琼脂糖凝胶的配制是分子实验室比较基本的操作，因此正确地操作对整个实验来讲很有必要，大体流程如下：称量、熔胶、倒胶、拔梳。
1.称量我们通常所说的0.8%、1%的胶都是指的质量体积分数，即所称取的琼脂糖粉的质量（g）比所加的TBE缓冲液的体积（mL）即胶的浓度。缓冲液的体积根据胶板的大小而定。如小胶板0.8%的胶需要琼脂粉0.104g，TBE13mL。
2.熔胶将所称量的琼脂粉与TBE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。
3.倒胶干净的胶槽内摆好梳子，往胶内滴加1uL左右核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。
4.拔梳.待大约20min后，轻轻拔掉梳子（若不好拔，可以滴加适量的TBE缓冲液）。
有不同的浓度：1%、1.2%、2%、3%等
一般用1%浓度的凝胶用来分离几百到几千bp大小的DNA。
称好琼脂糖后，放入TAE或TBE buffer中，用微波炉加热溶解，冷却至55 ℃时，加入少量EB或替代物，倒入模中，冷却凝固。
内容
TE缓冲溶液buffer solution
TE是有Tris和EDTA配置而成的，主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。
TE缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们是蛋白质、重碳酸盐缓冲体系和磷酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。
在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。
由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。
硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。
柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。
三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力差。
配置
×TE Buffer
组成浓度：10mM Tris-HCl1mM EDTA PH=8.0
配制量：500ml
配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中
1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml
0.5M EDTA PH=8.0 1ml
向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.
编辑本段作用及用途
作用
TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性,(DNA在它是的稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂),包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液是保存.
用途
TE缓冲液是Tris +EDTA缓冲液，这种缓冲液我们一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控PH，TAE是一种电泳缓冲液，主要用于DNA分子的电泳。 TE组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0 配制量：500ml 配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中 1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml 0.5M EDTA PH=8.0 1ml 向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.
TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE 缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。50×TAE Buffer 配制方法： 1. 称量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 3加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4.加去离子水定容至1L 后，室温保存。
琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶的制备 一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 ① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 表琼脂糖浓度与DNA分离范围
琼脂糖凝胶电泳及其影响因素 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 1、 DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 2、琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 3、 DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA 移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
琼脂糖凝胶的制备 一、琼脂糖凝胶的特点 天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80％）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 1. 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 2. 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％~99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug 蛋白质就可检出。 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 ① DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ②琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 表琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 /％
琼脂糖凝胶电泳操作标准流程 一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA 、RNA 分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA 分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA 分子的迁移速度不同。如环形DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA ）、开环分子（ocDNA）、和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：cccDNA > IDNA >ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA 分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA 构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB ）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA 复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。 三、材料、试剂及器具 1、材料 不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker （分子量标准）（TaKaRa）；D2000（TianGen）；
琼脂糖凝胶电泳的应用 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 1.分离纯化大片段DNA 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。分离后如需回收：将需要的DNA胶部分切下，尽量不要切到多余的胶。切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚或氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。 2.提取大分子DNA构建大片段基因组文库的关键就是获得高分子量的基因组DNA。而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA;酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA，但极易造成基因组断裂，也难以得到大于300kb的基因组DNA。两种方法均不能达到目的，但经过研究人员不懈的研究，利用琼脂糖凝胶制备成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。在此过程中研究人员在用低熔点琼脂糖还是普通熔点琼脂糖制备凝胶块的问题中选择了后者，因为低熔点琼脂糖价格昂贵且胶块在制备纯化的过程中容易断裂，而普通熔点琼脂糖与低熔点琼脂糖在基因组DNA制备方面没有区别。 3.PCR产物检测在基因组DNA的提取中，DNA经孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗涤2次，再适量的双蒸水溶解DNA。然后在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以1kb DNA ladder 为参照，估计DNA溶液浓度。具体检验方法是:2.0%琼脂糖制成凝胶，取6 微升AFLP-PCR产物与1微升上样缓冲液混匀后上样，用1×TBE电泳缓冲液，120V电泳50min，使用EB溶液染色后在凝胶成像系统(ChampGel-3200)上观察拍照。 4.免疫扩散法中的应用免疫扩散法是指抗原与抗体在同一凝胶中扩散的方法，是观察可溶性抗原与相应抗体反应和抗原抗体鉴定的最基本方法之一。利用琼脂糖凝胶作为扩
配1%的琼脂糖凝胶 称量琼脂糖0.3g，倒入锥形瓶中，再用量筒量取30ml TAE，混到一起，放入微 波炉中煮沸两次，直到看不到颗粒为止（每次大约三分钟），取出后冷却至60℃左右后加入Gold view（万分之一），同时将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。吸取少量琼脂糖溶液封固胶膜边缘，任其凝固，在 距离底板0.5～1.0mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加 样孔，将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个 有机玻璃板表面形成均匀的胶层。凝胶的厚度在3～5mm之间，检查一下梳子 的齿下或齿间是否有气泡。冷却好后拔梳子（30min左右），将板放入电泳槽里，倒入TAE溶液（1X），在冰箱中拿Loading buffer和两个maker（1kb和 D100），将Loading buffer吸到PE手套上（吸取量随意用枪点一下即可）和样 品混匀，向凝胶中加样，两侧的孔里加Maker，通电120V跑胶，红为正，黑为 负（DNA带负电，所以往红色正极处跑），放到紫外盒上看结果，同时将亮带 部分切下来放入1.5ml的已经称完重量的EP管中（若忘了称重量，按照0.9计算），再次称重计算胶的重量，接下来按照DNA回收试剂盒操作步骤回收DNA，测浓度。 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作步骤 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl平衡液BL，12,000 rpm(~13,400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收 集管中。（请使用当天处理过的柱子） 2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净 的离心管中，称取重量。 3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 μl， 则加入100 μlPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以 确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶 胶液，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。 注意：对于回收<300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的 异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为 吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。 4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放 置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附 柱CA2放入收集管中。 注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可分批加入。 5. 向吸附柱CA2中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙
?RNA琼脂糖凝胶电泳： 配制： 1.0.5M EDTA（pH=8.0）： 100ml：称取18.61g Na2EDTA·2H2O（分子量372.24），加80ml ddH2O剧烈搅拌， 用NaOH调节PH值至8.0（约需2g NaOH）.高压灭菌，室温保存。 2.50×TAE loading buffer:（Tris acetate-EDTA buffer）电泳缓冲液 组分：2M Tris-乙酸；100mM EDTA（pH=8.0） 500mL:称121.1g Trisbase（分子量121.14），加800ml ddH2O溶解，加57.1ml 乙酸和50ml0.5M EDTA溶液（pH=8.0），搅拌，ddH2O定容至500mL.室温保存。 3.1×TAE loading buffer: 取20ml50×TAE，ddH2O定容至1L.室温保存。 4.100×Sybergreen： 500ul：取495ul1×TAE于1.5ml离心管，加入5ul Sybergreen原液混匀，4℃锡纸 避光保存。 注意：Sybergreen原液需稀释10000倍； 6×DNA loading buffer上样缓冲液需稀释六倍，最终稀释倍数应不小于1×。 步骤： 1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml，我们用30ml): 称0.3g琼脂糖置于100ml锥形瓶中，加入30ml1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。 微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。 2.胶板制备: 取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并放好梳子. 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3.加样: 样品制备：（10ul体系/样品槽）于0.25ml离心管中 样品RNA（最后加）:2ul/3ul/5ul 6×DNA loading buffer:10/6=1.7ul 100×Sybergreen：0.1ul DEPC水：至10ul (注意:加样前要先记下加样的顺序).分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个枪头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面. 4.电泳: 加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5.电泳完毕后,取出凝胶,利用科212凝胶成像系统,在紫外灯（trans UV）下观察拍照 保存.DNA存在则显示出红色荧光条带.RNA完美提出应该是三条带：28，18,5.8。 28和18比较亮,而且28是18亮度的2倍,5.8基本很模糊，可有可无
实验二琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测 一. 实验目的 1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理; 2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 二、实验原理 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。 1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1)DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA） 2) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose：0.5%：1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%：0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环 4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm
5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃ 6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) 7)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。 2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 4、电泳缓冲液：TAE TBE TAE 与 TBE不同之处在于TBE用硼酸代替了TAE中的冰醋酸。 三、仪器和试剂 仪器 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉 试剂 琼脂糖：1.0%； 电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ） EB：5 μl / 100 ml TBE 电泳材料：标准分子量核酸（DL2000） 四、操作步骤 （1）制胶（以20 mL为例） a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的TAE缓冲液（pH 8.0），摇匀；
实验五 PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 一、实验目的 1. 掌握PCR扩增技术的基本原理 2. 掌握PCR的常规操作 3. 熟悉PCR反应体系中几种主要成分的作用 4. 了解PCR技术的应用 5. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的方法 6. 熟悉DNA在电泳过程中迁移率的决定因素 二、实验原理 1. PCR基本原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，类似DNA的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链DNA变性为单链DNA、单链DNA能与引物复性（退火）成为引物-DNA单链复合物、以及在dNTPs存在下DNA聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链DNA（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个PCR循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量（106倍）的要扩增的DNA片段。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 重复循环“变性—退火—延伸”三个过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2. PCR反应体系 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA 片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的
Q-琼脂糖凝胶 FF 产品说明书 Q-琼脂糖凝胶 FF 是将三甲胺基烷基季铵基团键合在高流速琼脂糖微球上形成的一种强阴离子交换介质。广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。 1. 外观 本品呈白色，球状、无嗅、无味。 2. 理化指标 项 目 指 标 离子交换基团 -CH 2N +(CH 3)3 离子交换类型 强阴离子，可交换离子Cl -基 质 6% 交联琼脂糖** 蛋白质吸附容量 120mgHSA/ml 介质 总离子交换量 0.18-0.25mmol/ml 介质 形状 球形 粒径 45~165μm 流 速 400~700 cm/h* 最大流速750 cm/h 工作温度 4~40 ℃ 耐热 pH7水中120℃30min 耐压 0.3MPa pH 值稳定性 1~14 (短时间，在位清洗)；2~12(长时间) pH 工作范围 2~12 化学稳定性 在以下液体中稳定：所有常用的水相缓冲液；1mol/L 氢氧化钠；8mol/L 尿素；6mol/L 盐酸胍；70% 乙醇 *检测条件： 层析柱10mm×300mm *柱床高15cm,25℃, 流动相为0.1mol/LNaCl 3. pH 滴定曲线： 4． 包装 产品以聚胺酯瓶密封包装，外贴标签，注明“品名、体积、颗粒大小” 等内容。
5．运输 运输中应避免日晒、雨淋、重压，严禁与有毒、有害物品混运。 6．贮存 产品应密封贮存在4℃~25℃（保存溶液为20% 乙醇），通风、干燥、清洁的地方。不能冷冻。 用过的柱子贮存在4℃（20% 乙醇）。 7.注意事项 本产品避免与氧化剂接触；避免在pH值< 4时长时间暴露(一周,20℃)。 8.保质期：暂定5年。 9.应用 本产品具有高化学稳定性、高流速、高载量、好的机械性能、可在位清洗、多次重复使用等特点，非特异性吸附低，回收率高，适用于工业规模生产，适用于在pH工作范围内可形成负离子的生物大分子的分离纯化，广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的离子交换制备。 下面简要介绍介质的使用过程。 9.1 装柱 ⑴让所有的材料和试剂达到室温。配制初始缓冲液（平衡液）和洗脱缓冲液。 ⑵根据柱子大小取所需量的凝胶，清洗掉20%乙醇，抽干，用初始缓冲液（按凝胶：缓冲液=3：1的比例）配成匀浆。匀浆作脱气处理。 ⑶将柱内及柱子底端用水或缓冲液润湿并保持一小段液位（液面略高于滤膜），务必使底端无气泡。 ⑷用玻璃棒引导匀浆沿着柱内壁一次性倒入柱内，注意勿使产生气泡。打开柱子出液口，使凝胶在柱内自由沉降，连结好柱子顶端柱头。 ⑸打开蠕动泵，让缓冲液用使用时流速的1.33倍的流速流过，使柱床稳定。用2~3倍柱体积的缓冲液平衡柱子。 9.2平衡 让平衡缓冲液以一定流速流过柱子，到流出液电导和pH不变。平衡液是低浓度的缓冲溶液，如Tris 、PBS等。 9.3上样 ⑴样品用平衡液配制，浑浊的样品要离心和过滤后上样。盐浓度太大的样品处理后再配。 ⑵一般情况是让目标产品结合在柱子上，用平衡液洗去杂质，再选择一种洗脱液洗下目标产
琼脂糖凝胶电泳 1.原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 2操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 琼脂糖凝胶电泳：水平电泳 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 (1)电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 (2)凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 (3)缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE 缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。 (4)电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 (5)DNA样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 (6)DNA的上样
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在 固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻 璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝 胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内, 每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动 到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存 实验原理 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。 实验材料和试剂 （一）实验样品 质粒pUC118 （二）试剂 1．l DNA/HindIII分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA (配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml） 5．0.7% 琼脂糖凝胶
电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。 原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。 琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。 DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。 琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢 常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 EB是强致癌剂。 电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套 1、胶槽准备 ①将凝胶托盘放入制胶盒中; ②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙; ③将制胶盒放在调整好的水平台上。 2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ①称0.15g琼脂糖置三角瓶中，加15ml 1×TAE; ②微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖; ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入DNA染料，并轻轻混匀。 3、倒胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的制胶盒内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右冷却，凝胶固化。 4、轻轻拔出固定在凝胶中的加样梳。将带凝胶的凝胶托盘置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可,出去样品孔的气泡。 6、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/10的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 7、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般5-7μl。 8、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：5v/cm；时间20-30分钟左右 9、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。
DNA琼脂糖凝胶电泳 跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。 一、基本原理 当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。 由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*t d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。 在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。 二、琼脂糖凝胶电泳 通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格： 琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb 0.3 50---60 0.6 1----20 0.7 0.8---10 0.9 0.5---7.0 1.2 0.4----6.0 1.5 0.3---3.0
琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项： 1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。 6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
琼脂糖加样时候注意事项： 1、用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul，因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。 2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝），用以看出样品移动的距离。 4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品，电泳结束后，根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。 6、电泳结束后，将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA 带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NDA结合。另一种方法是电泳时，在胶中加入EB。 7、在紫外灯下，由于EB发出强烈的橘红色的荧光，所以可以看到DNA带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng DNA。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样，利用特制的照相机和调焦器，也可以对凝胶拍照。 8、如果要对某一条带（如质粒）进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来，从带中回收DNA。
实验十四琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段 一、原理 DNA分子在碱性环境中(PH8.3缓冲液)带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子质量及构型的不同在电泳时泳动的速率就不同，从而可以分出不同的区带。电泳后经gelview染色，在波长254nm紫外光照射下，单链DNA显红色荧光，双链DNA显绿色荧光。也可染RNA。 二、试剂： 1.琼脂糖 2.TBE缓冲液：0.89M Tris—0.89M H3BO3(硼酸)—0.02M EDTA，pH8.3；称取10.880 g Tris，5.520 g硼酸，0.740g EDTA·Na2·2H2O，溶于无离子水中，定容至200ml，用时稀释10倍。 3.溴乙啶贮存液：5g/L，纯水配制，不需消毒。贮棕色瓶于4℃保存。 4.DNA样品液：实验所提取的DNA或前面PCR产物 5.上样缓冲液：40%蔗糖，0.25%溴酚蓝；或Loading buffer 6.无离子水 三、仪器： 微波炉，封口膜(胶)，电泳仪及槽，加样器、头(20ul)，紫外分析仪或凝胶成像仪 四、操作 1.制备琼脂糖溶液： 称取0.18克琼脂糖溶于30ml TBE缓冲液中，沸水浴或微波炉煮沸至琼脂糖完全溶解。将溶液冷却到60℃，加入gelview染料3ul(终浓度0.5μg/ml)。 2.制备凝胶板 用封口膜(胶)将凝胶槽缺口封住，置水平玻板或工作台面上，将梳子安放在槽的凹槽内，梳子底边须离开电泳架表面1mm左右。将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，胶厚约3mm，冷却30分钟。待胶凝聚后小心地取出梳子，将凝胶放入装有TBE缓冲液的电泳槽中，TBE缓冲液要浸没过凝胶面2mm-3mm。 3.加样 将样品(样品液∶上样缓冲液=5∶1)小心加入胶板的加样孔内，加样量不宜
实验原理、材料、方法、结果、讨论 琼脂糖凝胶电泳操作步骤 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝 加样：加样端为负极（黑） 电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相 PCR-SSCP 聚合酶链反应单链构象多态性 PCR实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA 聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。 介绍：PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 PCR-SSCP分析的基本程序： 1、通过PCR扩增特定靶序列， 2、将扩增产物变性为单链， 3、进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 PCR反应体系：（单位：微升） Buffer液： 2.5 引物1： 1 引物2： 1 dNTP: 2 模板DNA： 1 双蒸水： 16.5 Taq DNA聚合酶： 1 非变性聚丙烯酰胺凝胶: 1、30%聚丙烯酰胺（交联度49:1） 4ml，
2、50×TAE缓冲液 0.2ml， 3、1%TEMED 1ml 5、蒸馏水 4.7ml， 4、10%过硫酸铵（AP） 0.1ml 银染步骤： 1、电泳结束，小心取出凝胶，置10%乙醇液中固定5分 钟。（防止再扩散） 2、置凝胶于1%硝酸氧化3分钟。（预处理） 3、用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。 4、置凝胶于0.012mol/L硝酸银液中20分钟。使银离子 与DNA结合。 5、弃去硝酸银，用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。 6、用0.019%甲醛液，含0.28mol/L无水碳酸钠使胶还 原，银离子变成银颗粒而显色。直至所需的显色深度。 7、置凝胶于10%冰乙酸停止还原反应。 8、弃去冰乙酸，以双蒸水洗涤即可 混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1×TAE），缓冲液应高于加样孔上缘。 结果分析: 单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA 单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。