2008年第1期常州工程职业技术学院学报V ol.1 2008总第五十五期JOURNAL OF CHANGZHOU INSTITUTE OF ENGINEERING TECHNOLOGY April No.55高产胞外多糖的乳酸菌菌种的筛选
吴玲何颖
（常州工程职业技术学院应用化学技术系，江苏常州 213164）
摘要：本文首先从高产EPS混合乳酸菌中分离纯化了12种乳酸菌，测定不同菌种在40℃下液体培养12h后菌液的OD值、活菌数；然后将12种菌在适宜条件下分别制成酸奶并测定其pH值、粘度和产胞外多糖量，从中筛选出了两株产多糖量最高的乳酸菌种；最后利用API细菌鉴定系统对这两种乳酸菌进行鉴定，分别为乳酸乳球菌乳亚种1和片球菌属。
关键词：胞外多糖；乳酸菌；右旋糖酐
乳酸菌是一类能利用可发酵性糖为原料，并能产生大量乳酸的细菌的通称。按伯杰氏系统细菌学手册中的生化及形态分类法，乳酸菌分为18个属。而在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要有7个属，分别为乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属、明串珠菌属和双歧杆菌属［1］。
多糖是指由20个以上单糖组成的糖类化合物，根据来源不同，可分为植物、动物和微生物多糖。自20世纪40年代成功开发出由肠明串珠菌发酵产生右旋糖酐以来，新的微生物胞外多糖的研究与开发在世界范围内已成为研究的热点［2］，其中又以乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属、乳球菌属等乳酸菌的胞外多糖研究较多。
乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌发酵产生的，分泌在细胞外的，常渗入到培养基中的糖类化合物。根据其所在的位置，可分为荚膜多糖和粘液多糖。乳酸菌胞外多糖的生物合成因菌种的不同而发生在不同的条件下，按合成位点和合成模式不同，其胞外多糖的合成可分为2类，即细胞壁外的同源多糖的合成与细胞膜上的异源多糖的合成［3］。Wigandi等［4］认为乳酸菌合成EPS可能有3种方式：(1)加速扩散；(2)活性传递；(3)基因转移。
许多乳酸菌是历史悠久的工业生产菌，乳酸菌胞外多糖不仅对乳制品的结构和风味具有重要影响，而且有可能成为食品级多糖的一个极好的来源而广泛应用于各种食品的增稠、稳定、乳化、胶凝及保湿［5］；而且，近十多年来的研究发现［6］，活性多糖除了具有抗病毒、抗衰老、降血糖、刺激造血等作用外，还有抗肿瘤、抗溃疡、免疫调节、调节胃肠功能、降低胆固醇等生物学功效。其中，来源于乳酸菌的胞外多糖由于对机体无毒副作用，来源安全可靠等优点，逐渐被人们所关注。因此，将乳酸菌胞外多糖作为功能性食品的成分进行开发和研究具有很大潜力。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
瑞士乳杆菌（1004和15019）、德氏乳杆
收稿日期：2007-12-21
作者简介：吴玲（1981-），女，江苏常州人，常州工程职业技术学院教师，微生物学硕士；何颖（1981— ），女，江苏南通人，常州工程职业技术学院教师，遗传学硕士。
菌保加利亚亚种（13953）、嗜热链球菌（13957）及高产EPS混合乳酸菌，均由南京师范大学食品系乳肉科学实验室提供。
1.1.2 培养基
MRS培养基：用于分离纯化菌种；脱脂乳培养基：10%(w/v)的脱脂乳，用于凝乳及发酵实验； API 50 CHL培养基：用于乳酸菌菌种鉴定。
1.1.3 其他材料
脱脂乳粉，上海光明乳业股份有限公司，市售；Sevag液[7]（氯仿:正丁醇(v/v)=3：1）。
1.2 主要仪器设备
电子显微镜（OLYMPUS OPTICAL CO. LTD），NDJ-8S粘度计（上海第三分析仪器厂），PHS-3C型精密pH计（上海雷磁分析仪器厂），722可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），MCFD-5505A真空冷冻干燥机（上海虹益仪器仪表有限公司）
1.3 实验方法
1.3.1 酸奶中乳酸菌的分离纯化
将本实验室收藏的高产EPS混合乳酸菌种接种到MRS液体培养基中，37℃静置培养至培养基混浊后转接1次活化，然后转接到pH5.8~6.0的MRS液体培养基中复筛，培养条件同上，转接3次后用无菌生理盐水稀释到适宜浓度涂MRS平板，倒置于40℃恒温培养箱48h后，挑取平板上不同形态的单菌落，转接到MRS斜面上。待菌落长出后，仔细观察斜面菌苔的颜色、光泽、透明度等是否一致，并取少许培养物涂片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态，进行初步分类。将纯化的未知菌种斜面保存于4℃冰箱。
1.3.2 菌液吸光值的测定及活菌计数
吸光值的测定：将纯化的乳酸菌接种于MRS液体培养基中，40℃静置培养12h后转接3次活化。将活化的12种乳酸菌转接至MRS 液体培养基中，40℃恒温培养12h后，将菌液混匀并在600nm处测定吸光度。
活菌计数：采用平板倾注法进行活菌计数。将培养12h后的菌液用无菌生理盐水逐级稀释，选取3个适宜浓度梯度，每个梯度设3个平行，40℃培养48h后进行活菌计数。
1.3.3 酸奶的制作及其pH值和粘度的测定
10%(w /v) 的脱脂乳在90℃下杀菌15min，杀菌结束后冷却至37℃，无菌操作条件下，按5%（v/v）的接种量分别接种活化好的12种乳酸菌，在43℃发酵至凝乳，4℃后熟12h以上备用。分别用pH计和粘度仪测定酸奶的pH值和粘度。
1.3.4 EPS的提取和含量测定
1.3.4.1 EPS的提取
将制备好的酸奶用饱和NaOH调pH至8.0，4000r/min离心15min，取上清液；将上清液用HCl调节至4.6，4000r/min离心15min，取上清液[8]。用NaOH将上清液调至7.5，加入1/10体积的胰蛋白酶液（浓度为3g/L，现配现用），40℃水浴酶解2.5h。加入1/3体积Sevag液，振摇30min后，4000r/min离心15min，去除沉淀，重复一次。加入3~5倍体积的95%的乙醇，充分振荡（多糖呈絮状沉淀析出），4000r/min离心15min，得沉淀。将沉淀用丙酮洗涤脱水两次，真空冷冻干燥得白色粉末为多糖（通过此种方法得到的为粗多糖）[9]。
1.3.4.2 EPS含量的测定
EPS含量的测定主要采用苯酚—浓硫酸法，用葡萄糖作标准曲线［10，11］。
（1）葡萄糖标准曲线的制备
首先配制浓度为250μg/mL标准葡萄糖溶液，精确量取葡萄糖标准溶液3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL至容量瓶中，加水定容至500mL，精确吸取1.0mL各标准溶液，再分别加入5%苯酚（置棕色瓶，4℃保存）溶液0.6mL，摇匀后静置2min，迅速加入浓硫酸
3.6mL，充分摇匀，静置10min，30℃水浴15min。以空白管为对照，在490nm处测定吸光度，再做两组平行样，以葡萄糖浓度c为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线，得回归方程。
（2）EPS含量的测定
准确称取干燥的胞外多糖样品10mg，置于250mL容量瓶中定容，吸取样品溶液1mL 于试管中，然后按标准曲线制备步骤操作，测定样品的吸光度，由回归直线方程求出浓度c，然后由下式求得可溶性胞外多糖含量。
胞外多糖含量（%）=［(c×250)/(w×106)］×100%
其中：c为苯酚—浓硫酸法所测吸光度由回归直线方程求得的浓度（μg/mL）；w为待测样品的质量（g）。
1.3.5 高产EPS乳酸菌种的鉴定
利用API细菌鉴定系统对未知的高产EPS 乳酸菌进行鉴定。API 50 CHL是用于乳酸杆菌（Lactobacillus）和相关菌的鉴定，它是由49种可发酵碳水化合物的API 50 CHL试验条组成的简易培养基。以测定菌制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水化合物产酸，pH下降，使指示剂变色。结果构成菌株的生化图谱，并用于鉴定或分型。1.3.5.1 选取菌落和接种物的制备
首先利用涂布法将分离纯化的高产EPS 乳酸菌接种于MRS培养基上，在40℃恒温培养箱中倒置培养48h；检查菌株的纯度，挑取几个一致的菌落，在API 50 CHL培养中制得混浊度相当于2 McFarland的菌悬液，混匀。
1.3.5.2 试验条的接种
用已接种的API 50 CHL培养基加入试验条的管，并用液体石蜡覆盖，于40℃好氧培养48h。
1.3.5.3 判读试验条
判读培养48h后的试验条，若是阳性结果，则是培养中所含溴甲酚紫指试剂变黄所示的产酸作用。
1.3.5.4 菌株的鉴定
根据未知菌株的生化谱，用鉴定软件包鉴定菌株。
1.3.6 菌种的保存
将已分离的高产EPS乳酸菌液体培养物在－70℃、真空度≤12Pa条件下真空冷冻干燥，将冻干的菌种保存于-70℃超低温冰箱中。
2 结果与讨论
2.1 高产EPS混合乳酸菌的分离纯化
本实验共分离了12种乳酸菌，通过镜检保证每种被分离乳酸菌的形态是一致的，主要为杆状和球形两种，其革兰氏染色结果见表1。
表1 分离的未知乳酸菌的革兰氏染色结果
菌种
代号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
染色
结果
G＋G—G—G＋G＋G—G＋G＋G＋G＋G＋G—
2.2 乳酸菌菌液吸光度及菌落数
活化的乳酸菌经过12h的培养，菌液吸光度及菌落数如表2。由表可以看出，在相同的培养条件下，10号菌的菌液密度和活菌数是最大的，7号菌次之，再次是5号菌
表2 未知乳酸菌培养12h 后菌液吸光度及菌落数
指标 指标 菌种 序号
OD 600
菌落数(×108cfu/mL)
菌种 序号
OD 600
菌落数(×108cfu/mL)
1 0.13
2 3.72 7 0.419 11.67 2 0.298 6.51 8 0.191 4.25
3 0.062 2.0
4 9 0.19
5 4.50 4 0.121 3.68 10 0.497 12.12 5 0.372 8.59 11 0.131 3.99
6 0.31
7 7.21 12 0.10
8 3.33
2.3 酸奶的pH 值和粘度
由表3可知，在适宜条件下用不同乳酸菌发酵的酸奶，pH 值相差不大，但不同发酵乳粘度却有较大区别。发酵乳粘度对口感及防止乳清析出有重要意义，同时也是评价发酵乳品质的一个重要指标。发酵乳制品粘度的产生是由于菌体不断产酸使pH 下降到酪蛋白凝固点，同时菌体不断分泌粘多糖使酸奶呈现均一粘稠状态[12]，因此发酵乳的粘度与其产多糖量密切相关。表3 用未知乳酸菌制作的酸奶的pH 值及粘度
指标 指标 菌种 序号
pH
粘度（mPa·s ）
菌种 序号
pH
粘度（mPa·s ）
1 3.45 155 7 3.6
2 321 2 3.8
3 195 8 3.37 186 3 3.30 120 9 3.43 190
4 3.42 150 10 3.4
5 350 5 3.43 270 11 3.48 162
6 3.42 250 12 4.33 134 2.4 不同乳酸菌EPS 产量 2.4.1 已知乳酸菌的EPS 产量
将实验室现有的4种乳酸菌在43℃下分
别发酵脱脂牛乳至凝乳，并且测定其产胞外多糖量，结果如表4所示。
表4 几种已知乳酸菌的EPS 产量
菌种名 EPS 合成量（mg/L ） 瑞士乳杆菌1004
（Lactobacillus helveticus ATCC1004） 263.22 瑞士乳杆菌15019
（Lactobacillus helveticus ATCC15019） 213.33 德氏乳杆菌保加利亚亚种13953
427.71 (Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricus ATCC13953) 嗜热链球菌13957
（Streptococcus thermophilus ATCC13957） 374.70
2.4.2 未知乳酸菌的EPS 产量
已分离的12种未知乳酸菌胞外多糖产量
如表5所示。由表可知，10号菌的EPS合成量达到最大，7号菌次之，再次为5号菌，与表2的OD值与菌落数及表3的粘度相一致。且10号和7号菌的EPS产量远大于其他菌。
表5 未知乳酸菌的EPS 产量
菌种代号 EPS合成量（mg/L）菌种代号 EPS合成量（mg/L）
1 330.84 7 716.48
2 392.44 8 382.10
3 186.21 9 386.17
4 320.06 10 851.99
5 513.51 11 348.00
6 434.28 12 230.10
2.5 两株高产EPS乳酸菌种鉴定
2.5.1 菌种鉴定结果
通过API鉴定系统的检测，鉴定7号和10号乳酸菌分别为乳酸乳球菌乳亚种1（Lactococcus lactis subsp. Lactis1）和片球菌属（Pediococcus），两种乳酸菌试验的碳源发酵反应结果见表6。
表6 7号和10号未知乳酸菌碳源发酵试验结果
检测结果 7/10结果检测结果 7/10结果检测结果 7/10结果对照（0）-/- 肌醇（INO）-/- 菊糖（INU）-/-
甘油（GLY）-/- 甘露醇（MAN）-/- 松三糖（MLZ）-/-
赤藓糖（ERY）-/- 山梨醇（SOR）-/- 棉籽糖（RAF）-/-
D-阿拉伯糖（DARA）
L-阿拉伯糖（LARA）-/-
-/-
α-甲基-D-甘露糖甙
（MDM）
-/+ 淀粉（AMD）
糖原（GLYG）
+/-
-/-
核糖（RIB）+/+ α-甲基-D-葡萄糖甙-/+ 木糖醇（XLT）-/- D-木糖（DXYL）-/- （MDG）拢牛儿糖（GEN）+/+ L-木糖（LXYL）-/- N-乙酰-葡萄胺（NAG）+/+ D-松二糖（TUR）-/- 阿东醇（ADO）-/- 苦杏仁甙（AMY）+/+ D-来苏糖（LYX）-/-
β-甲基-D-木糖甙（MDX）-/- 熊果甙（ARB）
七叶灵（ESC）
+/+
+/+
D-塔格糖（TAG）
D-岩糖（DFUC）
+/+
-/-
半乳糖（GAL）葡萄糖（GLU）+/+
+/+
柳醇（SAL）
纤维二糖（CEL）
+/+
+/+
L-岩糖（LFUC）
D-阿拉伯糖醇（DARL）
-/-
-/-
果糖（FRU）+/+ 麦芽糖（MAL）+/+ L-阿拉伯糖醇（LARL）-/-
糖（MNE）+/+ 乳糖（LAC）+/+ 葡萄糖酸盐（GNT）-/-
山梨糖（SBE）-/- 蜜二糖（MEL）+/+ 2-酮基-葡萄糖酸盐-
鼠李糖（RHA）-/- 蔗糖（SAC）+/+ （2KG）
卫茅糖（DUL）-/- 海藻糖（TRE）+/+ 5-酮基-葡萄糖酸盐-/-
（5KG）
注：+为阳性结果，即培养中所含溴甲酚紫指示剂变黄，七叶灵测定（25号管）从紫变黑；-为阴性结果，即培养中所含溴甲酚紫指示剂仍为紫色。
2.5.2 菌落特征观察
乳酸乳球菌乳亚种1菌落在培养基上圆形光滑，菌落较小，侧面呈梭状，边缘整齐，微黄，不透明，有酸味；经验证，乳酸乳球菌乳亚种1在MRS液体培养基中的最适生长温度为37～41℃。片球菌属菌落呈圆形，菌落中等大小，乳白色，边缘整齐，扁平，有光泽，不透明，有酸味；经验证，片球菌属在MRS培养基中的最适生长温度为25～40℃。
2.5.3 菌体形态观察
乳酸乳球菌乳亚种1为革兰氏阳性菌，显微观察其为球形或卵圆形，多数单生，有时成对或聚成一簇，无鞭毛，不运动；片球菌属为革兰氏阳性菌，细胞球形，成对或沿着二个垂直平面形成四联状排列，罕见单个细胞，不形成链状，无鞭毛，不运动。
3 结论
本实验室的4种已知乳酸菌胞外多糖产量为0.21～0.43g/L。据Shah[13]报道，乳酸菌在适宜条件下的胞外多糖生成量大约为0.15～0.6g/L。本研究所得两种乳酸菌乳酸乳球菌乳亚种1和片球菌属的胞外多糖生成量分别达到716.48和851.99mg/L。
乳酸菌的胞外多糖对酸奶的质地、粘度和口感影响较大，乳酸菌产生的胞外多糖对发酵乳质地的良好影响是不言而喻的，而许多酸奶都是通过加入一定量的食品添加剂使酸奶有一定的粘度和良好的口感。法国、荷兰等国在法规上明确禁止在普通酸奶等发酵乳中添加增稠剂和稳定剂，而这2个国家都是生产和消费优质发酵乳的重要国家[14]。因此，随着人民生活水平的提高，研究天然的乳酸菌胞外多糖意义重大，同时也具有较好的经济效益。
参考文献：[1] 杨洁彬.乳酸菌——生物学基础及应用[M].北京:中
国轻工业出版社,1996．
[2] Law B.A. Microbiology and Biochemistry of Fermented Milk[M]. London: Blackie Academic and Professional, 1997．
[3] 李全阳，夏文水.乳酸菌胞外多糖的研究[J].食品与
发酵工业,2002,29(5):86~90．
[4] W Wigandi H. Glycolipids[M]. Amsterdam: Elsevier Sci. Publishers,1985．
[5] 金世琳.乳酸菌的科学与技术[J].中国乳品工
业,1998,26(2):14~16．
[6] 张筠,刘宁,孟祥晨.乳酸菌胞外多糖的生物学活性[J].国外医学卫生学分册,2004,31(4):227~230．[7] J Zhang, P Mungara, J Jane. Mechanical and thermal properties of extruded soy protein sheets[J]. Polym, 2001,42: 2569~2578．
[8] K E Spence, S Wang, A Pometto, et al. Biodegradation of protein/ starch based plastics[J]. Polym prepr, 1994,35(2):427~428．
[9] 朱奇,郭善利,陈彦等.乳酸菌胞外多糖（EPS）产生
条件的研究[J].食品科技,2004(4):18~19．
[10] 大连轻工业学院等八大院校编.食品分析[M].北
京:中国轻工业出版社,1994．
[11] 钟颜麟,彭志英,赵谋明.乳酸菌胞外多糖的研究[J].
中国乳品工业,1999,27(4):7~10．
[12] 陈正行.米糠脂多糖提取物中分离蛋白质的研究[J].中国粮油学报,2000,15(5):6~9．
[13] SHAH N P. The Exopolysaccharide Production by Starter Cultures and Their Influence on Textural Characteristics of Fermented Milk[M]. Symposium Proceedingfs, Fermented Milk, Denmark,
2002:101~115．
[14] 高松柏.发酵乳的最新进展[J].中国乳品工
业,2004,32(8):46~49．
乳酸菌的筛选（初筛） 一、实验目的 对采集的仔猪粪便进行梯度稀释和平板涂布，对猪粪中的肠源菌进行初步的筛选。 二、实验材料 PBS、2mL离心管、MRS肉汤、琼脂、冰袋、保温盒、封口膜、200μL 枪头等。 三、实验步骤 1、实验前准备：用MRS肉汤配置MRS固体培养基（内含有1.5%琼脂，1%CaCO3），121℃灭菌15min后倒平板，备后面涂布使用，2mL 离心管中加入1mLPBS备后面实验使用。 2、采样：使用已灭菌的200μL枪头挑取仔猪猪粪适量，放入事先准备好的2mL加有PBS的离心管中，取样标准为每窝仔猪取5个样品，采完样品后，用封口膜将离心管口封住，并放入准备好的装有冰袋的保温盒中保存。 3、涂布：将采好的样品用螺旋振荡器混匀，取100μL样品混匀液，加入900mL的离心管中进行梯度稀释，取10- 4、10-5梯度菌液进行平板涂布。 4、培养：将涂布好的平板依次标好时间、稀释浓度和样品编号后，置于厌氧培养箱中37℃培养24h。 5、培养完成后，对所涂布的平板进行拍照留底。
乳酸菌的筛选 一、实验目的 利用平板划线的原理，对涂布出的单菌落进行划线纯化。 二、实验原理 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。 四、实验步骤 1、MRS培养基的配置：用MRS肉汤按每升48g计算配置，向其中加入1.5%的比例加入琼脂，按1%的比例加入CaCO3后，121℃灭菌15min。 2、倒平板：培养皿灭菌，烘干后，取灭菌的MRS固体培养基倒平板（每个平板倒10mL左右），放入4℃冰箱备用。 3、划线：于超净工作台中，将涂布平板中的单菌落用接种环挑取，按图1中所示的方法与平板上划线。 4、将接种好的平板置于37℃厌氧培养箱中培养24h。 5、培养期间，注意观察菌的生长情况，培养结束后，拍照留底。
一嘌呤霉素 (一)确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。 一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血清的培养基制成 1.5×105个/ml的细胞悬液。 3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在 1.5×104个），然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。） 4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意： 对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。） 5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。 6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导
致所有细胞死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。 (二)转染细胞 1.第一天： 在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。 2.第二天： 准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。将已经制备的病毒颗粒 0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而，有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene） (三)筛选细胞 1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。 2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基，24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。 3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。 4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内。
开题报告 食品科学与工程 硒酸化乳酸菌胞外多糖抗氧化活性研究 一、选题的背景与意义 胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是由细菌和微型藻类在生长过程中分泌到细胞外的长链多糖。EPS常常以荚膜多糖和黏多糖两种形式存在。但对于微生物来说，主要是指不与细胞表面永久粘附的黏多糖。微生物EPS具有增稠和凝胶的特性，已被用作工业中的增稠剂、凝胶剂和稳定剂。但是，乳酸菌具有公认的安全性。其产生的EPS可以替代工业微生物多糖广泛用于食品配方中。而且，大量的研究证实乳酸菌产生EPS具有抗肿瘤活性、免疫激活作用、降低血清胆固醇和益生元作用等，对人类的健康有着重要的意义。 硒元素是生命活动的必需元素，其存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和硒酸钠，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体的抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力，这说明了硒与人体健康的直接关系。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，而有机硒的毒性低，副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著，因此，将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物———硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。 硒能作用于人体转化成硒酶，大量破坏血管壁损伤处集聚的胆固醇，使血管保持畅通，提高心脏中辅酶A的水平，使心肌所产生的能量提高，从而保护心脏；硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的活性成分，它能防止胰岛B细胞氧化破坏，使其功能正常，促进糖份代谢、降低血糖和尿糖，改善糖尿病患者的症状；硒是一种可增强免疫系统和抑制细胞增殖的抗氧化微量元素，具有降低癌症危险的作用；硒是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)的组成成分，每摩尔的GSH—Px中含4g原子硒，此酶的作用是催化还原性谷胱甘肽(GSH)与过氧化物的氧化还原反应，所以可发挥抗氧化作用，是重要的自由基清除剂。尽管硒在人体内的含量非常少，而且每日摄人量也极微，但却在人体的机能中发挥着极其重要的作用。硒在地壳中分布广泛但含量不均。据WHO公布的资料，全球有40多个国家属于低硒和缺硒地区。对中国1094个县市的土壤硒含量进行了测定，结果显示：中国是个缺硒国家,全国有72％的人口存在不同程度的硒摄入不足。硒只占人体重量的万分之一以下，不能在体内合成，必须从食物中摄取，而且食物中的有机硒才容易被人体吸收。有机硒主要是硒蛋白和硒多糖，本文讲述的是硒多糖。
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
耐盐乳酸菌的筛选和鉴定
摘要：本实验从酱油厂提供的酱油原醅中分离筛选出耐盐乳酸菌，该菌在18%以上NaCl 浓度的条件下能够正常生长代谢，初步鉴定其为四联球菌属，可用于高盐稀醪酱油酿造目前国内尚无耐盐度达18%的乳酸菌种, 该菌种的成功选育为国内首创。 关键词乳酸菌耐盐筛选鉴定 酱油采用高盐稀醪发酵工艺生产时能有更好的质量和香味。其工艺上需要在酱醅发酵过程中添加酵母菌和乳酸菌。然而酱油的含盐度高达18%，这就需要选育出耐盐菌种。关于耐盐酵母的应用报道已有很多。而乳酸菌方面，目前在国内菌种库内尚无耐盐度达18%的菌种。我们作为酱油大国，筛选出耐盐度达18%的嗜盐乳酸菌的意义则显得十分重大。 本实验主要对高盐稀态发酵工艺酱醅中嗜盐乳酸菌进行分离筛选及鉴定。 1 材料与方法 1.1 材料 酱醅、草酸铵结晶紫液（革兰氏A液）、路哥尔氏碘液（革兰氏B液）、蕃红花红（沙黄）、生理盐水。 1.2 实验方法 1.2.1 分离筛选流程(如图1)
1.2.2 筛选方法 十倍稀释法、平板涂布法、斜面之字划线法、平板四分法划线。1.2.3 鉴定方法 1.2.3.1 革兰氏染色法 1.2.3.2 过氧化氢酶接触酶测定 取一环琼脂斜面的培养物，涂于干净载玻片上，然后加1 滴3% -15% H2O2，若有气泡产生则为阳性反应，无气泡为阴性反应。或将3%-15% H2O2加到斜面的菌苔上观察是否有气泡的产生。 1.2.3.3 生化鉴定管使用方法 挑取待检菌革兰氏染色镜检，将新鲜菌苔接种于普通肉汤中，37摄氏度培养18-24h。各吸取0.05-0.08ml（约1-2滴）的肉汤培养物或菌悬液加入每种微量生化管内，将已接种生化管套上无菌塑料帽直立于三折吸塑短架内，于35-37摄氏度培养箱中培养。 1.2.3.4 高效液相色谱HPLC 测量乳酸含量(图2)
收稿日期：２００７－０６－３０ 基金项目：湖北省“十一五”重点科技攻关项目（２００６ＡＡ２０５Ａ０１）；湖北省农业科技创新中心资助项目（２００７－６２０－００１－０３）作者简介：张国强（１９８２－），男，山东潍坊人，２００５级硕士研究生，（电话）１３７９７０７９４９５（电子信箱）ｇｕｏｑｉａｎｇ＿ｆｓｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ； 通讯作者，杨自文，研究员，博士，（电话）０２７－８７３８９７３２（电子信箱）ｚｗｙａｎｇ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｗｈ．ｈｂ．ｃｎ。 文章编号：０４３９－８１１４（２００７）０５－０７４１－０３ 第４６卷第５期２００７年９月 湖北农业科学 ＨｕｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．４６Ｎｏ．５Ｓｅｐ．，２００７ 泡菜发酵是一种具有２０００多年历史的乳酸发酵工艺。泡菜发酵主要是乳酸发酵，发酵过程中会产生大量有机酸，细菌素，益生菌等，可以调节动物和人体肠道微生态平衡，对机体的健康十分有益，并有帮助消化，防止便秘，防止细胞老化，降低胆固醇，抗肿瘤以及调节人体生理机能等保健和医疗作用［１］。当前各国学者致力于将随机的经典式筛选转变为目标明确的理性筛选，创建新的筛选模型与方法［２］。本文设计了一种使用１０ｍＬＥｐ管培养菌液，用 ＣａＣＯ３中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的新型 筛选方法。 １ 材料与方法 １．１ 样品来源 各地市售泡菜（包括四川、湖北、湖南、江苏、安 徽、福建、甘肃、河南、山东等地） １．２供试指示菌 大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；鼠伤寒沙门氏菌 （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｎｉｕｎｓ）；金黄色葡萄球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓａｕｒｅｕｓ）；枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；蜡状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ），以上菌株 均由湖北省生物农药工程研究中心提供。 １．３培养基［３，４］ 乳酸菌分离培养基（ＢＣＰ培养基）；乳酸菌筛选 培养基（改良ＭＲＳ培养基）；乳酸菌发酵培养基（改良ＭＲＳ液体）；指示菌生长培养基（ＬＢ液体培养基）；抑菌实验培养基（ＬＢ培养基）。 １．４方法 １．４．１乳酸菌分离与鉴定 取各种液体样品（固体 样品需先剪碎、研磨处理），分别用无菌生理盐水作梯度稀释，选择适宜的稀释浓度梯度（１０４，１０５，１０６）用 Ｌ棒涂布ＢＣＰ平板，３０℃厌氧培养４８ｈ，挑取颜色 变黄特征性菌落，多次划线纯化后保存于ＭＲＳ斜 面试管，并做革兰氏染色镜检，符合乳酸菌形态特征的初步判定为乳酸菌菌株。 １．４．２乳酸菌发酵液制备在灭菌的１０ｍＬＥｐ管 一种产抑菌活性物质乳酸菌的快速筛选方法 张国强１，２，杨自文２，王开梅２ （１．西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 ７１２１００；２．湖北省生物农药工程研究中心，武汉４３００６４） 摘要：采用１０ｍＬＥｐ管培养菌液，用ＣａＣＯ３中和酸法筛选产抑菌活性物质乳酸菌的新方法，与传统方法相比具有工作量小，检测手段灵敏，筛选效率高等特点，特别适用于筛选微好氧菌及兼性厌氧菌。关键词：乳酸菌；快速筛选；抑菌活性物质；ＣａＣＯ３中和酸法中图分类号：Ｑ９３９．１１＋７；Ｑ９３．３１ 文献标识码：Ｂ ＡＭｅｔｈｏｄｆｏｒＲａｐｉｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＰｒｏｄｕｃｉｎｇＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃＳｕｂｓｔａｎｃｅ ＺＨＡＮＧＧｕｏ－ｑｉａｎｇ１，ＹＡＮＧＺｉ－ｗｅｎ２，ＷＡＮＧＫａｉ－ｍｅｉ２ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｓａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ； ２．ＨｕｂｅｉＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅ：ＣｕｌｔｕｒｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｙＥｐｔｕｂｅｓａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｙＣａＣＯ３ｔｅｓｔｉｓｒｅｐｏｒｔｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｔｈｉｓｋｉｎｄｏｆｍｅｔｈｏｄｉｓｍｏｒｅｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｈａｎｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄ．Ｉｔｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｅｒｏｂｅａｎｄｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅａｅｒｏｂｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；ｒａｐｉｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅ；ＣａＣＯ３ｔｅｓｔ
雏鸡肠粘膜乳酸菌的筛选及其应用 本研究的目的是分离筛选出专门适用于雏鸡生产、具有抗逆性和抑菌特性的乳酸菌,同时探讨该乳酸菌对雏鸡生长性能、盲肠菌群和免疫功能的影响以及人工感染大肠杆菌情况下对雏鸡的保护力,为乳酸菌在雏鸡生产中的应用提供理论依据。由21日龄雏鸡盲肠粘膜上分离筛选得到20株乳酸菌,应用体外法筛选出在pH3.0处理2h后存活率达60%以上,对0.1%-0.3%胆盐有良好耐受性的6株菌。6株菌对大肠杆菌和沙门氏菌均有良好抑制作用,其中以菌株R5、R9、R19抑菌性能最好。传统的碳水化合物发酵方法鉴定这3株菌分别属于嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、卷曲乳杆菌。通过测定3株乳酸菌的生长曲线、发酵液pH值的变化和稳定期各时间点抑菌圈直径,结果表明:R5菌株生长性能和产酸性能优于其他两株菌,最佳发酵时间为培养18h。最终选定R5菌株用作雏鸡生产的益生素菌种。R5菌株pH3.0接种2小时后存活率为68.15%,0.3%胆盐接种2小时后存活率为42.06%,对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌直径分别为21.17mm和 23.2mm。选用120只体重相近1日龄健康的AA肉仔鸡,分成4组,即对照组、抗生素组、商业菌组和试验菌组,每组3个重复,每个重复10只鸡,公母各半。试验期21天。对照组饲喂基础日粮,饮用清水;抗生素组饲喂基础日粮+20mg/kg 土霉素,饮用清水;商业菌组饲喂基础日粮,饮用清水+商业乳酸菌菌液(10~8个活菌/只·日);试验菌组饲喂基础日粮,饮用清水+试验乳酸菌菌液(10~8个活菌/只·日)。试验测定乳酸菌对雏鸡生长性能、盲肠菌群及免疫功能的影响。试验结果表明:整个试验期,对照组、抗生素组、商业菌组和试验菌组肉仔鸡平均日增重分别为27.60g、29.22g、28.71g和29.61g,试验菌组显著高于对照组(p ＜0.05);各组料重比分别为1.55、1.46、1.47和1.48,商业菌组显著低于对照组(p＜0.05)但与试验菌组无显著差异;试验菌组与抗生素组各周龄雏鸡采食量、日增重和料重比无显著差异(p＞0.05);饲喂试验菌、商业菌和土霉素均能不同程度地降低雏鸡的死淘率和腹泻率;21日龄时,试验菌组较对照组盲肠中乳酸菌数量明显增加(p＜0.05),大肠杆菌的数量显著降低(p＜0.05);与对照组和抗生素组相比,饲喂试验菌和商业菌能显著提高雏鸡胸腺指数(p＜0.05);脾脏指数,试验菌组显著高于对照组(p＜0.05),其它各组间差异不显著;试验菌组血清IgA显著高于对照组(p＜0.05),试验菌组、商业菌组和抗生素组血清IgG均显著高于对照组(p＜0.05)。选用60只1日龄健康的AA肉仔鸡,分成3组,即对照组、抗生素组和试验菌组。对照组饲喂基础日粮,饮用清水;抗生素组饲喂基础日粮+0.02%土霉素,饮用清水;试验菌组饲喂基础日粮,饮用清水+乳酸菌液(10~8个活菌/只·日)。试验第15天对所有鸡进行致病性大肠杆菌攻毒试验,每只鸡灌服1ml大肠杆菌菌液(10~9CFU/ml)连续观察一周。结果表明,攻毒后一周对照组、抗生素组和试验菌组死亡率分别为20%、5%和0%。攻毒前(14日龄)试验菌组体重较对照组提高了3.96%,攻毒后一周(21日龄)试验菌组体重较对照组提高了9.13%;料重比方面,抗生素组和试验菌组较对照组分别降低了8.95%和 7.89%。 【相似文献】 【关键词相关文档搜索】：动物营养与饲料科学; 【作者相关信息搜索】：东北农业大学;动物营养与饲料科学;许丽;王晶;
乳酸菌胞外多糖生理功能的研究进展 摘要：食品级乳酸菌分泌的胞外多糖是近年来乳品科学的研究热点。概述了乳酸菌胞外多糖的来源、分类及生理功能，重点介绍了有关乳酸菌胞外多糖免疫调节和抗肿瘤活性的相关研究，展望了其在发酵制品、保健品和医药等领域研究的开发前景。 关键词：乳酸菌；胞外多糖；生理功能；免疫活性；抗肿瘤 Advancements on physiological functions of LAB exopolysaccharides Abstract: Exopolysaccharide produced by lactic acid bacteria (LAB> have been the focus of dairy research in recent years. This article provides an overview of source, classification and physiological functions of LAB exopolysaccharides, introduces immunomodulatory and antitumor activities of exopolysaccharides and looks forward to the prospects of exopolysaccharides in fermented products, health products and medicine in many fields. Key words: lactic acid bacteria (LAB>。 exopolysaccharide (EPS>。 physiological functions。immuno- modulatory。 antitumor 1 乳酸菌及其胞外多糖 乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB>是能够发酵 碳水化合物并产生大量乳酸的微生物总称，是具 有悠久历史的食品工业生产菌株，被广泛应用于 发酵制品、肉类制品及医药保健品等领域。特别 是在干酪和酸奶等发酵乳制品的生产中，乳酸菌 对产品质构、口感、风味及提高营养价值等方面 发挥重要作用，这些功能特性的改善主要由乳酸 菌分泌的次级代谢产物如胞外多糖来实现 [1] 。 乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides，EPS> 是乳酸菌在生长代谢过程中，发酵产生并分泌 到细胞壁外的一种水溶性长链多糖 [2] ，分子量在 4.0×10 4 ~6.0×10
BBL培养基 双歧杆菌选择性培养基成份 蛋白胨15.0g 酵母粉2.0g 葡萄糖20.0g 可溶性淀粉0.5g 氯化钠5.0g 5%半胱氨酸10.0mL 西红柿浸出液400.0mL 吐温80 1.0mL 肝提取液80.0mL 琼脂20.0g 蒸馏水520.0mL pH7.0 MRS培养基 乳酸细菌培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g 牛肉膏10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 吐温80 1.0 mL 乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 琼脂18.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.2~6.6 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享 奉上一篇实验，以供参考！ 厌氧菌的分离和培养 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 1材料 1.1 样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 1.2 培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 1.3 仪器和器具 亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。 2 流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 3方法 3.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 3.2 预还原培养基及稀释液的制备
细胞筛选 一嘌呤霉素 (一)确定最优筛选浓度 当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时，需进行滴定，或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言，嘌呤霉素浓度范围在2-10微克/毫升时是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。 1.培养待转染（而不是转染后）的细胞。（筛选的目的是杀灭未转染的细胞） 2.取对数生长期的细胞（一般在铺满培养器皿底部的70%~80%时），用新鲜无抗无血 清的培养基制成1.5×105个/ml的细胞悬液。 3.向96孔培养板中加细胞悬液，每孔100微升（使每孔细胞数在1.5×104个），然后 向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量，培养箱中静置培养过夜。（这样做是为了保证在固定细胞密度下确定最佳G418药物筛选浓度。） 4.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0,2,4,6,8,10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基 溶液替换各孔中的旧的培养基。（每个浓度可用两个复孔，相当于每个浓度测定三次）。（注意：对于多数细胞种类而言，过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。） 5.每日检查细胞活力，根据细胞活力，每三天(即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无 抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快，可以缩短换液时间（每隔一天）。 6.在正常的实验操作规程时，一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率和一
般生存时间而定，大概需3到14天。在所需时间之后，嘌呤霉素的导致所有细胞 死亡的最小浓度就是应该用于该细胞和该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死 所有细胞的浓度。 (二)转染细胞 1.第一天：在60mm培养皿内种植细胞，细胞密度为能使第二天细胞融合能达到 70%-80%的密度，CO2孵箱过夜培养。 2.第二天：准备3ml无抗生素无血清培养基，加入Polybrene使其终浓度为8μg/ml。 将已经制备的病毒颗粒0.5ml加至上述培养基，轻吹混匀。去除60mm培养皿内的 旧的培养基，加入含病毒培养基。（Polybrene能够增加病毒感染的效率，然而， 有时候Polybrene对细胞有毒性。这时，可以用ProtamineSulfate代替Polybrene） (三)筛选细胞 1.病毒感染后24小时，可以换用含最优浓度puromycin的培养基。 2.如果病毒对细胞有毒性，可以减少感染时间至4-6小时，然后换用新鲜培养基， 24-48小时后换加含最优浓度puromycin的培养基。最好设立一个对照皿，不加病 毒液，加入Ploybrene，观察Polybrene是否对细胞有毒性；如果Polybrene没有 毒性，还可以加入puromycin，作为puromycin是否有效的对照。 3.以后每隔一天换用新鲜含puromycin的无抗生素无血清培养基，以替换含大量死细 胞的培养基。直到抗性群落能被识别出（一般是在筛选后10到12天）。 4.待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm 平皿内。
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
蜜环菌母种培养基筛选试验 熊 鹰,姜 邻,唐利民 (四川省农科院食用菌开发研究中心,四川 成都 610066) 摘要:分别将两株蜜环菌Am01和Am09接种于三种不同配方和三种不同琼脂含量的斜面培养基上,试验结果表明,两株蜜环菌菌丝均在含“A”物质和牛肉膏浸提液的培养基上生长最快,菌索最健壮,满管时间最短。在三种不同琼脂用量的培养基上,以每1000m L琼脂用量为15g菌丝菌索生长势最佳。在同一培养基质上蜜环菌Am09的长势和长速显著优于Am01。 关键词:蜜环菌;培养基;筛选 中图分类号:S64611+9 文献标识码:A 文章编号:1003-8310(2004)05-0025-02 蜜环菌(Armillaria mellea)属担子菌亚门、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。子实体、菌丝、菌索均可入药。而且菇体味道鲜美,营养丰富,该菇是一种著名的食药兼用菌[1]。但蜜环菌的深入研究和广泛应用则始于天麻野生变家栽。天麻生长离不开蜜环菌,蜜环菌是天麻无性繁殖生长阶段的营养物质基础。因此,蜜环菌的纯培养研究一直以来方兴未艾,但是无论食、药用菌专著,还是专业期刊关于蜜环菌纯培养的母种培养基均报道为PDA或改良PDA。据笔者试验发现,蜜环菌在PDA或改良PDA 基质上虽能生长,但菌丝灰白,细弱,易于核化,菌索生长势差,一般需要15～20d才能长满9cm 长的斜面。因此,笔者进行了配方试验,以期寻找能使蜜环菌茁壮生长的母种适宜配方;同时在自然条件下,蜜环菌均生长在多雨潮湿的环境中,含水量要求较高,在同一配方条件下,由于凝固剂———琼脂用量不同,其培养基含水量也不一样,通过每1000m L中不同琼脂使用剂量,寻找适宜凝固剂用量;旨在确定蜜环菌生长繁殖的最适培养基配方和琼脂使用剂量。 1 材料与方法 111 材料 11111 供试菌株:蜜环菌Am01和Am09均由本院菌种保藏中心提供。 11112 不同培养基配方:①A(纯天然物质)浸提液培养基(每1000m L培养基含200g的A物质浸提液,另加5g牛肉豪,葡萄糖20g,琼脂20g)。 ②改良PDA培养基(每1000m L培养基分别含200 g马铃薯和50g麸皮的浸提液,另加葡萄糖20g,琼脂20g)。③马铃薯—松针培养基(每1000m L 培养基分别含200g马铃薯和50g松针的浸提液,另加葡萄糖20g,琼脂20g)。 11113 不同凝固剂用量:以培养基配方①为基础,分别将每1000m L培养基的凝固剂用量设为10g、15g和20g三种不同剂量。 112 试验方法: 11211 不同母种培养基的筛选:将蜜环菌Am01和Am09分别接种于上述三种不同配方的培养基斜面中部,在25℃下恒温培养,定期观察菌丝生长状况,记录复活时间,长势,菌索萌发时间,菌索长势及菌索满管时间,每处理重复10次。 11212 不同凝固剂用量比较:将蜜环菌Am01和Am09分别接种于11113的3种不同琼脂用量的培养基斜面中部,在25℃下恒温培养,定期观察菌丝复活状况,记录复活时间,长势,菌索萌发时间,菌索长势及菌索满管时间,每处理重复10次。2 结果与分析 211 不同菌株生长情况比较:图1为接种培养10 d后的Am01和Am09在三种不同配方和三种不同凝固剂使用量上菌丝的生长势图,编号3、4、5分别为培养基配方①、②和③,编号1、2、3、分别为琼脂每1000m L用量10g、15g、20g,左起单数并贴有标签的试管为培养基正面,双数与相邻左边试管为同一处理的培养基背面生长情况,从图1观察可以看出Am01在三种不同配方和三种不同凝固剂用量的培养基上无论菌丝还是菌索长势均不如Am09,因此就菌种培养而言,蜜环菌Am09是一个生长繁殖速度快,菌索分枝多而粗壮的菌株。212 不同培养基配方比较:Am01接种在配方①、②、③上菌丝复活的时间分别是4d、6d、5d,菌索萌生时间分别为6d、8d和8d;Am09接种在①、②、③上菌丝复活的时间分别是3d、5d和5 d,菌索萌发时间分别是5d、7d和6d。从菌索长势看,Am01和Am09有相似的趋势,在配方①上菌丝色泽更白,不易核化,菌索更粗壮,分枝也更茂盛;在配方②上菌丝纤细,颜色灰白,易于核化,菌索粗壮但分枝极少,而且菌索穿透培养基质伸展速率比配方①慢得多,一般而言,从菌索开始 收稿日期:2003-12-1552 第23卷 第5期 中国食用菌 E DI BLE FUNGI OF CHI NA
用途:用于食品中霉菌和酵母菌总数的测定。 成分(g/L) 蛋白胨 5.0 葡萄糖 10.0 磷酸二氢钾 1.0 硫酸镁 0.5 琼脂 20.0 孟加拉红 0.033 氯霉素 0.1 用法 称取本品 36.6g,加热溶解于 1000ml 纯化水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌 15 分钟备用。 蒙金娜基础培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 3g, KCl 0.3g，FeSO4 7H2O 0.03g，MnSO4 H2O 0.03g，MgSO4 7H2O 0.3g，CaCO3 5g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000ml，pH7.0~7.5。灭菌前分装为10×100ml小瓶，每组1瓶。 1. 无机磷培养基 100ml的蒙金娜基础培养基加入1g磷矿粉（或磷酸钙2g作为无机磷源）和2g琼脂粉，包装，灭菌。 2. 有机磷培养基 100ml的蒙金娜基础培养基加入2g琼脂粉，包装，灭菌。 用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，用解剖刀切破鸡蛋两端，流去蛋清后将蛋黄流入已灭菌的锥形瓶中，约加入等量的无菌水，摇匀。 待灭菌后的蒙金娜基础培养基冷却至50℃后，立即加入卵黄液，每100ml 的蒙金娜基础培养基加卵黄稀释液1ml作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板。 溶磷圈直径（D）和菌落生长直径(d)的比值(D/d)是表征解磷菌相对解磷能力的一个指标。
用途 用于利用硅酸盐的微生物的分离培养。 成分（g/L） 蛋白胨10.0g 酵母浸粉 2.0g 胰酪蛋白胨10.0g 氯化钠 5.0g 葡萄糖 1.0g 亚硫酸氢钠 0.1g 琼脂15.0g PH值7.0±0.2 蔗糖5g，Na2HPO4 2g，MgSO4 ·7H2O 0.5g，FeCl3 0.005g，CaCO3 0.1g，铝土矿0.5g，琼脂l0～20g，水1000ml，pH 70～7.5 查了几篇国内的文章基本都是这样，只是铝土矿这里有点变化，有用高岭土的，也有用石骨子粉的，看你自己的需要和条件了。 解磷细菌培养基 用途:用于利用无机磷细菌的分离培养。 成分(g/L) 葡萄糖 10.0 硫酸铵0.5 氯化钠0.3 硫酸镁0.3 硫酸锰 0.03 硫酸钾0.3 硫酸亚铁 0.03 磷酸钙 5.0 琼脂 15.0 pH值7.0-7.5 用法 称取本品 31.4g ,加热溶解于1000ml 蒸馏水中,分装,116℃高压灭菌30 分钟,备用。 有机磷细菌培养基 用途:用于测定磷细菌肥料中磷细菌解有机磷效能。 成分(g/L)
HAT培养基的筛选原则
HAT培养基的筛选原则??HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（de novo pathway）和中间合成途径（salvage pa-thway）。 由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。 单克隆抗体技术中也要选择有用的杂种细胞（即能产生抗体，又能无限传代） 根据细胞特性，抑制一些细胞的生长，而促进另一些细胞的生长而达到选择的目的。 HAT即次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脱氧核苷的首字母缩写。
显然HAT培养基中含有以上三种物质。 对于合成DNA的原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有其实起始合成途径和中间合成途径。 由于氨基蝶呤可以抑制起始合成途径，故在次培养基上的细胞只有中间合成途径，对于没有中间合成途径的细胞来说，就无法进行合成，而致其死亡，用此原理筛选出杂种细胞。例如嘌呤的中间产物缺失株和嘧啶中间合成缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞在HAT培养基中可以增殖，故可以达到筛选的目的。 次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可以作为中间合成途径的原料进行添加。
酵母菌选育、最适培养基筛选及菌种发酵培养 [摘要]在无菌条件下，用紫外线对酵母菌(yeast)进行不同时长的照射诱变处理，选出合适的诱变菌种进行振荡培养。经振荡培养后的诱变菌种运用正交试验设计的方法采用四个因素三个水平选出最适的菌种培养基，进行进一步的发酵培养。在发酵罐中加入最适培养基成分和合适的酵母菌诱变菌种进行发酵扩培，最终获得大量的菌种和发酵产物。 [关键词]酵母菌，紫外线，最适培养基，正交试验设计，发酵培养 面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种单细胞微生物，是酵母菌的一种,它含蛋白质50％左右，氨基酸含量高，富含B族维生素，还有丰富的酶系和多种经济价值很高的生理活性物质。几千年前人类就用面包酵母发酵面包和酒类，在现代食品工业方面，广泛用作人类主食面包、馒头、包子、饼干糕点等食品的优良发酵剂和营养剂。 本实验选用的物理诱变因子为紫外线，DNA能强烈吸收紫外线，尤其是碱基中的胸腺嘧啶，从而在形成二聚体，改变DNA结构，引起基因突变。本实验的面包酵母菌经不同时长的紫外线诱变处理，培养出的适合的诱变菌种进行最适的菌种培养基的筛选和发酵培养。 最适菌种培养基的筛选是通过正交实验设计进行的。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。正交表是一整套规则的设计表格，用L为正交表的代号，n为试验的次数，t为水平数，c为列数，也就是可能安排最多的因素个数，本实验采用了四因素三水平进行最适培养基的筛选。 选出合适的诱变菌种和适合诱变的酵母菌生长的培养基后，便可以能过发酵罐进行发酵培养，分时段观察记录发酵过程中的PH，溶氧，菌种数。绘制出面包酵母的生长曲线 １材料与方法 1.1实验材料 菌种： 面包酵母菌 仪器： 高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，光学显微镜，恒温培养摇床，分析天平，小型发酵罐 用品： 枪头及1mL和0.5mL移液器，三角瓶，试管，玻璃涂棒，平皿，血球计数板，酒精灯，棉