学校代码10459
学号或申请号201312443242
密级Array硕士学位论文
叉头状转录因子O1对高糖诱导下小鼠足细胞线粒体自噬的影响及机制研究
作者姓名：李雯
导师姓名：秦贵军教授
学科门类：医学
专业名称：内科学（内分泌及代谢病）
培养院系：郑州大学第一附属医院
完成时间：2016年3月
A thesis submitted to
Zhengzhou University
for the degree of Master
The Effect and Molecular Mechanism of Forkhead Transcription Factor O1 on High Glucose-Induced Mitophagy of Mouse Podocyte Cells
By Li Wen
Supervisor: Prof. Guijun Qin
Department of Endocrinology and Metabolism The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Mar，2016
学位论文原创性声明
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学位论文作者：日期：年月日
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学位论文作者：日期：年月日
摘要
叉头状转录因子O1对高糖诱导下小鼠足细胞线粒体自噬的
影响及机制研究
研究生：李雯
导师：秦贵军教授
郑州大学第一附属医院内分泌科
郑州450052
摘要
背景
糖尿病肾病(Diabetes nephropathy，DN)是一种糖尿病微血管并发症，并且已经成为糖尿病对生存率危害最大的并发症之一。DN是导致终末期肾脏疾病(end stage renal disease，ESRD)的首要独立病因。足细胞损伤在DN发病中被认为是引起蛋白尿和肾小球硬化的关键。蛋白尿的产生主要是由于肾小球滤过屏障（glomerular filtrating barrier，GFB）的完整性受到破坏，进而影响其选择透过蛋白的功能。足细胞(Podocyte)是体内一种高度分化的细胞，定位于肾小球基底膜外侧，其胞体可伸出较自身长度数倍的一级和次级足突，包绕肾小球，相邻足突之间的直径为30-40nm的间隙又被渗透性裂孔隔膜(silt diaphragm，SD)所填充。作为肾小球滤过屏障的最后一层结构，足细胞及SD的完整性对维持肾小球滤过功能具有重要作用。
叉头状转录因子O1(Forkhead transcription factor，FoxO1)属于叉头状转录因子O亚家族，在调控细胞抗氧化应激、静止/进入细胞周期、凋亡、增殖、炎症反应、糖脂代谢及自噬等多种病理生理过程，也在糖尿病肾病的发生发展中扮演重要的角色。研究表明，在使用STZ模拟的的DN鼠肾脏皮质中，FoxO1的转录活性呈抑制状态。
I
摘要
在真核细胞内，线粒体是有氧代谢活动发生的主要场所，因此也是细胞内活性氧（ROS）产生的主要部位。在正常生理状况下，细胞可通过包括线粒体自噬（mitophagy）在内的一系列途径清除受损或衰老线粒体，以维持细胞内ROS 含量的稳定。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）诱导的激酶1（PTEN induced putative kinase 1, PINK1）是细胞在氧化应激状态下诱导生成的一种促生存因子，是参与调节线粒体自噬的重要功能蛋白之一，在高糖培养下的足细胞中表达量下降。有研究表明，在心肌细胞中PINK1可以作为FoxO1下游基因，参与氧化应激刺激中细胞的生存调节。DN发生时，FoxO1的肾脏保护作用是否也与活化PINK1，继而调节线粒体自噬，减少ROS过度生成有关，目前尚需进一步研究提供证据。
目的
观察FoxO1对高糖环境下小鼠足细胞线粒体自噬和线粒体功能的影响及作用机制。
方法
构建含组成性激活突变型（Constitutively active，CA）和短发夹RNA（shRNA）FoxO1编码序列的慢病毒载体（LV-CA-Fox01、LV-shFoxO1）、PINK1短发夹RNA （LV-shPINK1）及空慢病毒载体（LV-NC）。
36只SPF 级雄性KM 小鼠，随机选取其中27 只使用STZ诱导构建DN 模型，9只作为正常对照组（NG 组）。造模成功后，将成模鼠随机分为3 组：糖尿病组（DM 组），糖尿病CA-FoxO1转染组（CA 组）和糖尿病空病毒转染组（NC 组）。小鼠麻醉后，在解剖显微镜下右侧肾皮质点注射CA-FoxO1慢病毒载体及空慢病毒载体（LV-NC）10μl×3处。于病毒注射后12 周末，尾静脉取血测血糖后麻醉小鼠，迅速剥离出肾脏，置于4%多聚甲醛中固定用于HE检查，于4%预冷戊二醛固定用于电子显微镜检查。新鲜肾脏于液氮中冷冻，qRT-PCR检测肾皮质中FoxO1mRNA水平，蛋白免疫印迹法检测各组肾皮质中FoxO1、p-FoxO1、PINK1、parkin、p62、MFN2蛋白表达。
II
摘要
转染培养在正常糖浓度(5.6mmol/L)培养基中的条件永生性小鼠足细胞（Conditionally immortalized mouse podocyte cell line, CIMPs）。将细胞按不同培养环境及处理分为：①正糖对照组（NG，5.6mmol/L）；②单纯高糖组（HG，25mmol/L）；
③FoxO1上调组（HG+LV-CA-FoxO1）；④双转染组（HG+LV-CA-FOxO1+LV-shRNA-PINK1）；⑤HG+空慢病毒转染组（HG+LV-NC）；⑥正常糖+FoxO1下调组（NG+LV-shRNA-FoxO1）。各组处理72h后，qRT-PCR检测①-③及⑥组FoxO1mRNA表达水平，蛋白免疫印迹法检测①-⑤组PINK1、Parkin、MFN2、p62蛋白表达水平；细胞免疫荧光化学检测①-③及⑥组FoxO1蛋白分布情况；染色质免疫共沉淀（ChIP）法检测FoxO1与PINK1启动子的结合情况；透射电镜观察①-⑤组线粒体及自噬体；激光共聚焦显微镜观察①-⑤组腺病毒载体介导的GFP-LC3与线粒体荧光探针共定位观测线粒体自噬水平；流式细胞仪结合DCFH-DA荧光探针法检测①-⑤组ROS的生成率，JC-1试剂盒测①-⑤组细胞线粒体膜电位。
结果
1. 在DN模型鼠肾皮质中，慢病毒转染可上调FoxO1表达：与NC 组相比，DM 组FoxO1 mRNA表达变化无统计学意义（P>0.05），而CA 组FoxO1 mRNA 水平较DM组明显上升(P<0.05)，p-FoxO1/FoxO1比值明显下降(P<0.05) 表示高糖可以诱导FxoO1转录活性下降。
2. 上调FoxO1转录活性可以增加PINK1/parkin途径相关蛋白表达量，减缓小鼠DN进展：蛋白免疫印迹结果显示，CA 组PINK1、parkin和MFN2蛋白表达量明显高于DM组(P<0.05)，p62蛋白相对表达量明显低于DM组(P<0.05)。HE和扫描电镜染色显示CA组足突损失、足突融合等病变均较DM组有所减轻。
3. 转染CA-FoxO1可有效提高CIMPs 中FoxO1表达水平：与①组相比，②组FoxO1mRNA水平无明显改变(P>0.05)，同②组相比，③组FoxO1mRNA相对表达量有所增加(P<0.05)。同样，⑥组同①组相比，FoxO1mRNA水平明显下降
III
摘要
(P<0.05)，说明转染sh-FoxO1可以显著降低FoxO1整体表达水平。
4. 染色质免疫共沉淀结果显示，在正常糖培养的CIMPs中，FoxO1可以同PINK1的启动子区域结合，高糖环境可以显著抑制这一行为（P<0.05）。
5. 与①组相比，高糖明显降低足细胞中PINK1、Parkin、MFN2的蛋白表达水平（P<0.05），升高p62的蛋白表达（P<0.05）；③组同①相比，转染CA-FoxO1可显著抑制高糖对上述指标的影响（P<0.05）；在④组中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻断（P<0.05）。
6. 与①组相比，高糖处理和转染FoxO1-shRNA均可明显减少足细胞核内FoxO1荧光强度（P<0.05）；③组同①相比，转染CA-FoxO1可显著抑制高糖的影响（P<0.05）；在④组中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻断（P<0.05）。
7．与①组相比，高糖可以明显降低足细胞内的线粒体膜电位（P<0.05）；③组同①相比，转染CA-FoxO1可显著提高线粒体膜电位（P<0.05）；在④组中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻断（P<0.05）。
8. .与①组相比，高糖明显升高足细胞中ROS水平（P<0.05）；③组同①相比，转染CA-FoxO1可显著抑制高糖的影响（P<0.05）；在④组中，CA-FoxO1的作用被PINK1shRNA阻断（P<0.05）。
9．透射电镜结果显示，与①组相比，高糖环境中的足细胞线粒体水肿、嵴断裂增加，粗面内质网脱颗粒现象严重。上调FoxO1后上述现象有所减轻，在此基础上下调PINK1后，不能观察到明显的损伤改善。
10．激光共聚焦显微镜所拍摄照片显示，与①组相比，高糖环境下培养的足细胞红绿融合斑点数量减少（P<0.05）。转染CA-FoxO1之后，融合斑点数量有所上升（P<0.05），PINK1 shRNA的转染可以阻断这一作用（P<0.05）。
IV
摘要
结论
1．肾皮质点注射CA-FoxO1病毒可以减缓糖尿病小鼠DN进展，激活PINK1/parkin途径。
2．过表达FoxO1可以明显提高高糖状态下CIMPs线粒体自噬水平，降低高糖诱导的线粒体损伤，其机制可能是通过特异性结合PINK1基因启动子区域实现的。
关键词：FoxO1；足细胞；自噬；氧化应激；PINK1
V
Abstract
The Effect and Molecular Mechanism of Forkhead
Transcription Factor O1 on High Glucose-Induced
Mitophagy of Mouse Podocyte Cells
Postgraduate：Li Wen
Supervisor：Qin Guijun
Department of Endocrinology and Metabolism
The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Zhengzhou, Henan, 450052
Abstract
Background
Diabetic nephropathy(DN) is one of microvascular complication with largest harm to survival rate. It is also the chief and independent pathogen which caused final stage kidney disease. Podocyte injury is regarded as the key to cause DN proteinuria and glomerular sclerosis in DN morbidity. Proteinuria is mainly caused by damage of glomerular filtration barrier, which increases increasing of protein permeability and decreasing of permselective function. Podocyte cell is well differentiated cell which attached to GBM. It stretches a lot of neuritis from soma, and form first grade and secondary foot process. The diameter between adjacent foot processes is about 30-40nm. The clearance is filled by infiltrative slit diaphragm. As the last layer construction of glomerular filtration barrier, the integrity of podocyte cell and slit diaphragm has important function to maintain glomerular filtration function. Forkhead transcription factor O1 is one of Forkhead transcription factor O subfamily. Its function involves multiple physiological pathological processes like anti-oxidative stress, cell cycle stationary, apoptosis, proliferation, inflammatory response, glucolipid metabolism, and autophagy, and it has close relationship with the
IV
Abstract
appearing and developing of diabetic nephropathy. It is found by research that, in DN mouse model renal cortex induced by STZ, the activity level of FoxO1 decreases. Mitochondrion is the major place where eukaryocyte does metabolic activity, the major position which generates ROS, and plays key function in cell oxidative damage. Under normal physiological status, cells constantly clear away damaged or aging mitochondria through mitochondria autophagy to keep stable cell internal environment. PTEN induced putative kinase 1(PINK1) is a kind of survival factor induced under oxidative stress status of cells. It is one of important functional proteins which attend mitochondria autophagy. Under high glucose cultivation, the expression quantity of podocyte cells decreases. It is showed by research that, PINK1 is a downstream gene of FoxO1 in cardiomyocyte. A hypothesis is put forward: FoxO1 might adjust mitochondria autophagy through activation of PINK1, decrease excessive releasing of ROS, and improve diabetic podocyte cell damage.
Objective
To study the roles and mechanisms of FoxO1 on mitophagy and mitochondrial dysfunction in mouse podocyte cells under high glucose condition and in glomeruli of DN mice.
Methods
Constitutively active FoxO1 lentiviral vectors (LV-CAFoxO1), FoxO1 short hairpin RNA(LV-shFoxO1), PINK1 short hairpin RNA(LV-shPINK1) or empty lentiviral vectors (LV-NC) were constructed.
27 mice were randomly selected for diabetes models from 36 SPF male KM mice,the other 9 mice as normal control group (NG group). Diabetic mice were randomly divided into three groups: diabetic group (DM group), diabetes with LV-CA-FoxO1 group (CA group), diabetes with LV-NC group (NC group). CA-FoxO1 or empty lentiviral vectors (LV-NC) (10μl )was intravitreally injected in right kidney glomeruli of diabetic mice before they are were anesthetized using a dissecting microscope. The mice were anesthetized with chloral hydrate at the end of
V
Abstract
twelve weeks, and the kidneys were immediately removed and fixed in 4% paraformaldehyde for HE staining, and in 4% pre-cooling glutaraldehyde for electron microscopic examination. The glomeruli were preserved in liquid nitrogen rapidly for detecting the mRNA level of FoxO1 by qRT-PCR and relative protein expression of FoxO1、p-FoxO1、PINK1、parkin、MFN2、p62 by Western blotting analysis.
Conditionally immortalized mouse podocyte cell line (CIMPs) were transfected with constitutively active FoxO1 lentiviral vectors (LV-CAFoxO1), FoxO1 short hairpin RNA(LV-shFoxO1), PINK1 short hairpin RNA(LV-shPINK1) or empty lentiviral vectors (LV-NC) when cultured in normal glucose (5.6mmol/L) medium. CIMPs were then divided into 6 groups: normal CIMPs cultured in normal glucose （5.6mmol/L）medium or high glucose ( 25mmol/L ) medium were served as normal control group ( group NG, ①) or high glucose group (group HG, ②), while the CIMPs transfected with LV-CA-FoxO1 or LV-NC and treated in high glucose medium( 25mmol/L ) were served as group LV-CA(③) or group LV-NC(⑤), the CIMPs transfected with both LV-CA-FoxO1 and LV-shPINK1 and treated in high glucose medium( 25mmol/L ) was served as group ④, and the CIMPs transfected with LV-shFoxO1 and treated in normal glucose medium( 5.6mmol/L ) were served as group ⑥. After cultured in corresponding conditions for 72h, the mRNA level of FoxO1 of CIMPs in each group were measured by real-time quantitative PCR. The expression levels of protein were assessed by Western blotting, including PINK1, parkin, MFN2, and p62. The expressions and distributions of FoxO1 were detected by immunofluorescence. The bonding of FoxO1 to the promoter sequence of PINK1was detected by chromatin immunoprecipitation. The mitochondrial ultrastructure is observed by transmission electron microscope. The level of mitophagy was detected by the combination of both adenovirus vector GFP-LC3 and Mito-Tracker Red. The intracellular production of ROS was measured using DCFH-DA. The mitochondrial membrane potential were quantified using the JC-1 Assay Kit
Results
1. The expression of FoxO1 were increased in the kidney glomeruli of diabetic
VI
Abstract
mice with transfection of CA-FoxO1. In group CA, the protein levels of FoxO1 and p-FoxO1 were both increased (all P<0.05), but the ratio of p-FoxO1/FoxO1 was decreased.
2. Up-regulation bioactivity of FoxO1 slowed down progression of DN in mice. Western blotting showed an increase of protein expression of PINK1, parkin and MFN2 in group CA compared with group DM(P<0.05) while p62 level showed a decrease(P<0.05). HE staining and scanning electron microscope showed that the structures of glomeruli were clear in group NC, whereas foot process fusion increased in group DM.
3. LV-CA-FoxO1 transfection promoted the expression of FoxO1 in CIMPs. In group LV-CA, the protein levels of FoxO1 mRNA was increased (P<0.05), while group NG+shFoxO1 showed a decrease in mRNA level of FoxO1 (P>0.05).
4. The results of chromatin immunoprecipitation showed FoxO1 is capable of bonding to the promoter sequence of PINK1, and this could be inhibited by high glucose (all P<0.05).
5. Overexpression of FoxO1 led to the increase of mitophagy related protein
Compared with group NG, the expression levels of PINK1, parkin and MFN2 were significantly decreased(all P<0.05), the expression levels of p62 was significantly increased(P<0.05), while these indexes in group LV-CA were increased (all P<0.05). And LV-shPINK1 could reverse those changes(all P<0.05). Variation tendency of PINK1 mRNA kept the same with protein(all P<0.05).
6. The results of immunofluorescence suggested that the staining of extranuclear FoxO1 was increasd in HG group compared with NG (all P<0.05). LV-CA could inhibited this effect of high glucose(all P<0.05), but shPINK1 would block it up(all P<0.05).
7. The results of DCFH-DA suggested that the content of ROS was increasd in HG group compared with NG (all P<0.05). LV-CA could inhibited this effect of high glucose(all P<0.05), but shPINK1 would block it up(all P<0.05).
8. The colocalization of adenovirus vector GFP-LC3 and Mito-Tracker Red suggested that the number of bicolor-labeled dots was increasd in HG group compared with NG (all P<0.05). LV-CA could inhibited this effect of high glucose(all
VII
Abstract
P<0.05), but shPINK1 would block it up(all P<0.05).
9. The images of transmission electron microscope showed a series of mitochondrial injury in HG group compared with NG. LV-CA could inhibited this effect of high glucose, but shPINK1 would block it up.
10. The images of JC-1 showed a decrease in mitochondrial membrane potential in HG group compared with NG (all P<0.05). LV-CA could inhibited this effect of high glucose(all P<0.05), but shPINK1 would block it up(all P<0.05).
Conclusions
1. Injection of CA-FoxO1 in DN mice deferred disease progress, and activated PINK1/parkin pathway.
2.Overexpression of constitutively active FoxO1 can obviously improve the level of CIMPs mitophagy, thus alleviating mitochondrial dysfunction, possibly through the mechanisms of bounding to the promoter of PINK1 in CIMPs.
Key words: FoxO1, Podocyte, Autophagy, Oxidative stress, PINK1
VIII
目录
目录
正文部分
中英文缩略词 ........................................................................................................ I
叉头状转录因子O1对高糖诱导下小鼠足细胞线粒体自噬的影响及机制研究 (1)
前言 (1)
1 材料与方法 (4)
2 结果 (20)
3 讨论 (24)
4 结论 (28)
附图 (29)
参考文献 (40)
综述部分
叉头状转录因子FoxO和糖尿病肾病的关系 (43)
参考文献 (54)
附录部分
个人简历 (61)
在学期间发表的学术论文与研究成果 (62)
致谢 (63)
中英文缩略词
I 中英文缩略词
英文简写
AGEs
BSA
CA
cDNA
CIMPs
DEPC
DM
DMSO
DN
EDTA
FBS
FoxO1
GBM
GFP
h
HG
M
MAPK
MDA
min
MOI
mRNA
NG
OD
PAGE
PBS
英文全称 Advanced glycosylation end products Bovine serum albumin Constitutively active Complementary deoxyribonucleic acid Conditionally immortalized mouse podocyte cell line diabetes mellitus dimethylsulfoxide diabetic nephropathy Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Fetal Bovine Serum forkhead transcription factor O1 FoxO-recognized element Glomerular basement membrane Green fluorescent protein Hour high glucose group mol/L mitogen-activated protein kinase malondialdehyde Minute Multiplicity of infection Message ribonucleic acid normal control group optical density Polyacrylamide Gel Electrophoresis Phosphate buffer solution 中文全称 糖基化终末产物 牛血清白蛋白 组成性激活突变 互补脱氧核苷氨酸 条件永生性小鼠足细胞系
焦碳酸二乙酯 糖尿病 二甲基亚砜 糖尿病肾病 乙二胺四乙酸 胎牛血清 叉头状转录因子O1 肾小球基底膜 绿色荧光蛋白 小时 高糖组 摩尔/每升 p38丝裂原活化蛋白激酶 丙二醛 分钟 感染复数 信使核糖核酸 正常对照组 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液
中英文缩略词
II
PDGF
PI3K
PIP3
PINK1
PKC
PTEN
PVDF
qRT-PCR
ROS
Ser
SDS
Sirt1
STZ
Thr
TEMED
Platelet-derived growth factor Phosphatidyl Inositol 3-kinase phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate PTEN-induced kinase 1 protein kinase C phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten Polyvinylidene Fluoride quantitative real-time polymerase chain reaction Reactive oxygen species Serine Sodium Dodecyl Sulfate Nicotinamide adenine dinucleotide – dependent deacetylase sirtuin 1 Streptozotocin Threonine tetramethylethylenediamine 血小板源生长因子 磷脂酰肌醇-3-羟激酶 磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸 PTEN 诱导激酶1 蛋白激酶C 染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物 聚偏二氟乙烯 逆转录聚合酶链反应 活性氧自由基 丝氨酸 十二烷基磺酸钠 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶1 链脲佐菌素 苏氨酸 四甲基乙二胺
前言
叉头状转录因子O1对高糖诱导下小鼠足细胞线粒体自噬
的影响及机制研究
研究生：李雯
导师：秦贵军教授
郑州大学第一附属医院内分泌科
郑州450052
前言
随着糖尿病患病率的快速增长，糖尿病已经成为危害全球人类健康的一个重要因素。糖尿病的流行和近年来人群代谢综合征和肥胖的患者日益增多密切相关[1]。根据国际糖尿病学会的预测，世界范围内的糖尿病患者数量将从2013年的3.82亿增长到2035年的5.92亿[2]。糖尿病肾病极大地增加了糖尿病患者的发病率和死亡率，因此，寻找新的可以干预糖尿病肾病发病和进展的治疗靶点，具有重要的临床意义。
线粒体功能紊乱和足细胞足突损伤、脱落是糖尿病肾病病理的特征表现[3]。糖尿病状态可以对肾脏功能造成消极影响，并且增加发生蛋白尿的风险[4]。在肾脏中，足细胞是保证肾小球基底膜功能和结构完整的重要组分。而足细胞内线粒体的正常动态变化，能量代谢和分布又影响着足细胞的正常形态和功能[5]。氧化应激损伤和高糖环境诱导的线粒体形态结构及功能的改变都会导致线粒体动力学的紊乱[6]。目前，调控足细胞线粒体自噬的分子生物学机制还不甚明了。
人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）诱导的激酶1（PTEN induced putative kinase 1, PINK1）最初被认为是一个PTEN诱导的转录产物，并且含有一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域[7]。PINK1基因的突变可以导致一种常染色体隐性疾病，即帕金森综合征（PD）。但是PINK1在细胞死亡程序中的具体功能还不是很清楚。研究发现，PINK1的表达可以对抗十字胞碱的伤害，抑制细胞凋亡[8]。此外，采用短发夹RNA技术抑制PINK1的表达之后，可以降低不同哺乳动物肿瘤细胞系对于多种细胞凋亡信号刺激的敏感性[9]。许多条证据显示，PINK1是一种重要的线粒体蛋白，其功能的损伤与线粒体功能调
1
前言
节紊乱密切相关。首先，PINK1蛋白内含有一段可以特异性识别并与线粒体结合的结构域，帮助其能准确定位并结合在线粒体的特定位置[10]。其次，下调果蝇体内PINK1的表达水平，会导致线粒体结构损伤，妨碍其正常功能，引起产能下降，生命周期缩短等有害影响[11]。第三，由PINK1介导的HtrA2磷酸化可以控制HreA2的蛋白水解活性，提高细胞抵抗线粒体应激的能力[12]。尽管已经有了这些发现，在细胞处于应激状态时，PINK1是通过何种机制被诱导和调节，还有待继续研究。
目前，已经有动物体内实验报道称，叉头状转录因子O家族蛋白（FoxOs）可以与PINK1在调节线粒体氧化应激状态中共同作用。叉头状转录因子O家族主要包括FoxO1，FoxO3，FoxO4和FoxO6，是叉头状转录因子家族中的一个亚家族。以其与DNA结合区域的“翼状叉”结构而得名[13]。FoxO蛋白是调控体内生物作用的重要转录因子，其作用范围包括细胞周期，细胞死亡，分化，代谢，凋亡和氧化应激等[14]。FxoO蛋白也通过上调线粒体超氧化物歧化酶（SOD2）来降解体内多余的活性氧自由基（ROS）[15]。大量关于FoxO蛋白的研究阐述了一个事实，即FxoO蛋白的调节可以使细胞在饱食/未应激的状态和饥饿/应激的状态见自由转换，在能量供应充足时创造有利于细胞增殖的环境，在应激时使细胞周期停滞、修复损伤DNA，诱导抗氧化酶的表达[16]。在多种细胞内，FxoO 蛋白都是一个保护性的因子，通过促进超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的表达，以及其他细胞有利细胞生存的通路的活化，帮助细胞对抗氧化应激的伤害[17]。还有很重要的一点是，FoxO蛋白在对抗氧化应激损伤时，对于其它通路和下游靶基因的调控具有很强的环境特异性和细胞系特异性[18]。在细胞处于饥饿或者氧化应激状态时，FoxO蛋白可以被上调的AMPK蛋白水平活化，也可以被AKT 磷酸化而失去活性[19]。具体来说，在高糖环境中，FxoO蛋白在肾小球足细胞损伤机制中发挥怎样的作用，还有待于实验的探究。
本研究旨在观察高糖环境中，调节小鼠足细胞内叉头状转录因子O1表达对线粒体自噬和足细胞损伤产生的影响，并且探究其是否是通过激活下游PINK/Parkin通路发挥作用。
2
材料与方法
4
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞
细胞：条件永生性小鼠足细胞系CIMPs 由美国Mundel 教授惠赠，由郑州大学第一附属医院肾内科刘章锁教授转赠。
1.1.2 实验动物
4周龄SPF 级健康雄性KM 小鼠36只，体重为（28±3）g ，由河南省实验动物中心提供。
1.1.3 主要药品和试剂
组成性激活突变型FoxO1慢病毒载体
北京唯尚立德生物技术有限公司 FoxO1短发夹RNA 慢病毒载体
北京唯尚立德生物技术有限公司 PINK1短发夹RNA 慢病毒载体
北京唯尚立德生物技术有限公司 阴性对照慢病毒载体
北京唯尚立德生物技术有限公司 胎牛血清FBS
无菌1×PBS
以色列BI 公司 美国Thermo Scientific 公司 胰酶（含EDTA ）
链脲佐菌素
北京索莱宝生物科技有限公司 瑞士罗氏公司 无糖RPMI1640培养基
美国Gbico 公司 Red-Mito Tracker 线粒体荧光探针
上海碧云天生物技术有限公司 哺乳动物蛋白抽提试剂盒
北京康为世纪生物科技有限公司 分离胶、浓缩胶缓冲液
北京康为世纪生物科技有限公司 PCR 引物
上海生工生物工程技术服务有限公司 GFP-LC3腺病毒载体
汉恒生物科技（上海）有限公司 超纯RNA 提取试剂盒
北京康为世纪生物科技有限公司 SYBR Green Realtime PCR Master Mix
日本TOYOBO 公司
材料与方法
JC-1线粒体膜电位检测试剂盒上海碧云天生物技术有限公司兔抗鼠FoxO1单克隆抗体美国Abcam公司ReverTra Ace qPCR RT Kit日本TOYOBO公司Cy3标记驴抗兔荧光二抗上海生工生物工程技术服务有限公司PVDF膜（0.45μm）美国Millipore公司重组小鼠γ干扰素美国PeproTech公司4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 瑞士罗氏公司兔抗鼠p-FoxO1(Ser256)多克隆抗体美国Cell Signaling Technology公司兔抗鼠MFN2多克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司兔抗鼠P62多克隆抗体加拿大Biobasic Inc公司兔抗鼠parkin多克隆抗体美国Santa Cruz公司兔抗鼠PINK1多克隆抗体美国Santa Cruz公司兔抗鼠β-actin多克隆抗体加拿大Biobasic Inc公司HRP标记山羊抗兔二抗美国Earthox公司ECL Western Blotting Substrate 美国Advansta公司ATP检测试剂盒上海碧云天生物技术有限公司EZ-ChIP kit美国Millipore公司2.5%戊二醛固定液上海碧云天生物技术有限公司
1.1.4 主要仪器和设备
生物安全柜美国Thermo Scientific公司倒置荧光显微镜IX71 日本OLYMPUS公司流式细胞仪美国BD公司SIM-F124雪花制冰机日本SANYO公司漩涡振荡器美国Thermo Scientific公司微量移液器美国Thermo Scientific公司台式低温离心机德国Eppendorf公司低温高速离心机德国Eppendorf公司超净工作台美国Thermo Scientific公司细胞培养箱美国Thermo Scientific公司电热恒温水槽上海精宏仪器设备有限公司
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１０生物学通报２００５年第４０卷第１１期 ２００３年即Ｗａｔｓｏｎ和Ｃｒｉｃｋ发表ＤＮＡ双螺旋结构５０周年，宣布了人类基因组计划的完成，与此同时，其他许多生物的基因组计划已完成或在进行中，在此过程中产生的大量数据库对科学研究的深远影响是以前任何人未曾预料到的。然而遗憾的是，许多生物学家、化学家和物理学家对这些数据库的使用甚至去何处寻找这些数据库都只有一个比较模糊的概念。 基因转录是遗传信息传递过程中第一个具有高度选择性的环节，近２０年来对基因转录调节的研究一直是基因分子生物学的研究中心和热点，因此亦产生了大量很有价值的数据库资源，对这些数据库的了解将为进一步研究带来极大便利，本文对其中一些数据库进行简要介绍。 １ＤＢＴＳＳ ＤＢＴＳＳ（ＤａｔａＢａｓｅｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＳｔａｒｔＳｉｔｅｓ）由东京大学人类基因组中心维护，网址：ｈｔｔｐ：／／ｄｂｔｓｓ．ｈｇｃ．ｊｐ。最初该数据库收集用实验方法得到的人类基因的ＴＳＳ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＳｔａｒｔＳｉｔｅｓ，转录起始位点）数据。对转录起始位点（ＴＳＳ）的确切了解具有非常重要的意义，可更准确的预测翻译起始位点；可用于搜索决定ＴＳＳ的核苷酸序列，而且可更精确地分析上游调控区域（启动子）。自２００２年发布第一版以来已作了多次更新。目前包含的克隆数为１９０９６４个，含盖了１１２３４个基因，在ＳＮＰ数据库中显示了人类基因中的ＳＮＰ位点，而且现在含包含了鼠等其他生物的相关数据。ＤＢＴＳＳ最新的版本为３．０。 在该最新的版本中，还新增了人和鼠可能同源的启动子，目前可以显示３３２４个基因的启动子，通过本地的比对软件ＬＡＬＩＧＮ可以图的形式显示相似的序列元件。另一个新的功能是可进行与已知转录因子结合位点相似的部位的定位，这些存贮在ＴＲＡＮＳＦＡＣ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）数据库中，免费用于研究，但ＴＲＡＮＳＦＡＣ专业版是商业版本。 ＤＢＴＳＳ对匿名登录的用户是免费的，该网站要求用户在使用前注册，用户注册后即可使用。主页分为２个区域，一个介绍网站的部分信息和用户注册，另一区域为用户操作区，该区约分为１０个部分，可分别进行物种和数据库的选择、ＢＬＡＳＴ、ＳＮＰ以及ＴＦ（转录因子）结合部位搜索等部分。后者的使用可以见网页中的Ｈｅｌｐ部分，里面有比较详细的介绍。ＤＢＴＳＳ还提供了丰富的与其他相关网站的链接，如上文提到的ＴＲＡＮＳＦＡＣ数据库、真核生物启动子数据库（Ｅｕｋａｒｙｏｔ－ｉｃＰｒｏｍｏｔｅｒＤａｔａｂａｓｅ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ－ｓｉｂ．ｃｈ／）以及人类和其他生物ｃＤＮＡ全长数据库等。 ２ＪＡＳＰＡＲ ＪＡＳＰＡＲ是有注释的、高质量的多细胞真核生物转录因子结合部位的开放数据库。网址ｈｔｔｐ：／／ｊａｓｐａｒ．ｃｇｂ．ｋｉ．ｓｅ。所有序列均来源于通过实验方法证实能结合转录因子，而且通过严格的筛选，通过筛选后的序列再通过模体（ｍｏｔｉｆ）识别软件ＡＮＮ－Ｓｐｅｃ进行联配。ＡＮＮ－Ｓｐｅｃ利用人工神经网络和吉布斯（Ｇｉｂｂｓ）取样算法寻找特征序列模式。联配后的序列再利用生物学知识进行注释。 目前该数据库收录了１１１个序列模式（ｐｒｏｆｉｌｅｓ），目前仅限于多细胞真核生物。通过主页界面，用户可进行下列操作：１）浏览转录因子（ＴＦ）结合的序列模式；２）通过标识符（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）和注解（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）搜索序列模式；３）将用户提交的序列模式与数据库中的进行比较；４）利用选定的转录因子搜索特定的核苷酸序列，用户可到ＣｏｎＳｉｔｅ服务器（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｌｏｆｏｏｔ．ｏｒｇ／ｃｏｎｓｉｔｅ）进行更复杂的查询。ＪＡＳＰＡＲ数据库所有内容可到主页下载。 与相似领域数据库相比，ＪＡＳＰＡＲ具有很明显优势：１）它是一个非冗余可靠的转录因子结合部位序列模式；２）数据的获取不受限制；３）功能强大且有相关的软件工具使用。ＪＡＳＰＡＲ与ＴＲＡＮＳＦＡＣ（一流的ＴＦ数据库）有较明显的差异，后者收录的数据更广泛，但包含不少冗余信息且序列模式的质量参差不齐，是商业数据库，只有一部分是可以免费使用。用户在使用过程中会发现二者的差异，这主要是由于二者对数据的收集是相互独立的。另外该数据库还提供了相关的链接：如ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ检测转录因子结合部位，网址ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｍａｔｉｎｓｐｅｃｔｏｒ／；ＴＥＳＳ转录元件搜索系统，网址ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｌ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｔｅｓｓ／。 转录调节位点和转录因子数据库介绍! 张光亚!!方柏山 （华侨大学生物工程与技术系福建泉州３６２０２１） 摘要转录水平的调控是基因表达最重要的调控水平之一，对转录调节位点和转录因子的研究具有重要意义。介绍了ＤＢＴＳＳ、ＪＡＳＰＡＲ、ＰＲＯＤＯＲＩＣ和ＴＲＲＤ等相关数据库及其特征、内容和使用。 关键词转录调节位点转录因子数据库生物信息学 !基金项目：国务院侨办科研基金资助项目（０５ＱＺＲ０６） !!通讯作者
万方数据
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线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)
ChIP-Seq技术在转录因子结合位点分析的应用 摘要：染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitaion, ChIP)技术是用来研究细胞 内特定基因组区域特定位点与结合蛋白相互作用的技术。将ChIP与第二代高通量测序技术相结合的染色质免疫沉淀测序(chromatin immunoprecipitation followed by sequencing，ChIP-Seq)技术能在短时间内获得大量研究数据，高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等相互作用的DNA区段，在细胞的基因表达调控网络研究中发挥重要作用。本文 简要介绍了ChIP-Seq技术的基本原理、实验设计和后续数据分析，以及ChIP-Seq技术在 研究转录因子结合位点中的。 关键词：ChIP-Seq；转录因子； 引言 染色质是真核生物基因组DNA主要存在形式，为了阐明真核生物基因表达调控机制，对于蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用的研究是基本途径。转录因子是参与基因表达调控的一类重要的细胞核蛋白质，基因的转录调控是生物基因表达调控层次中最关键的一层，转录因子通过特异性结合调控区域的DNA序列来调控基因转录过程。转录因子由基础转录因子和调控性转录因子两类组成，其中基础转录因子在转录起始位点附近的启动子区，与RNA聚合酶相互作用实现基因的转录；而调控性转录因子一般与位置多样的增强子序列结合，再通过形成增强体在组织发育、细胞分化等基因表达水平调控中发挥极其重要的作用[1]。 ChIP-Seq是近年来新兴的将ChIP与新一代测序技术相结合，在全基因s组范围内分析转录因子结合位点(transcription factor binding sites，TFBS)、组蛋白修饰(histone modification)、核小体定位(nucleosome positioning)和DNA 甲基化(DNA methylation)的高通量方法[2-4]。其中ChIP是全基因组范围内识别DNA与蛋白质体内相互作用的标准方法[5]，最初用于组蛋白修饰研究[6]，后来用于转录因子[7]。同时，新一代测序技术的迅猛发展也将基因组学水平的研究带入了一个新的阶段，使得许多基于全基因组的研究成为可能。相对于传统的基于芯片的ChIP-chip (chromatin immunoprecipitation combined with DNA tiling arrays)，ChIP-seq 提供了一种高分辨率、低噪音、高覆盖率的研究蛋白质-DNA 相互作用的手段[8]，可以应用到任何基因组序列已知的物种，可以研究任何一种DNA 相关蛋白与其靶定DNA 之间的相互作用，并能确切得到每一个片段的序列信息．随着测序成本的降低，ChIP-seq 逐步成为研究基因调控和表观遗传机制的一种常用手段。此外，为了达到更好的检测效果和更为完整的信息，近年来，将ChIP-Seq和ChIP-chip两者融合的研究具有很好的应用前景[9,10]。 转录因子在器官发生过程中起至关重要的作用，在全基因组水平将转录因子定位于靶基因DNA是认识转录调控网络的有效方法之一，了解基因转录调控的关键是识别蛋白质与DNA的相互作用。ChIP-Seq技术能够揭示转录因子的结合位点和确定直接的靶基因序列，可在体内分析特定启动子的分子调控机制，因此被广泛应用于转录调控机制的研究。本文主要就这一技术在转录因子结合位点研究中的基本原理、实验设计和数据分析等技术层面、以及实际应用层面进行讨论。 1 ChIP-seq基本原理及实验设计 1.1 ChIP技术 蛋白质与DNA相互识别是基因转录调控的关键，也是启动基因转录的前提。ChIP是在全基因组范围内检测DNA与蛋白质体内相互作用的标准方法[11］，该技术由Orlando等[12］于1997年创立，最初用于组蛋白修饰的研究，后来广泛应用到转录因子作用位点的研究中[13］。ChIP的基本原理为：活细胞采用甲醛交联后裂解，染色体分离成为一定大小的片段，然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行
第七章细胞的能量转换—线粒体和叶绿体 教学目的：掌握线粒体、叶绿体的超微结构及功能 教学重点：1线粒体、叶绿体的超微结构 2化学渗透学说 3线粒体、叶绿体的半自主性 教学难点：线粒体、叶绿体的超微结构及功能的关系 讲授与讨论 第一节线粒体与氧化磷酸化 一、线粒体形态、大小、数目和分布 二、线粒体的超微结构 本世纪50年代后，在电镜下观察研究线粒体的结构问题。是由双层单位膜套叠成的所谓“囊中之囊”，在空间结构上人为地划分为四大部分，即外膜、内膜、外室、内室。 （一）外膜（outer membrane） 指包围在线粒体最外面的一层膜，看上去平整光滑而具有弹性，膜厚约
6nm。对各种小分子物质（分子量在10000 doldon以内，如电解质、水、蔗糖等）的通透性较高，有人认为外膜上具有小孔（ф2~3nm）。（二）内膜（inner membrane） 也是一单位膜，约厚6~8nm。内膜不同于外膜。首先是在结构上，内膜不是平滑的，而是由许多向线粒体腔内的突起（褶叠或小管），被称为“线粒体嵴”（mitochondria cristae），是线粒体最富有标志性的结构，它的存在大大扩大了内膜的表面积，增加了内膜的代谢效率。（三）外室（outer space）（膜间隙） 指内、外膜之间的窄小空隙，宽约6~8 nm，又称膜间隙（intermembrane space）。 （四）内室（mner space） 指由内膜包围的空间，其内充满蛋白质性质的物质，称线粒体基质（mitochondria matrix）。 三、线粒体的化学组成及定位（chemical composition） （一）蛋白质外膜含量（60%）低于内膜含量（80%），主要为酶类（约120余种）。 外膜：单胺氧化酶（标记酶）、NADH—细胞色素C还原酶、脂肪酸辅
转录因子 ? 1 简介 ? 2 方法 ? 3 转录因子 转录因子-简介 基因转录有正调控和负调控之分。如细菌基因的负调控机制是当一种阻遏蛋白(repressor protein)结合在受调控的基因上时，基因不表达；而从靶基因上去除阻遏蛋白后，RNA聚合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达，这是正调控。这种阻遏蛋白是反式作用因子。 转录因子(transcription factor)是起正调控作用的反式作用因子。转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子。真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态，RNA聚合酶自身无法启动基因转录，只有当转录因子(蛋白质)结合在其识别的DNA序列上后，基因才开始表达。 转录因子的结合位点（transcription factor binding site，TFBS）是转录因子调节基因表达时，与mRNA结合的区域。按照常识，转录因子（transcription factor，TF）的结合位点一般应该分布在基因的前端，但是，新的研究发现，人21和22号染色体上，只有22％的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5'端。 转录因子-方法 这篇文章的试验方法是，通过高密度的寡核苷酸芯片，反映出人21和22号染色体的几乎所有的非重复序列，通过这种芯片，检测三种转录因子，Sp1、 cMyc、和p53的结合位点。结果表明，每种转录因子都有大量的TFBS与之结合。然而，只有22％的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5'端， 36％的TFBS分布在蛋白编码基因的中部或3'端，并且这36％的TFBS常常和基因组中的非蛋白编码RNA分布在一起。这暗示，在人的基因组中，不仅包含蛋白编码基因，也包含数量相当的非编码基因（noncoding genes），他们都受常见的转录因子所调控。 真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一种蛋白质是不是转录机构的一部分往往是通过体外系统看它是否是转录起始所必须的。一般可将这些转录所需的蛋白质分为三大类： (1)RNA聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。 (2)某些转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的
转录因子 基因转录有正调控和负调控之分。如细菌基因的负调控机制是当一种阻遏蛋白(repressor protein)结合在受调控的基因上时，基因不表达；而从靶基因上去除阻遏蛋白后，RNA聚合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达，这是正调控。这种阻遏蛋白是反式作用因子。而顺式作用因子则指的是基因上与反式作用因子结合的对基因表达起调控作用的基因序列。 转录因子(transcription factor)是起正调控作用的反式作用因子。转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因子。真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态，RNA聚合酶自身无法启动基因转录，只有当转录因子(蛋白质)结合在其识别的DNA序列上后，基因才开始表达。 转录因子的结合位点（transcription factor binding site，TFBS）是转录因子调节基因表达时，与mRNA结合的区域。按照常识，转录因子（transcription factor，TF）的结合位点一般应该分布在基因的前端，但是，新的研究发现，人21和22号染色体上，只有22％的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5'端。 真核生物在转录时往往需要多种蛋白质因子的协助。一种蛋白质是不是转录机构的一部分往往是通过体外系统看它是否是转录起始所必须的。一般可将这些转录所需的蛋白质分为三大类： (1)RNA聚合酶的亚基，它们是转录必须的，但并不对某一启动子有特异性。 (2)某些转录因子能与RNA聚合酶结合形成起始复合物，但不组成游离聚合酶的成分。这些因子可能是所有启动子起始转录所必须的。但亦可能仅是譬如说转录终止所必须的。但是，在这一类因子中，要严格区分开哪些是R NA聚合酶的亚基，哪些仅是辅助因子，是很困难的。 (3)某些转录因子仅与其靶启动子中的特异顺序结合。如果这些顺序存在于启动子中，则这些顺序因子是一般转录机构的一部分。如果这些顺序仅存在于某些种类的启动子中，则识别这些顺序的因子也只是在这些特异启动子上起始转录必须的。 黑腹果蝇的RNA聚合酶需要至少两个转录因子方能在体外起始转录。其中一个是B因子，它与含TATA盒的部位结合。人的因子TFⅡD亦和类似的部位结合。同样，CTF(CAAT结合因子)则与腺病毒的主要晚期启动子中与CAAT盒同源的部位相结合。结合在上游区的另一个转录因子是USF(亦称MLTF)，则可以识别腺病毒晚期启动子中靠近-55的顺序。转录因子Sp1则能和GC盒相结合。在SC40启动子中有多个GC盒，位于-70到-110之间。它们均能和Sp1相结合。然而含有GC盒的不同的DNA顺序与Sp1的亲和力却各不相同。可见GC盒两侧的顺序对Sp1-GC盒的结合究竟如何能影响转录。有时候需要几个转录因子才能起始转录。例如胞苷激酶的启动子需要S p1与GC盒结合和CTF与CAAT盒结合;腺病毒晚期启动子需要TFⅡD与TATA盒结合和USF与其邻近部位相结合。以上所述的因子是一般转录都需要的，似乎并没有什么调节功能。另一些转录因子则可以调控一组特殊基因的转录。热休克基因就是一个很好的例子。真核生物的热休克基因在转录起始点的上游15bp处有一个共同顺序。H STF因子仅在热休克细胞中有活性。它与包括热休克共同顺序在内的一段DNA相结合，所以这个因子的激活可以引起约包括20个基因的一组基因起始转录。在这里，转录因子和RNA聚合酶Ⅱ之间关系很类似细菌的σ因子与核心酶之间的关系。 转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。植物中的转录因子分为二种，一种是非特异性转录因子，它们非选择性地调控基因的转录表达，如大麦(Hordeum vulgare) 中的HvCBF2 (C-repeat/DRE binding factor 2) (Xue et al., 2003)。还有一种称为特异型转录因子，它们能够选择性调控某种或某些基因的转录表达。典型的转录因子含有DNA结合区(DNA-binding domain)、转录调控区(acti vation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号(nuclear localization signal) 等功能区域。这些功能区域决定转录因子的功能和特性(Liu et al., 1999)。DNA结合区带共性的结构主要有：1）HTH 和HL H 结构：由两段α-螺旋夹一段β-折叠构成，α-螺旋与β-折叠之间通过β-转角或成环连接，即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构。2）锌指结构：多见于TFIII A 和类固醇激素受体中，由一段富含半胱氨酸的多肽链构成。每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子Zn2+ ，其余约12-13 个残基则呈指样突出，刚好能嵌入DNA 双螺旋的大沟中而与之相结合。3）亮氨酸拉链结构：多见于真核生物DNA 结合蛋白的 C 端，与癌基因表达调控有关。由两段α - 螺旋平行排列构成，其α - 螺旋中存在每隔7 个残基规律性排列的亮氨酸残基，亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状，两条肽链呈钳状与DNA 相结合。
第六章细胞的能量转换-线粒体 选择题： 1.糖酵解酶系主要存在于 A.内质网 B.溶酶体 C.线粒体 D.细胞质基质 E.高尔基复合体 2.在线粒体中，三羧酸循环反应进行的场所是 A.内膜 B.膜间腔 C.基质 D.基粒 E.外膜 3.细胞有氧呼吸并进行氧化磷酸化的场所是 A.核糖体 B.线粒体 C.细胞膜 D.粗面内质网 E.高尔基复合体 4.线粒体的嵴来源于 A.外膜 B.膜间腔 C.内膜 D.基质颗粒衍生 E.内膜外膜共同形成 5.细胞质含有DNA并能产生A TP的细胞器是 A.线粒体 B.中心体 C.内质网 D.溶酶体 E.过氧化物酶体 6.在肿瘤细胞中，线粒体 A.数量增多，嵴数减少 B.数量减少，嵴数增多 C.数量和嵴数均减少 D.数量和嵴数均增多 E.数量和嵴数均不变 7.人的mtDNA可编码多少种肽 A.13种 B.18种 C.30种 D.120种 E.60种 8.线粒体核糖体的沉降系数为 A.80S B.60S C.55S D.35S E.25S 9.线粒体最富有标志性结构是 A.双层膜 B.嵴 C.基粒 D.mtDNA E.核糖体 10.关于线粒体的结构和功能，哪种说法不正确 A.完成细胞氧化的全过程 B.是由双层膜包被的封闭的细胞器 C.是含有DNA的细胞器 D.是细胞内形成的ATP的中心 E.不同生物的线粒体的嵴形态不同。 11.下列哪些说法描述线粒体DNA较为确切 A.线状DNA B.环状DNA C.与核DNA密码略有不同线状DNA D.与核DNA密码略有不同的环状DNA E.包括线粒体全部蛋白质遗传信息的DNA 12.在线粒体中，ADP-ATP发生在 A.内膜 B.膜间腔 C.嵴 D.基质 E.基粒 13.正常线粒体的寿命约为一周，残损线粒体的清除主要靠 A.溶酶体的异噬作用 B.溶酶体的自噬作用 C.溶酶体的自溶作用 D.溶酶体的粒溶作用 E.细胞膜的胞吐作用 对应题 A.线粒体外膜上的筒状结构 B.基粒 C.mtDNA D.基质 E.线粒体核糖体 14.三羧酸循环发生在15.线粒体蛋白质的合成场所是 16.小分子物质进入线粒体的通道是17.线粒体内能体现半自主性的结构是 18.线粒体内进行能量转换，合成A TP的关键部位 A.糖酵解酶系 B.酸性水解酶 C.氧化酶 D.三羧酸循环酶系 E.ATP酶
关于组蛋白、甲基化、转录因子、结合位点和CHIP-Seq 1)染色质：真核细胞分裂间期的细胞核内的一种物质，这种物质的基本化学成分为脱氧核 糖核酸核蛋白(核蛋白就是由DNA或RNA与蛋白质形成的复合体)，主要由DNA和组蛋白构成，也含有少量的非组蛋白和RNA。由于它可以被碱性的染料染色，所以称为染色质。在细胞的有丝分裂期，染色质经过螺旋、折叠，包装成了染色体。 2)核小体：核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白(histone)构成，是染色质(染 色体)的基本结构单位。由4种组蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。这时染色质的压缩包装比(packing ratio)为6左右，即DNA 由伸展状态压缩了近6倍。200 bp DNA为平均长度；不同组织、不同类型的细胞，以及同一细胞里染色体的不同区段中，盘绕在组蛋白八聚体核心外面的DNA长度是不同的。如真菌的可以短到只有154 bp，而海胆精子的可以长达260bp，但一般的变动范围在180bp到200bp之间。在这200bp中，146 bp是直接盘绕在组蛋白八聚体核心外面，这些DNA不易被核酸酶消化，其余的DNA是用于连接下一个核小体。连接相邻2个核小体的DNA分子上结合了另一种组蛋白H1。组蛋白H1包含了一组密切相关的蛋白质，其数量相当于核心组蛋白的一半，所以很容易从染色质中抽提出来。所有的H1被除去后也不会影响到核小体的结构，这表明H1是位于蛋白质核心之外的。 3)染色体：在细胞的有丝分裂的分裂期由染色质经螺旋折叠形成，呈线状或棒状。 4) 有丝分裂：真核细胞的染色质凝集成染色体、复制的姐妹染色单体在纺锤丝的牵拉下分 向两极，从而产生两个染色体数和遗传性相同的子细胞核的一种细胞分裂类型。分裂具有周期性。即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期，（这两个阶段所占的时间相差较大，一般分裂间期占细胞周期的90%-95%；分裂期大约占细胞周期的5%-10%。细胞种类不同，一个细胞周期的时间也不相同。）分裂期又分为分裂前期、分裂中期、分裂后期和分裂末期。细胞在分裂之前，必须进行一定的物质准备。细胞增殖包括物质准备和细胞分裂整个过程。有丝分裂是一个连续的过程按先后顺序划分为间期、前期、中期、后期和末期五个时期，在前期和中期之间有时还划分出一个前中期。 5) 分裂间期：主要完成DNA的复制和蛋白质的合成，DNA复制时边解旋编复制。 6) 姐妹染色单体：姐妹染色单体是指染色体在细胞有丝分裂（包括减数分裂）的间期进 行自我复制，形成由一个着丝点连接着的两条完全相同的染色单体。（若着丝点分裂，则就各自成为一条染色体了）。每条姐妹染色单体含1个DNA。 7) 同源染色体：二倍体细胞中染色体以成对的方式存在, 一条来自父本，一条来自母本， 且形态、大小相同，并在减数分裂前期相互配对的染色体。含相似的遗传信息。 8) 组蛋白：一组进化上非常保守的碱性蛋白质，其中碱性氨基酸(Arg，Lys)约占25%，存 在于真核生物染色质，分为5种类型(H1，H2A，H2B，H3，H4)，后4种各2个形成组蛋白八聚体，构成核小体的核心，占核小体质量的一半。组蛋白的基因非常保守。亲缘关系较远的种属中,四种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)氨基酸序列都非常相似。 9) 甲基化(methylation)：从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上催化其甲基转移到其 他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基
线粒体与细胞凋亡 苑金香(潍坊学院生物系山东潍坊261043) 摘要 细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡过程。近年来研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,它可以通过改变膜通透性、释放凋亡活性物质等介导细胞凋亡。 关键词 线粒体 细胞凋亡 线粒体作为真核细胞能量代谢中心已为人熟知,然而近年来的研究发现,线粒体在细胞的另一重要生理活动 细胞凋亡中还扮演着重要角色。细胞凋亡即细胞程序性死亡(programmed cell death),是一种由基因编程调控的细胞主动自杀过程,细胞凋亡在胚胎发育、机体内环境的稳定、细菌和病毒感染细胞的清除过程中起重要作用,许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关,而线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。 1 线粒体膜的通透性改变与细胞凋亡 线粒体起着启动细胞凋亡的重要作用,其主要机制与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transi tion pore,mtPTP)开放有关,mtPTP位于线粒体内膜和外膜的交界处,是一种由多种蛋白组成的复合体。mtPTP参与调节线粒体基质中的Ca2+、pH值电荷等,维持线粒体内环境的稳定性,保持氧化还原通路的畅通。mtPTP平时允许不大于0.15 104的小分子物质通过。当线粒体内Ca2+超载、自由基对线粒体膜造成氧化损伤,或者是能量产生下降时,均可引起mtPTP开放。在细胞凋亡发生早期,线粒体膜mtPTP打开,线粒体内膜电位( m)降低,一方面使得线粒体内的死亡促进因子(deathe-promoting factor,DPF)释放出来,促进凋亡的进行;另一方面,又使得细胞质进入线粒体基质,由此引起膜质子的转运异常,导致线粒体处于高渗状态,线粒体基质扩张,细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡。 2 线粒体释放物与细胞凋亡 研究发现,线粒体内含有许多促死亡因子,包括细胞色素C,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),胱冬酶原及其他线粒体蛋白等。这些因子从线粒体中释放出来以后,以不同的方式参与到细胞凋亡的过程,影响细胞凋亡的进程。 2.1 细胞色素C的释放与细胞凋亡 1996年德克萨斯西南医学院研究中心王晓东研究小组发现细胞色素C参与细胞凋亡的过程。当细胞受凋亡信号刺激后,细胞色素C能迅速从线粒体释放到胞浆中,在细胞色素C含量丰富的细胞中,细胞将进入快速凋亡机制,释放出来的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路,细胞内仍有许多未释放的细胞色素C,它们维持电子传递和有氧呼吸,从而产生足够的ATP,为细胞凋亡提供足够的能量。而在细胞色素C含量较少的细胞中,由于细胞色素C的大量释放,使电子传递链受阻,ATP产量骤减,无法提供足够的能量,因而使细胞走向与凋亡完全不同的坏死过程。 72h,凋亡细胞数从6.65%增加到16.42%;若处理96h 后,凋亡细胞数从4.71%增加到21.94%,这说明染料木黄酮可诱导前裂腺癌细胞的凋亡,通过这种办法可预防前列腺癌的发生。 另外,许多不同种类的化学物质(如亚硝胺类、杂环胺类、多环氮氢化物和糖醛核呋喃等)、外界微生物的侵袭、高温和放射线等化学的、物理的和生物的因素是影响癌细胞的生长和凋亡的外源性调节因素。还有一些常规使用的肿瘤化疗药物(如顺铂、维甲酸、羟基脲等)和 射线都可诱导多种肿瘤细胞凋亡。 4 结论 在正常机体内,细胞增殖和细胞凋亡处于一种动态平衡。故癌的发生和细胞的生与死密切相关。一方面,细胞的过度增殖导致了癌的发生,一些化学预防剂抑制癌发生的一个重要机制就是抑制细胞增殖;另一方面,细胞凋亡过程的失调也是癌发生的另一原因。研究细胞凋亡与癌发生的关系,进而诱导细胞凋亡对癌的预防具有重要的意义。 参考文献 1 Davis JN et al.Nutr Cancer,1998,32:123 131. 2 Li M et al.Cancer Epidemiol Biom Prev,2000,9(6):545 550. 3 方福德等.分子生物学前沿技术.北京医科大学、中国协 和医科大学联合出版社,1998,76 174. 4 贾旭东.细胞增殖和细胞凋亡和癌的发生和预防.国外 医学卫生学分册,2001,28(2):65 68. (B H) 17 2003年第38卷第5期 生 物 学 通 报
按照起始caspase的不同，可将哺乳细胞的凋亡分为三种基本的途径。 一种称为外在途径（extrinsic pathway），由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因 子受体家族（tumour necrosis factor receptor，TNF-R）引发; 另一种称为内在途径（intrinsic pathway）或线粒体途径（mitochondrial pathway），由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始（Nicholson, 1999；Denault和Salvesen，2003）; 第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化，从而导致凋亡。 细胞凋亡的途径 摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 关键词细胞凋亡线粒体内质网caspase家族NO 疾病 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。 1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。
无论从原始的生物线虫到高级的哺乳动物乃至人类，还是从生物体外周器官到中枢神经系统，细胞凋亡都广泛存在。它作为生命的基本现象之一，可以发生在生理或病理条件下[1]。最初人们仅从形态学表现的特征上加以认识，如胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩、DNA破碎、线粒体肿胀和凋亡小体形成。随着科学的发展，人们开始发现线粒体在细胞凋亡中的起着重要的作用。随着对细胞凋亡研究的深入，人们对线粒体与体细胞凋亡的关系有了新的认识。
2.1细胞凋亡的概念 细胞凋亡是细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）是一种细胞自身有基因控制的主动性死亡过程，其形态特征为核染色体固缩、DNA片段化、胞质浓缩、胞膜皱缩并形成凋亡小体，生化上表现为DNA梯形条带。而最新研究表明人类许多疾病都与其相关，如爱滋病、神经变性性疾病、骨髓发育不全综合征、酒精中毒性肝病、缺血性损伤, 尤其宫内窘迫所致胎儿缺血缺氧性脑损伤。神经细胞的凋亡，更是目前关的焦点，凋亡程度与胎儿乃至新生儿的脑发育、智力发育密切相关[2]。而科学家们发现，用溴化乙锭除去线粒体DNA(mtDNA)诱导一株人成纤维细胞凋亡，表明线粒体在细胞凋亡中起作用[3]。现在认为，细胞凋亡有胞核和胞质两条途径，随着对细胞凋亡研究的深入，人们对线粒与体细胞凋亡的关系有了新的认识。 2.2细胞凋亡与细胞坏死区别 细胞凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，同细胞生长分化一样是生命活动中重要的细胞学事件。细胞凋亡与坏死不同，是一种细胞遵循自身程序结束其生命的主动的细胞学过程，对机体清除衰老或受损细胞具有重要意义[4]。细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，凋亡细胞表现为染色质固缩，常聚集于核周边，呈境界分明的颗粒块状或新月形小体；细胞浆浓缩，密度增高；细胞核裂解为碎片，而线粒体形态结构保持完整（凋亡细胞细胞膜和线粒体的动态变化）。坏死是一种由多种刺激所引起的非特异性细胞死亡。如补体作
第六章细胞的能量转换－－线粒体和叶绿体 （本章内容详见生物化学） 一、线粒体的形态结构 （一）线粒体的形态与分布 线粒体是一个动态细胞器，在生活细胞中具有多样性、易变性、运动型和适应性等特点，其形状、大小、数量与分布在不同细胞内变动很大，机制在同一细胞，随着代谢条件的不同也会发生变化。线粒体的形状多种多样，但以线状和粒状最常见。 （二）线粒体的结构与化学组成 线粒体只有外层彼此平行的单位膜套叠而成的封闭的囊状结构。外膜（outer membrane）起界膜作用，内膜（inner membrane）向内折叠形成嵴（cristae）。外膜和内膜将线粒体分割成两个区室：一个是内外膜之间的腔隙，称为膜间隙（intermembrane space）；另一个是内膜所包围的空间，称为基质（matrix）。 1、外膜 线粒体最外面的一层单位魔结构，厚约6nm，光滑而有弹性。外膜中蛋白质和脂质约各占50%。外膜含有孔蛋白（porin），孔蛋白是由β链形成桶状结构，中心是一直径为2~3nm的小孔，即内部通道。 外膜的标志酶是单胺氧化酶（monoamine oxidase）。 2、内膜 内膜是位于外膜的内侧把膜间隙与基质分开的一层单位膜结构，厚6~8nm。相对外膜而言，内膜有很高的蛋白质/脂质比（质量比>3:1）。内膜缺乏胆固醇，富含心磷脂（cardiolipin），约占磷脂含量的20%，心磷脂与离子的不可渗透性有关。 线粒体内膜除含有多种转运系统外，还含有大量的合成ATP的装置。在内膜上有许多排列规则的颗粒，称为线粒体基粒（elementary particle），又称耦联因子1（coupling factor 1），简称F1，实质是ATP合酶（ATP synthesis）的头部。 3、膜间隙 线粒体内、外膜之间的腔隙，宽6~8nm，但在细胞进行活跃呼吸时，膜间隙可扩大。膜间隙中充满无定型液体，含有可溶性的酶、底物和辅助因子。其中腺苷酸激酶是膜间隙的标志酶。 4、线粒体基质 内膜所包围的嵴外空间为线粒体基质。（P130） 二、线粒体的功能 线粒体是物质最终彻底氧化分解的场所，其主要功能是进行三羧酸循环及氧化磷酸化合成ATP，为细胞生命活动提供直接能量。此外，线粒体海域细胞中氧自由基的生成，调节细胞艳华还原电位和信号转导，调控细胞凋亡、基因表达、细胞膜内多种离子的跨膜转运及电解质稳定平衡，包括线粒体对细胞中Ca2+的稳态调节等有关。 （一）线粒体中的氧化代谢 在细胞中，线粒体是氧化还原的中心，是糖类、脂质和蛋白质最终氧化释能的场所。线粒体中的三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle），简称TCA循环，是物质氧化的最终共同途径，氧化磷酸化是生物获得能量的主要途径。 细胞之中糖酵解产生的NADH虽不能透过内膜浸入线粒体氧化，但是NDAH上的电子去能通过两种“穿梭”途径进入线粒体：①苹果酸-天冬氨酸穿梭途径（malate-asparate shuttle）；②甘油-3-磷酸穿梭途径（glycerol-3-phosphate shuttle）。（P132） 当NADH中的1对电子传递到O2时，有10个H+被泵出，二FADH2中的1对电子的传递有6个H+被泵出。（二）电子传递链与电子传递 在线粒体内膜上存在的有关氧化磷酸化的脂蛋白复合物，是由一系列能可逆地接受和释放电子或H+的化学物质组成，它们在内膜上相互关联的有序排列构成呼吸链，称为电子传递链（electron transport chain）或呼吸链（respiratory chain），是典型的多酶体系。 电子通过呼吸链的流动，称为电子传递。 1、电子载体（electron carrier） 参与电子传递链的电子载体有5种：黄素蛋白、细胞色素、泛醌、铁硫蛋白和铜离子。 黄素蛋白（flavoprotein），是由一条多肽与黄素蛋白腺嘌呤单核苷酸（FMN）或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）紧密结合组成的结合蛋白。 细胞色素（cytochrome），是一种带有含铁血红素辅基二队可见光具有特征性强吸收的蛋白。 泛醌（ubiquinone，UQ）或称辅酶Q（coenzyme Q，CoQ），或简称为Q，是一种脂溶性的、带有一条的类异戊
细胞的凋亡 凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis , IAPs)是细胞内一类独特的抗凋亡蛋白家族,包括XIAP，c-IAP1，c-IAP2，神经元凋亡抑制蛋白(NIAP) ,ML-IAP, Apollon和survivin。IAPs通过在体外或体内抑制不同的caspases而抗细胞凋亡。与其他的可抑制上游 caspases的蛋白不同, IAPs是唯一的内源性 caspase 抑制物【1】。 Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白家族中的成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，于1997年由耶鲁大学Alfieri【2】等用效应细胞蛋白酶受体1(effector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人类基因库的杂交中分离出来，Survivin大量表达于胚胎及婴幼儿组织中，在正常的分化组织中几乎检测不到【3】，然而却在60余种肿瘤细胞株和大部分人体肿瘤组织过度表达。 1.Survivin的分子结构 IAP家族蛋白一般在N末端含有 2～3个串联的含有 Cys/ His的保守冠状病毒IAP重复序列结构域(Baculovirus IAP Repeat, BIR)，发挥着极为重要的凋亡抑制作用。IAPs家族发挥抗凋亡作用的机理是通过BIR功能区之间的连接序列直接与Caspases家族蛋白结合，抑制细胞凋亡的发生。多数IAPs的C末端还含有一个环指状结构域(RING-finger domain)能够与两个锌原子形成配位键。这一锌指结构对于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相关。只有包含BIR2功能区的IAPs蛋白分子才具有结合和抑制死亡蛋白酶的功能，单一BIR1， BIR3或环指结构以及它们的任意组合蛋白体均无此效应。 Ambrosini 等【4】测定并绘出了Survivin基因完整的基因图谱，全长14796 bp，位于距离端粒约3%的位置。Survivin 基因与EPR-1 基因的编码区序列高度互补，位于染色体17q25的同一基因族，含有3个内含子和4个外显子，编码产生1个由142个氨基酸组成的胞浆蛋白，分子量约为16. 5kD。Survivin只含有一个BIR区域，C末端有一个α卷曲螺旋结构，不含环指状结构域【5】。 Survivin是唯一具有剪接异构体的IAP基因，一个是序列中缺少外显子3的survivin-ΔEX3；另一个是把部分内含子2作为隐蔽的外显子的survivin-2B。两者序列的改变导致了相应蛋白质结构和功能发生了显著变化，survivin-ΔEX3仍保留抗凋亡特性，survivin-2B抗凋亡功能则显著下降[6]。2004年Badran A等[7]发现survivin的另一新剪接异构体survivin-3B，survivin-3B 含有5个外显子，比survivin多3B外显子， survivin-3B包含单一的BIR，这对于其抗调亡作用致关重要。最近，包含两个外显子，3'为197bp的内含子的survivin-2α发现【8】。其终止密码在第2内含子，编码产生74个氨基酸的蛋白质。survivin的剪接异构体的功能尚不清楚，初步认为survivin-ΔEX3与线粒体依赖性凋亡通路有关，另外，证实survivin-2α能减弱survivin的抗凋亡活性[7]。 Survivin的异构体如图1。