细胞遗传学课程论文
题目：荧光原位杂交技术的发展
及在植物中的应用
姓名：秦冉
学号：11316040
荧光原位杂交技术的发展及在植物中的应用
摘要: 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术。该技术因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。本文简要介绍了荧光原位杂交在染色体制片技术、探针类型及探针标记方法方面的发展，概述了荧光原位杂交技术在基因定位，远缘杂种的鉴定及外源染色质的检测等方面的应用。
关键词：荧光原位杂交技术；染色体制片技术；探针标记方法；基因定位
The development of fluorescence in situ hybridization
and its application in plant
Abstract: Fluorescence in situ hybridization(FISH) is a non radioactive in situ hybridization technique developed in the late 1980s. Because of its characteristics:high sensitivity, strong specificity, accurate positioning, fast, safe and effective, it can be used in many fields.This paper briefly introduces the development of FISH in plant including the chromosomal technique, probe type and labeling method, then summarizes the application of FISH in gene mapping, identification of the distant hybrid and detection of the alien chromatin, etc.
Keywords: fluorescence in situ hybridization; chromosomal technique; probe method; gene mapping
前言
荧光原位杂交技术是20世纪80年代末发展起来的一种非放射性原位杂交技术[1]。其基本原理为：根据核普酸碱基互补配对原则, 使荧光标记的探针序列与靶DNA序列进行杂交, 然后用合适的检测方法将荧光信号检出, 达到基因定位的目的。因其具有灵敏度高、特异性强、定位准确、快速有效、安全直观等特点而被应用于很多领域。自从Rayburn等[2]于1985年首次将原位杂交技术应用于植物染色体研究后，该技术便在植物学研究中得到了广泛的应用。主要是由于以下几方面的原因：①FISH 的灵敏度接近同位素标记探针杂交[3-4]，在安全性，空间分辨率，速度和探针的稳定性等比放射性同位素标记探针杂交更具优越性；②运用不同荧光色素标记的探针可同时检测一个细胞核中2种或更多的核甘酸序列；③DNA 序列能被定位在目标范围从载玻片上分散的中期细胞染色体到悬浮固定保存细胞三维结构的间期核中[5]；④探针标记和荧光试剂从商业上可得，而且使FISH过程直接可靠；⑤荧光显微镜和数字成像系统在过去20 多年中不断改进；⑥特殊种属的全基因组，完整染色体，染色体亚区域或单拷贝序列能在多种探针混合运用情况下出现特异信号；⑦未标记的基因组DNA 通过探针预杂交抑制重复序列，对定位象柯斯质粒这样一类含大插入探针的特定序列是至关重要的。来。FISH技术的程序较复杂，主要流程包括染色体标本的制备，探针的制备、纯化与检测，染色体与探针的变性，原位杂交，杂交后洗脱，杂交信号的检测和放大，荧光显微镜观察、照相。
随着FISH 技术的不断发展，衍生了染色体原位抑制（CISS）技术、间期核FISH、引物原位标记或DNA 合成（PRINS）技术等，并且发展出M-FISH、3D-FISH、Rx-FISH 技术、CGH 以
及近年来微阵列技术（Microarray）等。同时，原位杂交靶目标从中期染色体发展到DNA 纤维，提高了FISH 技术的分辨率，即2 个不同DNA 探针能够被检测到的最小距离，由1 Mb 发展到1 kb，这更进一步拓展了FISH 技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。
近二十年，随着该技术的不断发展，在植物的研究中已得到了广泛的应用，例如植物基因的染色体物理作图[6]，杂种中亲本染色体的鉴定[7]，外源染色体或染色体片段的检测[8]，物种进化及亲缘关系的探讨[9],转基因材料中外源基因的定位[10]。本文主要介绍了荧光原位杂交探针类型、探针标记方法的发展、染色体制片技术的发展等，综述了荧光原位杂交技术在植物分子细胞遗传学方面的应用与展望。
1荧光原位杂交技术FISH的发展
1.1染色体制片技术
染色体是遗传物质的载体，植物染色体制片技术是细晌馈传学中最基本、最常用的方法，在物种亲缘关系鉴定、染色体变异、杂种分析等方面得到广汗应用。
1.1.1 预处理
在制片预处理中中最常用的化学药品处理方法有:0.002 mol/L的8-羟基唆琳在室温处理3~5 h[11];其次是用饱和对二氯苯4℃处理1~2 h[12]。此外还可0.1%~0.2%秋水仙素溶液室温处理2~3 h[13]和放线菌酮溶液室温2.5~3.0 h[14]。物理方法主要是对材料在0~8℃进行低温处理，最常用的是用冰水混合物对材料进行预处理12~36 h。
1.1.2固定
常用卡诺氏固定液I（V无水乙醇醇：V冰酷酸=3:1）置4℃或常温对材料处理2~24 h;也可用95%乙醇代替无水乙醇固定20~24 h
1.1.3 解离
解离常用方法有酸解法和酶解法。酸解法一般是将材料用1 mol/L盐酸在60℃恒温软化细胞壁，依据材料不同，时间从数分钟到十几分钟不等[15-16]，也有学者采用1 mol/L盐酸与45%醋酸（体积比1:1）的混合液在370℃恒温水浴中解离45 min。
酶解法是用消化酶降解细胞壁，常采用纤维素酶（1~5%）和果胶酶（1~2%）混合液。酶解前需先将材料置于0.07s mol/L的KCl溶液中低渗0.5~1.0 h，然后加人酶液在25℃保温2~3h[17]或者37℃保温0.5~1.0 h，用蒸馏水清洗后浸泡5~20 min后进行低渗膨胀细胞，再用新鲜固定液固定30 min[18]。
1.1.4 染色体制片方法
染色体制片方法主要有常规压片法和去壁低渗法。
压片法是植物染色体制片的常规方法，它简单且易操作，许多植物染色体核型分析、显带和原位杂交都是用这种方法完成的。有学者将经预处理的材料在卡诺固定液中固定后直接用45%的醋酸压片获得的染色体中期分裂相制片用于鉴定异源染色体片段的原位杂交，获得了较好的结果[19]。但这些方法成功率较低，主要是因为染色体很难完全散开，容易产生重盛、变形、断裂等，此外细胞质及细胞壁对染色体的覆盖，使原位杂交的信噪比增高。具大染色体的植物材料如普通小麦可用上述方法制片，但具小染色体的植物材料不适用此方法，因为获得的制片很难区分染色体上的各个部位。去壁低渗火焰干燥制片法必须考虑几个重要因素如前低渗处理时间、混和酶液的浓度、酶解时间和酶解温度以及后低渗处理时间等。低渗的目的在于使细胞吸收水分而膨胀，染色体分散到细胞质中，在制片时便于染色体分散开，不同材料低渗的最佳时间不同，未经低渗处理的材料，细胞核膨胀的较小，染色体不易分开，而低渗处理过度，使细胞在低渗液中胀破，造成材料解体；酶解温度必须恒定，酶液浓度应控制在2%~5%，根尖材料为2.5%左右，树木幼叶、幼芽可用5%左右；此外，酶解时间是个变化的因素，要根据材料的不同做适当调整，材料过大，会使酶解时间成倍增加，材料过多，
会导致消化不足，酶液量过多会使酶解时间不易稳定。去壁低渗法又分为：（1）涂片法:将材料放在预先洁净冷冻的载玻片上，加一滴固定液，然后用镊子取根尖分生区组织，迅速将材料敲碎涂抹，并去掉大块组织残渣。然后从载玻片一侧向材料轻轻吹气，使组织分散成一薄层，涂抹的载玻片可自然或加热干燥[20]。（2）悬液法:将材料用镊子夹碎、搅拌使其形成细胞悬液，然后将材料固定20 min，视细胞沉淀后，用吸管轻轻地吸去上清液，留1 mL左右细胞悬液制备染色体标本。用吸管滴2~3滴细胞悬液在洁净载玻片上，将载玻片一端抬起，并轻轻吹气，使细胞迅速分散，然后在酒精灯火焰上微微加热烤干或自然干燥[21]。
1.1.5染色与观察
染色体染色时常选用碱性染料，常用的染色体染色剂有:醋酸洋红、改良石炭酸品红（卡宝品红）、苏木精和吉姆萨等。在植物染色体制片中以改良石炭酸品红染色效果最好，具有染色快、着色深、适应性广的特点，适合于多数植物根尖、幼芽、花药以及细胞愈伤组织染色。染色后即可在显微镜下观察拍摄染色染色体
相片。
1.2 靶DNA 载体及FISH技术的改进
1.2.1中期染色体
在通常的原位杂交技术中，多以中期染色体（Metaphase chromosome）作为靶DNA 的载体，此时期染色体可以通过简单的染色体制片技术获得,但因其高度凝缩, 分辨率只能达到1~3Mb的水平。
1.2.2减数分裂粗线期染色体
由于中期染色体结构高度凝缩的影响，其分辨率只能达到1~3 Mb 的水平。然而这对于构建高分辨率的DNA物理图谱来说，1~3 Mb 的分辨率水平是还不够的，必须寻找分辨率更高的技术。而减数分裂的粗线期染色体（Pachytene chromosome）浓缩程度比中期染色体大为降低，其长度比相应的中期染色体大7~50 倍，粗线期染色体FISH 的分辨率可达100 kb左右，而且Jiming等[22]人证实用玉米粗线期染色体固定于4%福尔马林可以使染色体伸长到原来的很多倍。粗线期染色体还具有可识别的结构特征，包括着丝粒位置、短臂和长臂的比例、异染色质和常染色质的形态等，另外，粗线期染色体所在几乎不存在细胞壁，染色体延展良好，且同源染色体配对提供了2个目标区域增加了一倍，以上这些特点说明了粗线期染色体可适用于原位杂交及物理作图。
1.2.3 间期细胞核FISH
与分裂期的染色体相比，间期细胞核的染色体凝缩程度很低，FISH 的分辨力可提高到50 kb[23]。在人类间期核的FISH 分析中发现，当2个探针的间距在100 kb 至2 Mb 时，间期FISH 作图可用来测定染色体上2个相邻序列间的物理距离，不过，间期核缺乏可辨别的染色体结构，无法分辨单个的染色体，不能确定FISH 信号相于着丝粒、端粒和其它染色体标记的位置；而且在不同的细胞类型和染色体区域，染色质的凝缩模式和程度不同，必须有相应的对照标准。这些不利因素限制了间期核FISH 的应用。
1.2.4 Fiber-FISH
近年来，利用间期核制备高度伸展的DNA 纤维（Extended DNA fiber）作为FISH 的模板，已将分辨率水平提高到与常规分子生物技术Southern Blot分析相当的水平，在1 Mb 的范围内，Fiber-FISH分辨力达到1~2 kb，灵敏度可达到＜700 bp[24]。该技术首先在人类细胞中获得成功[25]。其基本原理是，首先将单细胞悬浮液涂在载片上，然后用碱性变性剂将染色体的结构破坏，让DNA 分子与复合的蛋白质分离而形成游离的DNA 纤维，在这种纤维上进行原位杂交。利用这一项技术，可以开展YAC、BAC、黏粒、噬菌体和质粒DNA 克隆在DNA 纤维上的线性排列顺序并准确地构建出DNA 物理图谱。
1.2.5 超伸展的流式分拣植物染色体FISH
最近Valárik 等[26]发展了一种超伸展的流式分拣植物染色体（Super-stretched flow-sorted plantchromosome）高分辨FISH 技术。流式分拣的大基因组（包括大麦、小麦、黑麦和鹰嘴豆）染色体在玻片上干燥后经温和的蛋白酶K消化和乙醇:冰醋酸（3:1）伸展，可获得比中期染色体长100 倍以上的伸展的染色体纤维。由于这种超伸展的染色体之间不重叠，又保持了染色体的完整性，并有较大范围的伸展程度，可以用于研究染色体的超微结构，因此与Fiber-FISH 技术相比具有一定的优势。此FISH 技术特别适合于难以进行粗线期染色体FISH 研究的大基因组。它的不足是需要用流式细胞仪分拣染色体。
1.3 原位杂交探针
1.3.1原位杂交探针类型
1.3.1.1 染色体特异性重复DNA 序列
在特异染色体类型上重复元件可达106 拷贝数，现已有大量的重复序列，主要包括rDNA 基因、端粒重复序列、着丝粒重复序列等被克隆，这些序列定位于染色体的着丝粒或端粒，当标记和杂交具有足够严谨性时，这些探针在着丝点附近或特异染色体类型的异染色质区和间期染色质的浓缩区域产生强烈和浓缩的杂交区域。主要用于快速检测染色体单体、三倍体、染色体基数及倍性研究。
1.3.1.2 染色体文库探针
从基因组DNA 文库中分离出来的全长染色体探针，用于鉴定染色体的异位或畸变。
1.3.1.3基因组探针
利用某一物种的基因组DNA 作为探针，与另一物种的染色体进行原位杂交，可用于分析异源多倍体基因组组成、起源、演化以及基因组间的亲缘关系。在高等植物基因组中序列重复很常见，编码序列在染色体总DNA 中的比例只有不0.5%，中度和高度重复序列构成了植物基因组的绝大部分DNA 序列。但是并非所有的重复序列都具有物种特异性，表明其具有很低的进化保守性。由于它们在探针和目标DNA 中具有较高频率，重复序列退化比高度保守的单一序列更快。因此当总DNA作探针时，应依据各染色体组DNA 同源性程度的差异进行种属特异性标记。
1.3.1.4 单拷贝或低拷贝基因
单拷贝或低拷贝基因作为探针的应用发展缓慢，原因在于植物细胞壁阻碍探针与靶序列的结合，并且多数低拷贝序列是几个kb 小片段，探针与靶序列相遇的几率很小，杂交位点检测率随探针大小的降低而降低。然而，尽管较低的杂交效率（20%~50%），该方法在植物上已起步，如检测豌豆中的豆球蛋白基因的DNA 序列，用生物素标记的探针检测豌豆中的低拷贝序列（13.5 kbp）等。近几年，使用BAC-FISH 技术使上述2个问题得到了一定程度的解决，大大提高了信号的检出率。它主要用于功能基因的定位和检测靶细胞特定的拷贝数和结构变化。
1.3.2 探针标记方法的发展
1.3.
2.1 放射性原位杂交（Isotopic ISH）
最初，人们普遍采用将含有放射性同位素的核苷酸掺入探针中，杂交后，再通过放射自显影技术显示杂交位置的原位杂交技术分析原核生物的DNA 序列组织。这种标记方法的特点是灵敏度高，杂交信号强，但它不安全、不稳定、背景不理想、周期长，并需要进行大量的统计学工作。
1.3.
2.2非放射性原位杂交（Nonisotopic ISH）
非放射性标记弥补了放射性标记的不足，它的检测方法简单、快捷；在化学性质上稳定，能通过几次免疫化学反应显著地增加杂交信号，从而提高灵敏度，杂交信号定位更准确。根据标记和检测特点的不同可将非放射性原位杂交分为直接法和间接法2种。直接标记法：正如同位素法标记探针一样，这类方法是指掺入到探针中的标记物在杂交后可被直接检测到。这
种标记物大多为在激光下能发荧光的物质，故也叫荧光原位杂交（Fluorescence in situhybridization, FISH）。其常用的标记物有异硫氰酸荧光素（FITC）、氨甲基香豆素醋酸酯（AMCA）和罗丹明衍生物（TRITC）等。这些标记物掺入到探针中后可用荧光显微镜直接观察杂交结果。如用不同颜色的荧光素标记不同的探针可同时定位2 种以上的靶序列。快速、准确、颜色对比鲜明。与间接法相比，操作简单、结果背景干扰较少，但信号不能放大，其灵敏度相对较低[27]，并很快为间接法所替代。间接法是指掺入到探针中的标记物不能被直接观察到，必须通过耦联复合物专一地结合到杂交后的探针标记物上，通过特殊的检测方法，来显示杂交位点。这种方法最常用的标记物是生物素（Biotin）和地高辛（DIG）。
生物素：用于间接标记法的标记物，也是最早使用的非放射性标记物。常用的生物素标记核苷酸有Biotin-16-dUTP、Biotin-11-dUTP、Biotin-14-dATP和Biotin-7-dATp，这些核苷酸通过缺口平移或随机引物等方法掺入到探针中，杂交后通过免疫反应使生物素与荧光素标记的抗生物素蛋白或链酶抗生物素蛋白结合，杂交信号可在荧光显微镜下观察，也可通过二抗使信号进一步放大。
羟基毛地黄苷：商品名叫Digoxigenin, 简称DIG，是20世纪80 年代发展起来的一种新型非放射性标记物。常用标记核苷酸为digoxienin-11-dUTP，DIG 标记系统中的所用标记方法和检测方法同生物素标记系统。生物素和地高辛标记系统都已得到广泛应用，二者相比地高辛标记系统的灵敏度较高，因为在原核和真核生物中普遍存在着内源性生物素的干扰，抗生物素蛋白对内源生物素存在非特异性结合，使标记本底增高。
2 FISH技术在植物上的应用研究
2.1 基因定位上的应用
由于FISH技术可在同一张切片上同时观察几种DNA探针的定位，直接得到它们的相关位置和顺序，因而已广泛应用于生物基因组和功能基因定位研究。目前研究较多的是植物基因组中核糖体基因5SrDNA, 25SrDNA, 45SrDNA等在染色体上的定位。王永等[28]利用FISH技术研究发现羽衣甘蓝2号染色体上存在3个SsrDNA串联重复位点，并且这3个位点都位于2号染色体的长臂靠着丝粒处杨学明等采用顺序基因组原位杂交和双色荧光原位杂交技术，对普通小麦一簇毛麦6V代换系K0736的45srDNA和SsrDNA基因位点进行了分析,结果表明，该代换系y-p，有1对簇毛麦6V染色体，为6V/6A代换系，45srDNA位点有8对，位于7对染色体上SsrDNA位点有6对，分别位于6对染色体上。周树军等[29]利用FISH技术对嚼香百合、柠檬色百合、天香百合及钓纹百合染色体上的45srDNA进行了定位，其结果显示45srDNA 在这四种百合中都分布在染色体的着丝点附近，但其位点数量、所存在的染色体和信号的强度有很大的变化。王岚[30]对诱导的多倍体新麦草进行原位杂交分析发现，新麦草基因组中主要在3对染色体上具有45SrDNA位点，分别位于第Ⅰ、第Ⅲ和第V染色体短臂末端，初步推测是NOR染色体。
2.2 在植物起源进化及亲缘关系研究上的应用
利用荧光原位杂交技术通过对特定DNA序列特别是编码序列在染色体上分布位置的研究，对探讨基因组起源、进化具有重要的理论意义[31]。宋国立[32]采用多种探针对8个二倍体或四倍体的棉种进行FISH研究，通过对比信号出现的位置、数目、强度等，探讨了棉属的起源与演化。
2.3在植物远缘杂种的鉴定及外源染色质检测上的应用
利用远缘杂交手段将有利基因的异源染色质渐渗到栽培植物中形成新的种质，以达到增强栽培种生存及生产能力的目的。运用基因组荧光原位杂交（Genome in situ hybridization, GISH）方法跟踪检测杂种后代外源染色体或片段，是一个快速、灵敏、准确、信息丰富的手段。它能对外源染色体或片段计数，显示它们的大小、位点和形态以及与寄主基因组染色体的重组，同时起到间接鉴定杂交品种真实性的作用。一般以标记的野生种基因组总DNA 为探针，以
栽培种亲本总DNA 为封阻DNA，在杂种及其后代中期染色体进行杂交，通过信号的有无来判断是否有野生种染色质渗入。该技术具有快速、准确、灵敏特点。杨足君等[33]通过利用基因组原位杂交和FISH方法鉴定了多年生簇毛麦优异基因在小麦的导入结果。也有学者成功地鉴定了甘蔗种质创新杂种F1[34]。因此，无需经过基因表达产物来推断基因转移是否，就能检测整合于染色体内的和游离的外源染色质。
2.4 在转基因植物外源基因的检测上的应用
随着现代基因工程技术的发展，转基因植物不断增多，FISH技术不仅能用于检测外源基因是否存在，而且还能将外源基因直接定位在染色体的相应位置并确定其拷贝数，同时也是转基因植株的遗传不稳定性、细胞基因表达和调控机理的重要研究手段之一。Jin等[35]利用荧光原位杂交技术检测并定位了转入水稻中的杀虫蛋白基因，杂交信号分散于距着丝粒26.2~95.2之间。大量的FISH研究表明，外源基因在染色体上的整合不是随机的，而是优先整合到染色体的远端区。FISH技术特别是Fiber-FISH技术还可以显示转基因位点的结构[36]。目前的研究表明，小麦中外源基因可能有3种插入形式，分别为串联重复整合、串联重复拷贝之间夹杂着基因组和单个转基因拷贝。有报道根癌农杆菌转化中外源基因的插入位点数少，一般只有1个，而基因枪转化中可看到1个以上的外源基因插入位点。
2.5 在细胞遗传图的构建上的应用
通过荧光原位杂交（FISH）可直接把DNA序列定位到染色体上，利用FISH构建细胞遗传图的关键在于获得作为探针的含有遗传标记的DNA序列或其同源序列。早期的植物FISH技术主要用于对DNA重复序列和多拷贝基因家族作图。植物单（低）拷贝基因常为一千至数千碱基的小片段DNA,如此小片段DNA探针与染色体上的靶DNA序列相遇的机会很小，故杂交信号的检出率很低。对于单（低）拷贝DNA序先从基因组文库中筛选出含有单（低）拷贝DNA序列的BAC或YAC克隆，然后用筛选出的阳性克隆作为FISH探针。Li等[37]利用FISH 技术建立了玉米的Ht1, Htn1, Ht2, Rhm1, Rhm2,Mdm1等多种抗病基因的细胞遗传图，并对它们在染色体上的分布特征进行了分析. lan -Faridi等[38]以19个含有来自高粱连锁群A的DNA 标记的BAC克隆和1个18S~28S rDNA克隆、1个克隆的着丝粒相关的DNA序列为探针通过FISH构建了高粱1号染色体的细胞遗传图，详细地阐述了高粱1号染色体的主要细胞遗传学特征。
3展望
随着染色体制片技术和探针标记技术的不断改进, 以及组织化学和分子生物学技术的迅速发展, 荧光原位杂交技术已得到不断改进和完善, 新的荧光原位杂交技术不断涌现。发展的格局呈现多样化, 灵敏度和分辨率也不断地提高, 在生物研究中将得到越来越广泛的应用。
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基因工程技术的现状和前景发展 摘要 从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。 基因工程应用于植物方面 农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。?在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。?随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，**提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。? 基因工程应用于医药方面 目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。?目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。 基因工程应用于环保方面
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
植物转基因技术 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
生物工程的导论论文之植物转基因技术 生物1002班郭雅莉 201041006 摘要：目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。为此，我将对植物转基因技术及其应用、和当代社会发展的概况进行系统阐述，同时对转基因食品的安全性问题进行系统的讨论。 关键词：国际状况转基因技术应用安全性问题 自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 然而由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食 品”[1]。 一、国际植物转基因技术状况简介 转基因技术已在多种植物上获得成功，转基因的棉花、大豆、玉米、水稻、烟草、番茄、油菜等重要粮食作物和经济作物已作为商品投入市场。其进入田间实验的种类不断增加，除转基因粮食作物之外，转基因蔬菜、瓜果、牧草、花卉、林木及特用植物数量逐渐增加，基因种类和来源日益丰富，转基因性状日趋多样复杂。 在所涉及的转基因方法中，农杆菌介导法占50种，基因枪轰击法24种，DNA直接转移法2种，电击介导法2种，化学介导法1种[5]。已把一
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
荧光原位杂交技术FISH 1 目的 通过FISH实验检测两条Brd2基因cRNA探针的效价。 2材料与仪器 2.1材料 件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸45 s；循环30次； 72℃再延伸8 min。 2) 将所有PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产 物，并用微量分光光度计测定其浓度。 3) 进行体外转录反应合成Brd2 cRNA探针，20 μL体外转录反应体系如下：RNase
inhibitor 1μL，10×NTP dig labeling mixture 2μL，10×transcription buffer 2μL，Template DNA 13μL，RNA polymerase 2μL。 4) 37℃水浴孵育2 h，取0.5μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。 5) 加入2μL无RNase污染的Dnase I 37℃水浴孵育15 min来消化模板DNA。 6) 加入EDTA 0.8μL，加入5.6μL NH4Oac终止反应，再加入56μL无水乙醇并混匀，于 -80℃放置20 min。 7) 15000 r/min,4℃离心15 min，弃上清，加入700μL 80%的无水乙醇混匀，15000 r/min,4℃ 离心10 min沉淀RNA。 8) 干燥后用DEPC处理的水50μL溶解RNA。合成的两条探针经1%琼脂糖凝胶电泳鉴 定并用微量分光光度计测定探针浓度，于-80℃保存备用。 3.2荧光原位杂交实验检测探针的效果 1) 正常C57BL/6小鼠用1%戊巴比妥钠深麻后，依次以30 mL 0.01 mol/L DEPC-PBS和 100 mL含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）行左心室灌注，小心剥离脑组织，于4℃环境下用上述相同固定液进行后固定过夜，后将组织转移浸没于含30%蔗糖的PB溶液中脱水至沉底。 2) 最后取出组织用OTC包埋，冰冻切片机连续切片至需要的层面，切片厚度30 μm。 3) 选取上述脑组织切片于室温条件下经含有2%H2O2的0.1 mol/L DEPC-PB处理10 min 以阻断内源性过氧化物酶，再用0.1mol/L DEPC-PB室温漂洗10 min，接着用含 0.3%Triton X-100的0.1 mol/L DEPC-PB处理20 min，在用乙酰化液处理10 min，后 于0.1mol/L DEPC-PB中清洗2次，每次10 min，后加入预杂交液，60℃预杂交1 h 以封闭非特异结合位点。 4) 分别于两组切片中加入探针并使探针终浓度为1 μg/mL。于60℃杂交炉中恒温孵育 16-20 h，同时设立省略探针的空白对照，以上操作严格在无RNA酶环境下进行。 5) 杂交后组织切片置于wash buffer中60℃浸洗2次，每次20 min，接着切片在RNase buffer中室温孵育5 min，后加入终浓度为20 μg/mL的RNase，37℃作用30 min以消化未结合的cRNA探针。 6) 接下来恒温37℃条件下依次用2×SSC，0. 2×SSC溶液各浸洗切片2次，每次20 min， 再在TS7.5溶液中室温孵育5 min，后置于TBS溶液中室温封闭1 h，加入地高辛抗体（POD-anti-DIG,1:100）室温孵育过夜。
植物叶绿体基因工程发展探析(一) 摘要从叶绿体的概念、转化优点、转化主要过程及方法等方面概述了叶绿体基因工程的发展情况,介绍了叶绿体基因工程的应用,包括提高植物光合效率、合成有机物质、生产疫苗、增强植物抗性及在系统发育学中的应用等,并提出叶绿体基因工程存在的问题,对其未来发展进行了展望。 关键词植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年Straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年Baur和Correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣1]。1988年Boynton等首次用野生型叶绿体DNA转化了单细胞生物衣藻突变体(atPB基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。 1叶绿体基因工程概述 1.1叶绿体简介 叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状DNA。叶绿体DNA分子一般长120~160kb。叶绿体DNA有IRA和IRB2个反向重复序列(分别位于A链和B链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。 1.2叶绿体基因组转化优点 叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。 1.3叶绿体转化的主要过程 叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物4]。 1.4叶绿体转化的主要方法 依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株5]。二是农杆菌T-DNA介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的Ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是PEG处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的PEG浓度下与植物原生质体共培养。 2叶绿体基因工程的应用 2.1提高植物光合效率 植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于Rubisco酶的丰富度。Rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制CO2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量6]。很多科学家正试图通过提高Rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
荧光原位杂交（FISH）综述 摘要 本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。 关键词：荧光原位杂交; 1.发展 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。 2.原理 通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。 原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展 早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。如果使用低辐射能的放射性标记物，如 3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。20世纪80年代后期，非放射性DNA荧光标记技术的发展解决了上述问题，这些标记将高灵敏度与高分辨率结合起来，适用于原位杂交。 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，因此有可能将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的相对位置。为了得到最高的灵敏度，探针的标记需要尽可能大一些。在过去这就意味着探针必须是相当长的DNA分子，通常是至少40kb的克隆片段。现在已发展出将较短的DNA分子进行标记的技术，对长度的要求已不那么重要。 构建物理学图谱时，克隆的DNA片段可被简单地看作另一种类型的标记物，但在实际应用，由于克隆的DNA片段确定了DNA序列，将其作为标记应用则具有另一层含义。因此，克隆间位置关系的确定提供了基因组图谱与其DNA序列间的直接联系。如果探针是长的DNA片段，至少对于高等真核生物，就可能产生这样一个问题：探针中可能含有一些重复的DNA序列，因此探针可能与染色体上多个位点杂交，探针在使用前要与来自被研究组织的未标记DNA混合。这种DNA可以是总的核DNA（即代表了全基因组），但如果使用富集重复序列的片段更好。加入未标记DNA的目的在于与探针中的重复序列结合并将其封闭，使随后的原位杂交完全由单一序列驱动（Lichter et al.，1990）。这样非特异性杂交即可被减少或完全消除[1]。 4.荧光染料 常用的荧光染料的DAPI(在UV 光激发下发出蓝色荧光)、FITC和荧光素(蓝光 下发出绿色荧光)以及罗丹明和德克萨斯红(绿光激发下产生红色荧光)。由于FISH 的信号空间分辨率高。不同的DNA 探针可以用不同的半抗原标。再用不
荧光原位杂交技术及其应用 摘要：荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具，特别是对一些染色体数目异常和复杂染色体异常的诊断，架起了染色体显带技术和分子遗传学之间的桥梁。本文主要就荧光原位杂交技术的发展历程、探针制备和临床应用做一简单的综述。 关键词：FISH；荧光原位杂交；临床应用；产前诊断；肿瘤 Fluorescence in situ hybridization and applications SUN Jingjing,YAN Shouqing (College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China) Abstract:FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads, bridging the gap between conventional chromosome banding analysis and molecular genetic DNA studies. This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics. Key words:FISH; Fluorescence in situ hybridization; Clinical applications; Prenatal diagnosis; Tumor DNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法[1]。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。 1 FISH技术的产生 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H 的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术[2]，但是没有得到广泛应用。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技
关于植物转基因技术的一些读书报告 在生物工程导论课上，我了解到了一些关于植物转基因技术的知识，对此产生了浓厚的兴趣，加上自己的专业在以后会有这方面的学习和发展，所以查阅了一些相应的资料，有了一些感想。 世界上首次使用植物转基因技术是1983年美国获得了转基因烟草，自 此以后，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用。目前，转基因技术已经成熟，转基因作物也已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。植物转基因技术主要应用于农业，生物和医学等领域。进行植物品种的改良，新品种的培育以及作为生物反应器生产生物药物和疫苗等。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。因此，人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。这次技术革命将使全球农业生产发生深刻的变革，使人们看到消除饥饿与贫穷的希望。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 但是，像其它新生事物的发展过程一样，由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性问题 就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食品”。甚至当前，一些电视、广播、报纸等新闻媒体为了某些利益也对公众进行炒作和误导，夸大转基因作物的风险，使人们对转基因技术及其转基因食品由最初的争论演变为恐慌甚至存在一定的抵触 情绪。如某电视广告中所提到的：某某食用油，不含转基因成分，为健康加油；某网站新闻报道：湖北某超市惊现转基因大米等等，使人们对当前社会上对转基因技术存在的一些偏见。 在此我希望可以尽量避免偏见，对植物转基因技术的应用和当代社会发展的概况进行一些比较系统的阐述，对植物转基因技术与当代社会发展的关系进行一点探讨。 植物转基因技术的基本概念和原理 基因是生命体具有的特定遗传信息和遗传效应的核苷酸序列，存在于DNA （脱氧核糖核酸）上，是控制生物性状遗传的结构和功能单位。转基因是指利用分子生物学手段，将人工分离和修饰过的某些生物的基因转移到其它物种，以改造该物种的遗传特性。植物转基因技术又称植物基因工程，是把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因转移到植物的基因组中，即对植物进行遗传转化，使其在性状、营养和消费品质等方面满足人类需要的技术。应用转基因技术构建的植物为转基因植物，又叫基因修饰植物，其中发展最快的是转基因植物食品。 植物转基因技术的内容包括：目的基因的分离和鉴定、植物表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、转化细胞的筛选、转基因植物细胞的鉴定以及外
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用，提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交，即FISH技术。1981年Harper 成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH 技术得到了迅速的发展和广泛应用。 1．原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。2．实验流程 FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。 3．特点 原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 4．应用 该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 荧光原位杂交FISH操作规程 一、主要试剂 1变性液20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml 2PBD液1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程 1 硅化玻片切片烤片60过夜 2 脱蜡入水斜置切片空干 3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35 4 0.2M HCl处理室温10接步骤3 5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3 6 切片入20梯度酒精脱水各2空干 7 切片入85变性液8 8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干 9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜 10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1 以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T—DNA是质粒上一段10—30kb 的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB，pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在V irD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。