［文章编号］1000-4718（2013）10-1798-05
［收稿日期］2013-01-07［修回日期］2013-09-17
*［基金项目］科学技术部国际科技合作项目（No．2010DFA31690）
△通讯作者刘秀华Tel ：010-********；E-mail ：xiuhualiu98@yahoo．com．cn ；史大卓Tel ：010-********；E-mail ：shidz666@so-hu．com
西洋参茎叶总皂苷减轻大鼠心肌细胞缺氧/
复氧损伤机制的研究
*
王
琛1
，刘
蜜2，王晓礽3，宋丹丹3，刘秀华3△，史大卓2△
（解放军总医院1中医科，3病理生理研究室，北京100853；
2
中国中医科学院西苑医院，北京100091）
［摘要］目的：探讨西洋参茎叶总皂苷（PQS ）减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia /reoxygenation ，
H /R ）损伤的机制是否与抑制钙调神经磷酸酶（CaN ）有关。方法：采用乳鼠心肌细胞H /R 损伤模型，转染CaN 质粒使其过表达或CaN 抑制剂FK506干扰其表达，
分为正常对照组、缺氧/复氧组、药物预处理组、CaN 过表达+药物预处理组、空载pCDB 质粒+药物预处理组及CaN 抑制剂+药物预处理组，以流式细胞术检测细胞凋亡，按CaN 测试盒步骤测定心肌细胞CaN 活性，以Western blotting 方法检测心肌细胞CaN 表达。结果：与对照组相比，CaN 过表达组心肌细胞凋亡率增加（P ＜0.05），与PQS +H /R 组比较，FK506组心肌细胞凋亡率、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax 表达、CaN 活性及蛋白表达无显著差异（P ＞0.05）。结论：抑制CaN 活性可以减轻心肌细胞H /R 损伤，但联合应用FK506对H /R 心肌细胞的保护作用不比单独应用PQS 强，PQS 减轻心肌细胞H /R 损伤的机制可能与CaN 途径无关。
［关键词］西洋参茎叶总皂苷；缺氧/复氧；钙调神经磷酸酶［中图分类号］R363．1
［文献标志码］A
doi ：10．3969/j．issn．1000-4718．2013．10．013
Panax quinquefolium saponins attenuate hypoxia /reoxygenation-induced
injury in rat cardiomyocytes
WANG Chen 1，LIU Mi 2，WANG Xiao-reng 3，SONG Dan-dan 3，LIU Xiu-hua 3，SHI Da-zhuo 2
（1Department of Traditional Chinese Medicine ，3Department of Pathophysiology ，Chinese PLA General Hospital ，Beijing 100853，China ；
2
Xiyuan Hospital ，China Academy of Chinese Medical Sciences ，Beijing 100091，China．E-mail ：xiuhua-
liu 98@yahoo．com．cn ；shidz 666@sohu．com ）
［ABSTRACT ］AIM ：To investigate the effects of Panax quinquefolium saponins （PQS ）and calcineurin （CaN ）signal pathway on cardiomyocyte injury induced by myocardial hypoxia /reoxygenation （H /R ）．METHODS ：Cultured car-diomyocytes isolated from neonatal Sprague-Dawley rats were used to establish the H /R model．The cells were transfected with pCDB-CaN plasmid to overexpress CaN ，or exposed to the CaN inhibitor FK506to interfere the CaN expression．The cardiomyocytes were divided into control group ，H /R group ，PQS +H /R group ，CaN +PQS +H /R group ，pCDB +PQS +H /R group and FK506+PQS +H /R group．The apoptosis was analyzed by flow cytometry．The activity of CaN in the car-diomyocytes was detected．The protein expression of CaN was determined by Western blotting．RESULTS ：Compared with control group ，the apoptosis of the cardiomyocytes in CaN group was significantly increased．Compared with PQS +H /R group ，the cell apoptosis ，the expression of Bcl-2and Bax ，the activity of CaN and its protein expression in FK506group were not significantly different．CONCLUSION ：Inhibition of CaN activity reduces the H /R injury in cardiomyocytes．However ，the mechanism of PQS protecting cardiomyocytes from H /R injury may not be associated with the CaN signaling pathway．
［KEY WORDS ］Panax quinquefolium saponins ；Hypoxia /reoxygenation ；Calcineurin
·
8971·中国病理生理杂志Chinese Journal of Pathophysiology 2013，29（10）：1798-1802
西洋参茎叶总皂苷（Panax quinquefolium sapo-nins，PQS）是西洋参茎叶中主要的活性成分。以往实验研究表明，PQS具有减轻缺血/再灌注（ische-mia/reperfusion，I/R）诱导的心肌细胞凋亡、心律失常和改善梗死后心室重构等作用［1-3］，其机制可能与增强抗氧化酶活性、维持细胞内Ca2+稳态等有关［4］。
研究表明钙超载是I/R发生的关键环节，钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是唯一依赖于Ca2+及钙调素（calmodulin，CaM）调控的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，参与多种细胞功能的调节［5］。PQS又具有维持细胞内钙稳态的作用［4］。我们研究证实PQS可以减轻离体培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤［6-7］。那么，PQS减轻心肌细胞H/R损伤的机制是否与CaN有关尚缺少研究，本部分工作利用乳鼠心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型通过转染pCDB-CaN质粒或CaN特异性抑制剂FK506干扰CaN表达，以探讨PQS减轻心肌细胞H/R损伤的机制。
材料和方法
1动物与试剂
清洁级24h内新生SD乳鼠，购自北京市军事医学科学院实验动物中心；PQS粉剂由吉林省集安益盛药业股份有限公司提供；细胞CaN活性比色法定量检测试剂盒购自GenMed；低糖DMEM干粉、购自Gibco；新生牛血清（new-born calf serum，NCS）购自PAA；胰蛋白酶购自Amresco；蛋白酶抑制剂（pro-tease inhibitor cocktail）、苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、四甲基乙二胺（tetramethyl ethylene diamine，TEMED）、Tris碱、Tris-HCl、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulphate，SDS）、考马斯亮蓝G250、过硫酸铵、甘氨酸、亮肽酶素和Triton X-100购自Sigma；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、β-巯基乙醇购自Merck；蛋白电泳分子量（7 175kD）为Bio-Rad产品；兔抗人GAPDH单克隆抗体、兔抗人Bax、Bcl-2和CaN多克隆抗体购自Cell Signal；辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG购自Santa Cruz；增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒购自Millipore；脂质体Lipofectamine 2000及Opti-MEM购自Invitrogen；pCDB-CaN质粒由北京大学人类疾病基因研究中心构建；CaN抑制剂FK506购自Sigma。
2乳鼠心肌细胞培养
参照Simpson等［8］法加以改进，无菌操作取出生后24h内SD新生乳鼠心尖部组织，剪碎成1mm?1mm?1mm大小，加入适量0．15%胰蛋白酶，37?水浴下轻柔搅动、反复消化，制备心肌细胞悬液，差速贴壁。用含15%新生牛血清的DMEM培养液，调整细胞浓度为每瓶3?106个细胞，接种于底面积为75
cm2的培养瓶，置CO
2
孵箱进行原代培养。
3实验分组
取原代培养心肌细胞，置于CO2孵箱常规培养24h，换无新生牛血清的DMEM培养液同步化24h 后，随机分组如下（进行4次原代培养，分别接种，n
=4）：（1）正常对照（control）组：细胞置CO
2
孵箱37?，常规培养至实验结束；（2）H/R组：按本室报道的方法［3］将细胞置于缺氧仓内，通入95%N2-5%
CO
2
混合气4h，更换37?95%空气-5%CO2预平衡的10%NCS DMEM，37?、5%CO2孵箱常氧继续培养12h结束实验；（3）药物预处理（PQS+H/R）组：以PBS缓冲液稀释PQS原粉，配成浓度为160g/ L的储存液，过滤除菌，4?保存，应用时将储存液1 000倍稀释加入心肌细胞培养液中，培养24h，进行H/R操作；（4）CaN过表达+药物预处理（CaN+PQS +H/R）组：pCDB-CaN质粒转染6h后，按照（3）组程序操作；（5）空载pCDB质粒+药物预处理（pCDB +PQS+H/R）组：空载pCDB质粒转染6h后，按照（3）组程序进行操作；（6）CaN抑制剂+药物预处理（FK506+PQS+H/R）组：培养基中加入FK506（5 mg/L），37?预孵育10min后，按照（4）组操作。
4CaN过表达
以转染试剂Lipofectamin2000转染pCDB-CaN 质粒至乳大鼠心肌细胞，转染方法如下：（1）转染前1d以104/cm2的密度接种，传代培养心肌细胞；（2）转染1h前将细胞培养液换为Opti-MEM；（3）分别配制DNA-Mix和Lipo-Mix：将质粒或Lipofectamine 2000加入Opti-MEM，小心混合后于室温下静置6 min，而后将DNA-Mix与Lipo-Mix均匀混合，室温下静置20min后小心滴加入细胞；（4）细胞继续培养5 6h后换为正常的DMEM完全培养液继续培养至实验结束。
5心肌细胞凋亡率测定
实验结束时，收集各组细胞培养液，用0．25%胰蛋白酶+0．02%EDTA消化液制备单细胞悬液，按照测试盒方法分别加入染料Annexin V和propidium iodide（PI），室温下孵育5 15min，以流式细胞仪（BD FACSCalibur，Becton-Dickinson）检测细胞凋亡情况。
6心肌细胞CaN活性检测
细胞以每瓶3?105个细胞的浓度接种于25cm2
·
9971
·
规格培养瓶，胰酶消化法收集细胞并加入3mL 预冷
的GENMED 清理液（Reagent A ），混匀细胞，3000?g 4?离心5min ，弃上清，加入500μL GENMED 裂
解液（Reagent B ），充分混匀，转移至预冷的1．5mL EP 管中，强力涡旋振荡15s 后置于冰槽里孵育30min ，13000r /min 4?离心5min ，收集上清液，移取10μL 进行蛋白定量，余样本即可放进－80?冰箱保存或置于冰槽里参照试剂盒操作说明进行CaN 活性测定。7
Western blotting 分析按本室报道方法
［9］
提取心肌细胞总蛋白，
Brad-ford 法蛋白定量后分装，－80?保存。取上述细胞蛋白提取液上清（含蛋白80μg ）进行聚丙烯酰胺凝
胶电泳（SDS-PAGE ，12%分离胶），将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，
用5%BSA 封闭40min 后分别加入Bcl-2、Bax 、CaN 多克隆抗体（均
为1?500）4?过夜孵育，
用1?TBS-T 洗膜后，以相应的II 抗孵育1．5h ，并以GAPDH （1?500）单克隆
抗体重复上述实验过程，作为上样对照。化学发光ECL 显示，采用Image-
Pro Plus 软件分析蛋白条带的积分吸光度值（integrated A value ，IA ，平均吸光度
值?面积），以靶蛋白/GAPDH IA 比值反映靶蛋白水平。8
统计学处理
采用SAS 8.2统计软件分析，数据用均数?标准差（mean ?SD ）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA ）进行多组间比较，采用q 检验进行多组间两两比较，两变量相关性采用Pearson 相关分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。
结
果
1CaN 表达对PQS 心肌细胞保护作用的影响
1．1
心肌细胞凋亡率正常对照组细胞生长状态
良好，凋亡率为2．0%；CaN 过表达组心肌细胞凋亡
率为6．6%（P ＜0.05）；以160mg /L 浓度的PQS 预先培养24h ，细胞凋亡率为3．1%，与PQS +H /R 组
比较，
CaN 过表达组细胞凋亡率升高3．5%（P ＜0.05）；FK506对于PQS 改善H /R 后心肌细胞凋亡率无明显影响，与PQS +H /R 组相比差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1
。
Figure 1．Flow cytometry analysis of the effect of CaN on cardiomyocyte apoptosis．Mean ?SD．n =4．*P ＜0.05vs control ；#P ＜0.05
vs H /R ；＆P ＜0.05vs PQS +H /R．
图1
流式细胞术分析CaN 对心肌细胞凋亡的影响
1．2
凋亡相关因子蛋白表达采用Western blot-ting 检测凋亡蛋白Bcl-2和Bax 的表达变化，结果显示：转染CaN 质粒后，
与PQS +H /R 组相比，Bcl-2蛋白表达降低50．0%，而Bax 蛋白表达为PQS +H /R 组的2．0倍（P ＜0.05）；FK506对于PQS 改善H /R
后心肌细胞凋亡相关因子蛋白表达无明显影响，
Bcl-2和Bax 蛋白表达与PQS +H /R 组比较无显著差异
（P ＞0.05），见图2。2PQS 对心肌细胞CaN 活性及蛋白表达的影响2．1
心肌细胞CaN 活性测定
采用比色法测定
CaN 活性，结果显示，
H /R 诱导CaN 活性明显增加，为对照组的10．0倍（P ＜0.05）。PQS 明显抑制H /R 引起的CaN 活性升高，较H /R 组降低70.6%（P ＜0.05）；转染CaN 质粒后，与PQS +H /R 组比较，
CaN 活性升高3．0倍（P ＜0.05）；FK506对于PQS 改善H /R 后心肌细胞CaN 活性无明显影响，与PQS +H /R 组比较无显著差异（P ＞0.05），见图3。2．2心肌细胞CaN 蛋白表达采用Western blotting 检测CaN 蛋白表达变化，结果显示，H /R 诱导CaN 蛋白表达明显升高，为对照组的3．0倍（P ＜0.05）。
·
0081·
Figure 2．Effects of calcineurin on the expression of Bcl-2and
Bax in H /R-treated cardiomyocytes．Mean ?SD．n =4．
*
P ＜0.05vs control ；
#
P ＜0.05vs H /R ；
＆
P ＜
0.05vs PQS +H /R．
图2
CaN 对心肌细胞Bcl-2和Bax
蛋白表达的影响
Figure 3．Effect of PQS on CaN activity in cardiomyocytes．Mean
?SD．n =4．*P ＜0.05vs control ；#
P ＜0.05vs
H /R ；
＆
P ＜0.05vs PQS +H /R．
图3
PQS 对心肌细胞CaN 活性的影响
PQS 明显抑制H /R 引起的CaN 蛋白表达升高，较H /R 组降低60．9%（P ＜0.05）；转染CaN 质粒后，与PQS +H /R 组比较，
CaN 蛋白表达升高2．3倍（P ＜0.05）；FK506对于PQS 改善H /R 后心肌细胞
CaN 蛋白表达无明显影响，与PQS +H /R 组比较无显著差异（P ＞0.05），见图4。
讨论
近年来随着临床冠脉内溶栓术、
经皮冠脉腔内
Figure 4．Effect of PQS on CaN protein expression in cardiomyo-cytes．Mean ?SD．n =4．*P ＜0.05vs control ；#
P ＜
0.05vs H /R ；
＆
P ＜0.05vs PQS +H /R．
图4
PQS 对心肌细胞CaN 蛋白表达的影响
血管成形术及冠脉搭桥术等治疗方法的广泛应用，心肌再灌注损伤愈来愈引起人们的重视。I /R 损伤指缺血一定时间的心肌恢复灌流后，组织损伤反而
进行性加重，
心肌细胞从可逆损伤转变为不可逆损伤的现象。I /R 发生的主要环节是氧自由基产生和
钙超载，其机制尚未完全阐明，CaN 是唯一依赖于Ca 2+调控的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。CaN 在细
胞增殖、分化、凋亡及其它病理过程中起着重要作用，参与心肌肥大、心肌凋亡、血管平滑肌细胞增殖等过程的调节。心肌细胞坏死和凋亡是心肌I /R 损伤的特征之一
［10］
。Musat-Marcu 等［11］在离体灌流大
鼠心脏上发现，再灌注早期即可发生心肌细胞凋亡。其中抗凋亡基因bcl-2与促凋亡基因bax 参与了心肌I /R 损伤中细胞凋亡的调控［12］。研究证明I /R 时胞
浆内Ca
2+
浓度升高，引起CaN 活化，通过Bad （Bcl-2家族促凋亡因子）去磷酸化拮抗Bcl-2的抗凋亡功能，促进细胞凋亡
［13］
。Bueno 等［14］发现CaN A β基
因打靶小鼠易致急性缺血诱发的心肌凋亡，
从而推测CaN 信号途径可介导心肌细胞凋亡；Singh 等
［15］
发现I /R 时，
肾素－血管紧张素系统被激活，释放大量儿茶酚胺，可通过β1受体介导细胞凋亡；李文霞等
［16］
发现CaN 过表达可以增加I /R 损伤心肌细胞
凋亡率。Ikeda 等［17］与Nathan 等［18］
研究证实，心肌与脑I /R 损伤均可导致CaN 活性增强，促进细胞凋亡，导致心肌损伤，以CaN 抑制剂CsA 抑制其活性及表达可对I /R 产生保护作用。
本研究利用乳鼠心肌细胞H /R 模型，采用流式
·
1081·
细胞术以及Western blotting方法，证实外源性CaN 过表达后能明显增加心肌细胞凋亡率，升高促凋亡蛋白Bax表达及降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达，提示CaN具有促心肌细胞凋亡作用，与文献报道一致［19-20］，课题组前期实验证实PQS能明显减轻H/R 诱导的心肌细胞损伤和凋亡，本研究表明联合给予CaN抑制剂组与单纯PQS预处理组一样均能降低心肌细胞凋亡率，但2组相比无明显差异，提示CaN活性抑制可以减少心肌细胞凋亡，但并未加强PQS对H/R心肌细胞的保护作用。本研究按CaN测试盒步骤测定心肌细胞CaN活性，以Western blotting方法，检测心肌细胞CaN表达，发现H/R诱导CaN活性及蛋白表达明显增加，PQS明显抑制H/R引起的CaN 活性升高及蛋白表达，单纯PQS预处理组与联合给予CaN抑制剂组均能降低心肌细胞CaN活性及蛋白表达，但2组相比无明显差异，提示CaN活性抑制对于PQS改善H/R后心肌细胞CaN活性及蛋白表达无明显影响。
综上所述，心肌细胞H/R损伤可以导致CaN活性及蛋白表达增加，增加心肌细胞凋亡，FK506抑制CaN活性可以减轻心肌细胞H/R损伤，CaN活性抑制对心肌细胞的保护作用不比单独应用PQS强，提示PQS减轻心肌细胞H/R损伤的机制可能与CaN 途径无关。
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