾。不可以过热或灭菌。立即转入一水浴容器中维持水温在50左右，培养基一冷却就到入培养皿中。
15,亚硫酸铋琼脂培养基
最终pH: 7.6 ± 0.2.
回旋摇动加热固体和水的混合物到液体沸腾。不可以过热或灭菌。立即转入一水浴容器中维持水温在50左右，培养基一冷却就到入培养皿中。
16，三糖-铁-琼脂培养基
灭菌后PH：7.3 ± 0.2.
17，麦康基琼脂培养基
加热固体和水的混合物沸腾1分钟使溶解。
灭菌后PH：7.1 ± 0.2.
18，肠杆菌科曙红亚甲蓝琼脂培养基
在水中溶解动物胶胰酶消化物，磷酸氢二钾和琼脂，可以冷却。仅仅在使用前，熔解胶状琼脂培养基，熔解时按下面的分量加入剩余的组分并混匀：每100毫升胶状琼脂培养基—5 mL 乳糖溶液(1：5), 2 mL 曙红Y 溶液(1：50), 和2 mL亚甲蓝溶液(1：300)。配制好的培养基允许不澄清。
灭菌后PH：7.1 ± 0.2.
19，萨布罗右旋琼脂培养基
混匀，加热沸腾使溶解。
灭菌后PH：5.6 ± 0.2.
20，马铃薯右旋琼脂培养基
在500毫升蒸馏水中煮300克去皮切成丁的马铃薯,用滤布过滤，加蒸馏水至1000毫升，然后加入下面的成分：
加热溶解，灭菌。
灭菌后PH：5.6 ± 0.2.
使用时，在倒培养皿前，用酒石酸溶液（1：10）调整熔解冷却到45的培养基至PH 3.5 ±0.1.。不可以再加热pH 3.5 的培养基。
取样
按论文中要求的预备10-mL or 10-gs样品用于实验。
操作过程
通过与样品物理特性相适应的方法准备待测样品，不能改变样品中本来存在的微生物的种类和数量，获得一个溶液，或全部的悬浮液，或一个适于实验过程的形状的部分。
对于一个在可察觉的范围内溶解但不完全溶解的固体，把这个固体变成适度的细粉状，在特定的媒介物中做成悬浮液，按下面所示的程序进行：总的需氧微生物计数，金黄色葡萄球菌实验，铜绿假单胞菌实验，沙门菌和大肠杆菌实验。
对于液体样品，包括真溶液，水中的悬浮液或含水酒精（酒精含量不少于30%）；和在90毫升PH7.2的磷酸盐缓冲液中能快速并完全溶解的固体样品，按下面所示的程序进行：总的需氧微生物计数，金黄色葡萄球菌实验，铜绿假单胞菌实验，沙门菌和大肠杆菌实验。For water-immiscible fluids, ointments, creams, and waxes, prepare a suspension with the aid of a minimal quantity of a suitable, sterile emulsifying agent (such as one of the polysorbates), using a mechanical blender and warming to a temperature not exceeding 45, if necessary, and proceed with the suspension as directed under Total Aerobic Microbial Count, and under Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa and Test for Salmonella species and Escherichia coli.
For a fluid specimen in aerosol form, chill the container in an alcohol-dry ice mixture for approximately 1 hour, cut open the container, allow it to reach room temperature, permit the propellant to escape, or warm to drive off the propellant if feasible, and transfer the quantity of test material required for the procedures specified in one of the two preceding paragraphs, as appropriate.
Where 10.0 g or 10.0 mL of the specimen, whichever is applicable, cannot be obtained from 10 containers in aerosol form, transfer the entire contents from 10 chilled containers to the culture medium, permit the propellant to escape, and proceed with the test on the residues. If the results of the test are inconclusive or doubtful, repeat the test with a specimen from 20 more containers.
Total Aerobic Microbial Count
For specimens that are sufficiently soluble or translucent to permit use of the Plate Method, use that method; otherwise, use the Multiple-Tube Method. With either method, first dissolve or suspend 10.0 g of the specimen if it is a solid, or 10 mL, accurately measured, if the specimen is a liquid, in pH 7.2 Phosphate Buffer, Fluid Soybean–Casein Digest Medium, or Fluid Casein Digest–Soy Lecithin-Polysorbate 20 Medium to make 100 mL. For viscous specimens that cannot be pipeted at this initial 1:10 dilution, dilute the specimen until a suspension is obtained, i.e., 1:50 or 1:100, etc., that can be pipeted. Perform the test for absence of inhibitory (antimicrobial) properties as described under Preparatory Testing before the determination of Total Aerobic Microbial Count. Add the specimen to the medium not more than 1 hour after preparing the appropriate dilutions for inoculation.
PLATE METHOD
Dilute further, if necessary, the fluid so that 1 mL will be expected to yield between 30 and 300 colonies. Pipet 1 mL of the final dilution onto each of two sterile petri dishes. Promptly add to each dish 15 to 20 mL of Soybean–Casein Digest Agar Medium that previously has been melted and cooled to approximately 45. Cover the petri dishes, mix the sample with the agar by tilting or rotating the dishes, and allow the contents to solidify at room temperature. Invert the petri dishes, and incubate for 48 to 72 hours. Following incubation, examine the plates for growth, count the number of colonies, and express the average for the two plates in terms of the number of
microorganisms per g or per mL of specimen. If no microbial colonies are recovered from the dishes representing the initial 1:10 dilution of the specimen, express the res ults as “less than 10 microorganisms per g or per mL of specimen.”
MULTIPLE-TUBE METHOD
Into each of fourteen test tubes of similar size place 9.0 mL of sterile Fluid Soybean–Casein Digest Medium. Arrange twelve of the tubes in four sets of three tubes each. Put aside one set of three tubes to serve as the controls. Into each of three tubes of one set (“100”) and into a fourth tube (A) pipet 1 mL of the solution or suspension of the specimen, and mix. From tube A, pipet 1 mL of its contents into the one remaining tube (B) not included in a set, and mix. These two tubes contain 100 mg (or 100 μL) and 10 mg (or 10 μL) of the specimen, respectively. Into each of the second set (“10”) of three tubes pipet
1 mL from tube A, and into each tube of the third set (“1”) pipet 1 mL from tube
B. Discard the unused contents of tubes A and B. Close well, and incubate all of the tubes. Following the incubation period, examine the tubes for growth: the three control tubes remain clear and the observations in the tubes containing the specimen, when interpreted by reference to Table 1, indicate the most probable number of microorganisms per g or per mL of specimen.
Table 1. Most Probable Total Count by Multiple-Tube Method
Test for Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa
To the specimen add Fluid Soybean–Casein Digest Medium to make 100 mL, mix, and incubate. Examine the medium for growth, and if growth is present, use an inoculating loop to streak a portion of the medium on the surface of Vogel–Johnson Agar Medium (or Baird–Parker Agar Medium, or Mannitol–Salt Agar Medium) and of Cetrimide Agar Medium, each plated on petri dishes. Cover and invert the dishes, and incubate. If, upon examination, none of the plates contains colonies having the characteristics listed in Tables 2 and 3 for the media used, the test specimen meets the requirements for freedom from Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa.
Table 2. Morphologic Characteristics of Staphylococcus aureus on Selective
Agar Media
Table 3. Morphologic Characteristics of Pseudomonas aeruginosa on
Selective and Diagnostic Agar Media
Coagulase Test (for Staphylococcus aureus)— With the aid of an inoculating loop, transfer representative suspect colonies from the agar surfaces of the Vogel–Johnson Agar Medium (or Baird–Parker Agar Medium, or Mannitol–Salt Agar Medium) to individual tubes, each containing 0.5 mL of mammalian, preferably rabbit or horse, plasma with or without suitable additives. Incubate in a water bath at 37, examining the tubes at 3 hours and subsequently at suitable intervals up to 24 hours. Test positive and negative controls simultaneously with the unknown specimens. If no coagulation in any degree is observed, the specimen meets the requirements of the test for absence of Staphylococcus aureus.
文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告
目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果
1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批） 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基
2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种
3 试验环境 《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
表：微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表： 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表： （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）
控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备（需要的菌种在□内划“√”）： □（1）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（2）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（3）乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（4）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（5）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌类别计数选用该培养基）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃～28℃。细菌类别培养3天，霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果：需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌。 检验标准：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 结论： □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论： □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌。 检验标准：试验菌应不得生长。 结论： □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准：被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论： 结论： 检验人：复核人：
无菌检查和微生物限度检查操作规范 （中国药品生物制品检定所） 一、无菌室的要求： 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备： 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。 2、培养基灵敏度试验： 培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查： （1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。 （2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。应煮沸去氧，只限加热一次。 4、培养基的保存时限： 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏： 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法： 取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释：
微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3
微生物限度检验方法验证方案 1.适用范围 本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。 2.目的 通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。 3.职责 项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。 验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。 QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。 QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。 QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。 质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。 4.内容 4.1.概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。.验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。 4.2.1.验证用菌株及菌种要求 大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。 验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），
表：2.1-024微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
审核者：检验者： 微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表：2.1-024 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表：2.1-024 （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：2.1-024微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查
四、沙门菌检查（30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 表：2.1-024微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。 二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106) 三、目录1．微生物限度标准 2．设备、仪器及用具 3．消毒液、稀释剂、试液及培养基 4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法） 5．微生物计数法检查 6．控制菌检查法 7．实验技术 8. 附件 1．微生物限度标准 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准
*未做统一规定。 1.1成品微生物限度标准 (1)．“—”为不得检出。 (2)．目测霉变者以不合格论。 (3)．“无”为标准依据或无相应规定。 1.2工艺用水微生物限度标准
1.3内包装材料微生物限度标准 说明： 1．“—”为每100 cm2中不得检出。2．目测霉变者以不合格论。3．“无”为标准依据或无相应规定。 2．设施、仪器及用具 2.1、设施： 2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。生化
试剂储存箱。 2.2仪器及器皿 2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。 2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml 分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。 2.3用过的玻璃器皿： 2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次。 2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。 试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30 分钟。趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。 吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC组签名：日期： 审核 部门：QC组签名：日期： 部门：质量部签名：日期： 批准质量负责人签名：日期： 质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门： 01 质量部 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。 文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 姓名部门及职务职责 黄汉新质量负责人/质量受权 人 负责验证方案及报告的批准 胡建新质量部QA组长审核验证方案、审核验证报告并协调工作 曾凤敏质量部QC组长负责验证方案审核、实施、汇总报告及培训工作 刘红华质量部QC 负责验证方案起草、具体实施、报告工作
资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。 微生物限度检查方法验证方案 1.目的 : 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查 , 包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查 , 特制定本验证方 案 , 经过比较试验菌的恢复生长结果 , 来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性 , 以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计 , 所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行 , 若因特殊原因确需变更时 , 应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围 : 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件 : 根据《中国药典》二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求 , 由于某些供试品具有抗菌活性 , 在建立微生物检查方法 或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时 , 可能影响检验结果的准确性 , 必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施 : 4.4.1试验前的准备:
4.4.1.1试验用具的准备:将试验需用的试管、刻度吸 管、薄膜过滤器、滤膜 ( 孔径 0.22um、直径 50mm) 、平皿、空三 角瓶、称量纸等 , 用牛皮纸包扎好后 , 放于湿热灭菌器中 , 在 121℃, 灭菌 30 min, 在 3 天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备:取适用性检查合格的营养琼 脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖 培养基 ( BL)、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸 培养基 ( MUG) 等脱水培养基 ,按照相应的配制说明,用纯化水配 制、分装后,在2小时内,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭菌 15min, 在 3 周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备: 取在有效 期内的试剂, 按照相应的配制方法, 配制pH7.0 无菌氯化钠- 蛋白 胨缓冲液、0.9% 无菌氯化钠溶液、0.05%( ml/ml) 聚山梨酯80 的 0.9%无菌氯化钠溶液等 , 用纯化水配制 , 加热使溶 , 过滤 , 分 装 , 在 121℃, 灭菌 15 min, 在 3 周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释 : 4.4.2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液 : 4.4.2.1.1 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新 鲜培养物少许接种至 10ml 营养肉汤中 , 在 30～ 35℃培养 18～24 小时 ;取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基 中 ,在23～28℃培养24～48小时;取黑曲霉的新鲜培养物接种 至改良马丁琼脂斜面培养基上, 23 ～ 28℃培养 5～ 7 天。
表：2.1-024 微生物限度检查记录（通用） 1. 常规法：取供试品10為1,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至 100ml ，用匀浆仪等适宜的方法混匀， 制成1:10供试液。 2. 薄膜过滤法：取供试品 10mi ,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至 100ml ，用匀浆仪等适 宜的方法 混匀，制成1:10供试液。吸取1:10的供试液10ml ,过滤，加0.1%无菌蛋白胨水溶液 300ml 分 三次冲洗，每次100ml ;冲洗后，将滤膜正贴于胰酪大豆胨固体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基 上，每种培养基平行制备 2个平皿。按平皿法测定其菌数。 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号: ）、麦康凯液体培养基（配制批 ）麦康凯琼脂培养基（配制批号: ） 供试液制备
微生物限度检查记录 、需氧菌总数检查30?353?5） 、霉菌、酵母菌总数检查20C?25C,5?7天）
三糖铁琼脂斜面穿刺接种 （18?24h ） 三、控制菌检查 （30-35 C ） 检验者: 表：2.1-024 号: 结论 本品经按《中国药典》2015年版“非无菌产品微生物限度检查法”进行检验，结果 审核者: 微生物限度检查记录（丸剂） 供试液制备 供试液。 胰酪大豆胨增菌 （18?24h ） RV 沙门选择培 养 木糖赖氨酸脱氧胆酸分离培养 （18?48h ） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号: ）麦康凯琼脂培养基（配制批号: ） 四、沙门菌检查 （30 °C ?35C ） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ）,木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号: ）、三糖铁琼脂（配制批号：