Western Blot详细实验步骤及试剂配方
1. 溶液配置
1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）
药品用量
1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mL
SDS 0.5 g
BPB（溴酚蓝，有毒）25 mg
甘油 2.5 mL
去离子水up to 5 mL
分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）
药品用量
Tris 30.3 g
Glycine (甘氨酸) 144.2 g
SDS 10 g
ddH2O up to 1 L
室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液
（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶
Tris (MW: 121.14) 45.43 g
H2O up to 250 mL
浓盐酸调PH 8.8
（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶
Tris (MW: 121.14) 30.29 g
H2O up to 250 mL
浓盐酸调PH 6.8
二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)
SDS 10 g
ddH2O up to 100 mL
室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制
过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g
超纯水up to 1 mL
混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液
丙烯酰胺 150 g
甲叉双丙烯酰胺 4 g
Milli-Q水 30 mL
滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)
Tris (MW: 121.14) 30.3 g
Glycine (甘氨酸) 144 g
去离子水 up to 1 L
室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
1.8 脱色液（蛋白胶考染后脱色）
甲醇 30 mL
冰醋酸 10 mL
ddH2O up to 100 mL
注意：甲醇具有挥发性，对人体的神经系统和血液系统影响最大，它经消化道、呼吸道或皮肤摄入都会产生毒性反应，甲醇蒸气能损害人的呼吸道粘膜和视力，使用过程中最好戴口罩。脱色液常温放置即可。
1.9 考马斯亮蓝染色液（100 mL）
考马斯亮蓝R-250 0.25 g
甲醇 45 mL
ddH2O 45 mL
冰醋酸 10 mL
过滤除去颗粒状物质。
1.10 10×TBS缓冲液
Tris (MW: 121.14) 12.11 g
NaCl 87.66 g
H2O up to 1 L
调PH 7.4~8.0
高压灭菌后，室温保存即可。
1.11 洗脱液(TBS-T)
10×TBS 100 mL
H2O up to 1 L
Tween 20/80 0.5 mL
加了Tween 20/80后的洗脱液，需要置于4℃保存。
1.12 10×PBS缓冲液
NaCl 80 g
Na2HPO4 28.8 g
KH2PO4 2 g
H2O up to 1 L
高压灭菌后，室温保存即可。
1.13 洗脱液(PBS-T)
10×PBS 100 mL
H2O up to 1 L
Tween 20/80 0.5 mL
加了Tween 20/80后的洗脱液，需要置于4℃保存；PBS-T与TBS-T同功。
1.14 封闭液（现配）
脱脂奶粉 5 g
1×T/PBS-T up to 100 mL
混匀后，与4℃可保存一周，若加了防腐剂，一抗可以回收循环使用直到杂不出蛋白为止。
1.15 一抗孵育液（鼠源His抗体为例）
封闭液 15 mL
鼠源His抗体 2 μL
冰上操作，于4℃保存即可，可回收使用。
1.16 二抗孵育液（鼠抗为例）
封闭液 10 mL
鼠抗 2 μL
现配现用，不用回收。
1.17 100 mM PMSF (苯甲基磺酰氟)
PMSF 0.174 g
异丙醇 up to 10 mL
混匀后分装到1.5 mL离心管中，每管1 mL，置于-20℃保存，其工作液一般为1 mM，我们实验室使用的是2 mM的工作液，有剧毒，使用时注意安全，吸入、误服或通过皮肤吸收，都可致命。
2. 实验步骤（原核表达为例）
2.1 菌种培养
将原核表达载体转化BL21感受态细胞，之后涂板（含抗生素的培养基，一般是卡纳或氯霉素），过夜培养后，挑选单克隆到装有2 mL LB培养基（Kan+）的10 mL离心管中，在摇床中（37℃，225 rpm）过夜活化（12 h左右）。
2.2 原核表达菌扩大培养
按1:100的比例稀释（如在装有25 mL抗性LB培养基的50 mL离心管中加入250 μL菌种培养液），在摇床中（37℃，225 rpm）培养2 h。
2.3 OD值测量
提前开好超净工作台的紫外，将扩大培养的菌在超净工作台中吸取1 mL放入1.5 mL的EP管中，待检测，记得吸取无菌的LB培养基去调零。大肠杆菌菌液OD值为0.5~0.6时为对数期最佳，此时的细胞活性最佳。以A732的分光光度计为例，说明OD值测量的详细过程。
（1）开机：实验室的分光光度计有些问题，需要提前40 min打开，第一次打开，程序会卡在检查步骤四，需经过5 min后关掉，再打开，静候35 min。
（2）吸收光设置：按1（光度）→GOTO WL→输入“600”→ENTER→F1 (T% / ABS) →F3（测量屏幕）。
（3）调零：用1 mL移液枪吸取800 μL无菌的LB培养基（空白对照）加入比色皿中（应素平提供，若是全空的比色皿可能需要3 mL），放入测量位置→AUTO ZERO（稍等片刻，听到有跳闸声）→START→测得到LB培养基的OD值为0左右。
（4）菌液OD值测量：在超净工作台中量取1 mL菌液至1.5或2 mL PE管中，然后量取其中的800 μL至比色皿中（菌液换取应倒入固定的锥形瓶中，稍后高压灭菌，使抗生素失活），比色皿放入卡槽，点击START测量其OD值，将OD值调为0.6左右为佳（比如测到OD值为0.45，则再培养10 min继续测，OD 值为0.5~0.6最佳）。
（5）关机：RETURN→MODE→F3（是）→关闭电源，清洗比色皿。
2.4 IPTG诱导
吸出5 mL左右作为对照（不加IPTG），剩余的菌液中加入IPTG，其工作浓度约为0.8-1.0 mM（如在23 mL菌液中加入23 μL 浓度为1 M的IPTG），置于摇床中，16℃诱导培养10-12 h（注：IPTG浓度和诱导温度需要摸索，不同蛋白可能不一样，IPTG有毒，操作小心）。如果没有蛋白表达就需要筛选条件了，如进行过0.4 mg/20 mL ，0.6 mg/20 mL，0.8 mg/20 mL，1.0 mg/20 mL，摇床温度25或28℃等。
2.5 收集细胞
吸出1.8 mL菌液于2.0的EP管中，4℃，5000 rpm离心10 min收集细胞，将上清倒掉，加入1.8 mL PBS重悬（或bing buffer）细胞，并加入PMSF使终浓度为2 mM，并将其转移至5 mL离心管中，准备破碎细胞。剩余的菌液于A732的立式离心机，4℃，5000 rpm离心10 min收集细胞，沉淀可以在-20℃保存；待日后使用。
2.6 细胞破碎
利用超声波破碎仪裂解细胞，工作5 s停5 s，打8 min，看到原来比较浑浊的菌液变得比较澄清，说明细胞破碎得很好。裂解过程需低温处理，将样品放于冰水混合物中进行破碎操作；细胞破碎后，12000 rpm，1 min，收集上清和沉淀，或将上清分装到1.5 mL离心管中，每管20 μL，保存于-80℃。或直接进行SDS-PAGE检测，确定蛋白是否表达出来，是否会形成包埋体，同时调整蛋白浓度。
2.7 蛋白胶的制备
先将玻璃板和梳子洗干净，晾干，然后配胶。
13% 分离胶的配制：
去离子水 2.7 mL
30% 丙烯酰胺 4.6 mL
1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)
2.5 mL
10% SDS 100 μL
10% AP 100 μL
TEMED(四甲基乙二胺) 4 μL
按如上顺序加样，加到SDS之后的样品都需要用枪头搅拌混匀，用1 mL的
枪吸取分离胶加到已装好的板子上，然后用去离子水压线，大约半小时即可凝固。注意：AP（过硫酸铵）对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性，吸入后引起鼻炎、喉炎、气短和咳嗽等；眼、皮肤接触可引起强烈刺激、疼痛甚至灼伤。口服引起腹痛、恶心和呕吐。长期皮肤接触可引起变应性皮炎。TEMED(四甲基乙二胺)有毒，易燃，有腐蚀性和刺激性。
<5% 浓缩胶的配制：
去离子水 3.4 mL
30% 丙烯酰胺 830 μL
1.0 M Tris-HCl (PH=6.8) 630 μL
10% SDS 50 μL
10% AP 50 μL
TEMED 5 μL
按如上顺序加样，加到SDS之后的样品都需要用枪头搅拌混匀，将压线的水倒干净，然后用1 mL的枪吸取浓缩胶加到已装好的板子上，插梳子，给1小时凝固时间。
2.8 煮样
将已经分装好的20 μL/ 1 EP管中加入5 μL的5×Loading buffer，在煮样机中100℃煮12 min。目前比较惯用的做法是将样品放到PCR管中，利用PCR 仪进行蛋白质变性工作。
2.9 点样跑胶
Marker 为6 μL，样品7 μL，所有孔都要点上样品，让其平衡。跑浓缩胶的条件为恒压90 V/20 min，分离胶为110 V/1.5 h，电泳至前沿溴酚蓝刚刚跑出。
注：①用移液器取7 μL样品；tip投紧靠玻璃板，慢慢加入样液，加入上样孔中切勿产生气泡（样液中一般会加入溴酚蓝作为指示剂）；
②上样完成后，检查Running buffer是否过最低玻璃板，即胶块要浸在Running buffer中才能有电流通过；（使用新鲜的buffer）；
③组装电泳仪（红色部分对准红色电极，黑色部分对准黑色电极），矮的一面在内测，待会会浸泡在Running buffer中。90V，电流在60 mA左右为正常。（先采用90V跑浓缩胶，后采用110V跑分离胶）
2.10 考染
用考马斯亮蓝考染1小时，然后用去离子水煮法脱色，考马斯亮蓝可以回收循环利用（先倒在小烧杯中，再倒到瓶子里）。水煮法是先用1 L烧杯盛500 mL 水在电炉上煮开，然后放胶进去煮10分钟左右，然后换水，再煮，重复3次左右即可，注意不要让胶折叠，不然边缘有缺口的地方会裂，导致蛋白胶断裂；脱色好的胶拿到8楼的显影仪照胶。
2.11 转膜
将电泳完的聚丙烯酰胺凝胶取出，按照正确顺序安装好转膜装置，冰浴条件下300mA 恒流90 分钟将蛋白转移到PVDF膜上；或恒压90V，1 h（40~60 kDa）。
注：①把PVDF膜剪裁好放入装有甲醇的容器内（使膜带电，使蛋白质向带电的膜上转移）；
②准备器材：2块海绵（黑色）、2块滤纸（白色）、放入电泳槽的冰袋；
③在容器内加入1ⅹTransfer buffer（1 L），并且转膜操作在液体内进行。黑板在下面，最低层是海绵，之后是滤纸，然后是蛋白胶（蛋白Marker大的条带在右下角或左上角，确保转膜后翻过来的膜是正面），再加上PVDF膜（注意不要有气泡，可以用起胶板在上面划一遍），滤纸，加海绵，最后将白板夹子将它们夹好。
④取出5层板，放入夹层中，白色夹子离膜近，黑色底板离膜远，然后放入电泳槽中（黑板对黑面，白板对红面）；进行电泳（因为转膜过程中电子移动会产生热，需要把电泳槽放入冰的环境中），一般恒压90V，1 h，隔壁实验室经常做蛋白的说有个比较稳的条件就是恒压10 V，2 h。
2.12 封闭
取出膜，可在膜的正面做一个标记（可用剪刀剪个角），用5%的脱脂牛奶封闭液封闭 1 小时。用TBS-T 溶液清洗三次，每次10 分钟。
2.13 一抗孵育
将洗涤好的膜放入一抗孵育液中，抗体浓度1:300稀释，4℃孵育过夜，一般是8~12 h。一抗孵育液后用T/PBS-T洗涤液洗涤3次，每次10min。
2.14 二抗孵育
将洗涤好的膜转移到二抗孵育液中，常温孵育1 h。之后用T/PBS-T洗涤液洗涤3次，每次15min。
2.15 化学发光显影
将洗涤好的样品放在孵育盒中，并加T/PBS缓冲液，保证其湿润，然后在理论大小条带处加入显影液(显影液A与B按1:1的比例在1.5 mL的EP管中混匀，我的一块胶用200 μL: 200 μL)，显影(8楼的显影仪密码是将前面的8都删除即可，若是考染胶用下面的程序，抗体胶用上面的发光程序)，保存结果，分析结果。