荧光原位杂交的染色体分析（一）标本的制备
1．室温下，依次用70％、90％和100％的乙醇脱水5min。
2．空气干燥载玻片。
3．若短期使用，载玻片可在室温贮存数天。若载玻片要长期保存，应在室温下过夜使组织“老化”（aged），然后放入容器中，该容器密封于含干燥剂的塑料袋内，－70℃保存。根据作者的经验，在6个月内使用的载玻片可贮存在－20℃。在杂交实验之前解冻这些载玻片，不提倡反复冻融载玻片。
（二）缺口平移法标记探针
通过缺口平移法生物素（酰）化DNA探针
1．结合：2μg探针DNA，10μl 10×反应缓冲液，10μl β－巯基乙醇，10μl 核苷酸母液（含0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5mmol/L dGTP,
0.5mmol/L生物素-16-dUTP和0.12mmol/L dTTP），20单位DNA聚合酶I和
1：1000稀释的DNase I，加双蒸水至100μl（最后加酶）。
2．在15℃温育2h。
3．置反应混合物于冰浴直至反应产物的大小被确定。
4．凝胶电泳检测探针分子的长度：取10μl反应混合物，加入凝胶上样缓冲液，水浴箱中煮沸2～3分钟使其变性，冰浴3min，上样到1～2％的琼脂糖微型凝胶中，并以适当大小的标准品做对照，以50V/cm电泳3min。用浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭染胶，在紫外透照仪上显示DNA并拍照。
5．对于最佳的杂交条件，探针（可见一脱尾）应为100
～500nt。根据电泳结果进行下述步骤：
a.如果探针大小在期望的范围内，进行步骤6。
b.如果探针太大，可加入更多的DNase I，在15℃温育。
c.如果探针未完全消化，纯化探针并重复缺口平移法。
d.如果探针太短，用较少的DNase重复反应。
6．为使DNase失活，加入2μl 0.5mol/L EDTA和1μl SDS，在68℃加热10min。
7．用离心柱凝胶过滤法从标记的探针中分离出未掺入的核苷酸：
a.用1ml注射器装入硅胶玻璃棉至0.2ml刻度处，加经缓冲液平衡的
Sephadex G50至1ml刻度处，将此柱置15ml的离心管内，室温下，
3000r/min离心6min。
b.去除过柱后的液体，加入缓冲液重复离心直至柱内容物紧密充填至1ml
刻度处，加100μl柱缓冲液，3000r/min离心6min，重复洗涤步骤3次。
在最后一步洗涤后，确保流量与上样缓冲液量相等，即100μl。
c.探针溶液离心之前，放1.5ml的反应管在注射器下方的15ml管内，与
前面步骤相同，加探针液到柱内并离心，过柱后的液体收集在反应管中，这时已含有20ng/μl的标记探针。该探针已可用于原位杂交或贮存于－
20℃。
用缺口平移法进行地高辛标记
与缺口平移地生物素化法几乎相同，仅10×寡核苷酸母液成分不同：
0.5mmol/L dATP, 0.5mmol/L dCTP, 0.5 mmol/L dGTP, 0.125 mmol/L地高
辛-11-dUTP，0.375mmol/L dTTP。
（三）斑点印迹分析法检测标记物
1．将分装的1μl标准DNA稀释液和同法配制的1μl待测DNA稀释液点于硝酸纤维素膜上。
2．硝酸纤维素膜置80℃真空烤箱内1h。
3．室温下，用AP7.5缓冲液漂洗硝酸纤维素膜1min。
4．将硝酸纤维素膜密封于含10ml封闭液的塑料袋中，置37℃温育30min。
5．打开塑料袋的一端，弃去封闭液，加入新鲜配制的链亲和素-碱性磷酸酶交联物溶液，重封塑料袋口，置37℃温育30min。
6．从塑料袋中取出硝酸纤维膜，用AP7.5缓冲液漂洗（室温下两次各5min），再用AP9.5缓冲液漂洗（室温下10min）。
7．将硝酸纤维素膜重封于含显影液的塑料袋中（33μl NBT溶于10ml AP9.5缓冲液中）。小心混匀后（不可漩涡混匀！）加入25μl BCIP，再次轻轻混匀反应液，在37℃温育直至显影达满意程度，一般15～60min。
8．从塑料袋中移去硝酸纤维膜，用TE缓冲液终止显色反应。
9．空气干燥后，评估分析结果：测试组和对照组DNA的颜色密度应进行比较。
在理想的杂交结果，最低稀释度信号应当是可见的。
（四）荧光标记原位杂交探针的混合与变性
1．混合20～60ng单拷贝DNA和3～5μg经剪切的鲑精DNA（作为载体）。如果反应后体积少于10μl，可冻干；若体积较大，可加入1/20
体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积100%乙醇使DNA沉淀。混匀并置－70℃30min。在4℃用Eppendorf离心机以12 000r/min离心10min，弃上清，沉淀物以500μl 70％乙醇漂洗后再离心（4℃，12 000r/min, 10min），弃上清并冻干。
2．重悬于5μl去离子的甲酰胺中，于室温漩涡混匀数分钟。
3．加5μl杂交缓冲液，漩涡混匀5～10min。
4．在75℃使DNA探针变性5min，接着冰浴5min，这时探针已可用于杂交。（五）载玻片上DNA变性
变性
1．在载玻片上选择合适的杂交区，用铅石笔在载玻片的另一面作记号。
2．变性前将载玻片置60℃烤箱孵育以防止变性液加至载玻片时温度的降低。
3．加变性液至Coplin广口瓶内，在水浴箱中加热至70℃，用置于瓶内的温度计检测变性液的温度（这是关键步骤！）为得到好的结果，温度应达70℃。
4．将预热的载玻片（一次不多于3片）移至含变性液的Coplin广口瓶内准2min。
5．立即将载玻片依次移入含70％、90％和100％乙醇（冰冷）的Coplin广口瓶内，各5min。
6．空气干燥后，载玻片已可用于杂交。
杂交
1．将10μl含变性探针的杂交混合物加至载玻片的变性靶DNA上。
2．
在杂交的液滴上小心地盖上18×18cm的盖玻片，不要滞留气泡。
3．用橡皮泥将盖玻片四周封好，置载玻片于湿盒内，37℃温育过夜。
（六）检测
1．分别在42℃和60℃的水浴箱内预热漂洗液A（50％甲酰胺，2×SSC pH7.0）和B（1×SSC～0.1×SSC pH7.0）。
2．从湿盒内取出载玻片，用镊子小心除去橡皮泥。
3．置载玻片于含预热至42℃漂洗液A的Coplin广口瓶中，在水浴箱中振荡10min 直至盖玻片脱落，将载玻片移至另一含漂洗液A的广口瓶中，振荡5min，更换漂洗液A两次，每次振荡5min。
4．将载玻片移入含预热（60℃）漂洗液B的Coplin广口瓶中，漂洗5min，更换漂洗液两次，每次漂洗5min。
5．将载玻片从Coplin广口瓶中取出，弃尽液体，加200μl封闭液，盖以22×40mm的盖玻片，置湿盒内，37℃温育至少30min。
6．从每张载玻片上移去盖玻片，去除过的的液体，加200μl带荧光的报道分子检测液（如5μg/ml与荧光素偶联的亲和素或6μg/ml与罗丹明偶联的抗地高辛抗体），在37℃湿盒内温育30min。所有的后序步骤均应在避光的Coplin 广口瓶中进行（如外裹锡箔纸）。
7．移去盖玻片，将载玻片移至漂洗液C（4×SSC，0.1％ Tween20 pH7.0）中，在42
℃（振荡水浴箱）漂洗三次各5min。
8．将载玻片置入含复染剂（如2×SSC，200ng/ml DAPI）的Coplin广口瓶中，室温振荡20min。
9．将载玻片移至漂洗液D（2×SSC，0.05％ Tween 20）的Coplin广口瓶中，室温中温育1～2min。
10．从Coplin广口瓶中取出载玻片，加20～30μl防退色液并盖以22×40mm 的盖玻片，置载玻片于合适的盒内，以便4℃长期保存。
（七）染色体原位抑制（CISS）杂交
1．结合适量标记的探针DNA，人竞争DNA（Cot1片段）2～4μg，加鲑精DNA至总量为10μg DNA。
2．加1/20体积乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇使DNA沉淀，置－70℃ 30min。
12 000r/min离心10分钟后，大多数可见沉淀。弃上清并用70％乙醇漂洗，
再离心弃上清。
3．冻干样本，重溶于5μl去离子甲酰胺中。
4．加5μl变性缓冲液。
5．在75℃温育5min使DNA变性。
6．迅速将含探针溶液的微量离心管移至37
℃，温育5～20min（甚至更长）使部分DNA再退火。
7．预退火的探针与变性DNA在载玻片上混匀。
8．继续进行（四，五，六）所述的步骤。
（八）信号放大
1．小心地从载玻片上移去盖玻片。
2．将载玻片移至漂洗液C（4×SSC，0.1％ Tween20 pH7.0）中，在42℃漂洗三次共10min。
3．从Coplin广口瓶中取出载玻片，吸去载玻片上的残液，加200μl含1～5μg/ml生物素化的抗亲和素抗体的检测缓冲液，覆以22×40mm的盖玻片，置湿盒内在37℃温育30min。
4．在42℃含漂洗液C的Coplin广口瓶中漂洗载玻片三次各5min。
5．从Coplin广口瓶中取出载玻片，吸去载玻片上的残液，加200μl含5μg/ml 偶联荧光染料的亲和素检测缓冲液。
6．漂洗和染色体步骤见（六）。
（九）多色荧光标记原位杂交
1．在DNA沉淀之前，采用几种与不同报道分子结合的探针，而不是仅用一种探针。
2．合适的报道分子结合物必须加到检测缓冲液中（六）。每种报道分子结合物应与一种荧光染料结合，该染料在光谱上能与同一实验所用的其它荧光染料相区别。
荧光原位杂交（FISH）综述 摘要 本文简单介绍了荧光原位杂交（FISH）技术的一些基础理论知识以及常用操作方法和步骤。 关键词：荧光原位杂交; 1.发展 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。荧光标记的核酸探针只和具有高度相似性的核酸杂交，可用于染色体上基因的定位，或在分子生态学中用来标记不同分类细菌或古菌中的核糖体RNA[1]。1969年，Pardue等和John两个研究小组发明了原位杂交技术，放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到细胞制备物上，通过放射自显影技术(m icroautoradiography, MAR)检测杂交位点，这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下，使核酸序列在细胞内被检测[2]。 2.原理 通过特定分子的荧光标记探针在细胞内与染色体上特意的互补核酸序列原位杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号。由于荧光燃料收到一定波长的（即激发波长）的光激发后会发射荧光（即发射波长），所以就滤光镜选择合适的激发波长的光，即可显示某一特定的荧光染料，于是就可以直接显示特定细胞核中或染色体上的DNA序列间相互位置关系[2]。 原位杂交的处理：染色体上杂交的位点提供了DNA探针序列的定位信息。所以应用该方法时，需打开维持染色体DNA双螺旋结构的碱基配对以使其形成单链分子（这称为DNA变性）。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理[1]。
3.关于探针的发展 早期原位杂交技术中探针是放射性标记的，但这个方法并不令人满意，因为放射性标记很验证同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂交成功的必要条件。灵敏度要求放射性标记具有高中辐射能（例如用32P标记），当标记物能量过高时，会因为信号散射导致分辨率过低。如果使用低辐射能的放射性标记物，如 3H可以得到较高的分辨率，但由于灵敏度低而需要长时间曝光，并由此导致背景过高，难以分辨出真正的信号。20世纪80年代后期，非放射性DNA荧光标记技术的发展解决了上述问题，这些标记将高灵敏度与高分辨率结合起来，适用于原位杂交。 现已设计出具有不同发光特性的荧光标记物，因此有可能将一组不同的探针与单个染色体杂交，并分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的相对位置。为了得到最高的灵敏度，探针的标记需要尽可能大一些。在过去这就意味着探针必须是相当长的DNA分子，通常是至少40kb的克隆片段。现在已发展出将较短的DNA分子进行标记的技术，对长度的要求已不那么重要。 构建物理学图谱时，克隆的DNA片段可被简单地看作另一种类型的标记物，但在实际应用，由于克隆的DNA片段确定了DNA序列，将其作为标记应用则具有另一层含义。因此，克隆间位置关系的确定提供了基因组图谱与其DNA序列间的直接联系。如果探针是长的DNA片段，至少对于高等真核生物，就可能产生这样一个问题：探针中可能含有一些重复的DNA序列，因此探针可能与染色体上多个位点杂交，探针在使用前要与来自被研究组织的未标记DNA混合。这种DNA可以是总的核DNA（即代表了全基因组），但如果使用富集重复序列的片段更好。加入未标记DNA的目的在于与探针中的重复序列结合并将其封闭，使随后的原位杂交完全由单一序列驱动（Lichter et al.，1990）。这样非特异性杂交即可被减少或完全消除[1]。 4.荧光染料 常用的荧光染料的DAPI(在UV 光激发下发出蓝色荧光)、FITC和荧光素(蓝光 下发出绿色荧光)以及罗丹明和德克萨斯红(绿光激发下产生红色荧光)。由于FISH 的信号空间分辨率高。不同的DNA 探针可以用不同的半抗原标。再用不
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
Ｖｏｌ．２５Ｎｏ．１２００６ 荧光原位杂交技术在微生物群落结构研究中的应用 李华芝 李秀艳 徐亚同 （华东师范大学资源与环境学院环境科学与技术系上海，２０００６２） 摘要该文综述了荧光原位杂交技术的发展、技术原理及其在环境微生物群落研究中的应用，还探讨了该技术在应用中存在的问题，并对其应用前景进行了展望。 关键词 荧光原位杂交 １６ＳｒＲＮＡ寡核苷酸探针微生物群落结构 ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎＳｉｔｕＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）ｔｏ ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｙＳｔｒｕｃｔｕｒｅ ＬｉＨｕａｚｈｉ ＬｉＸｉｕｙａｎ ＸｕＹａｔｏｎｇ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｂａｓｉｃｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｉｔｓｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＦＩＳＨｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｔｈｅｎｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｅｎｖｉ－ ｒｏｎｍｅｎｔａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｔｕｄｉｅｓｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ，ｉｔｓｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｓｈｏｒｔａｇｅｓｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄｉｎａｎｅｘ－ａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｗｅｒｅｅｘｐｅｃｔｅｄａｂｏｕｔｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＦＩＳＨ１６ＳｒＲＮＡｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 微生物是生态系统的重要组成部分，在各种元素的生物进化循环中起着关键作用。因此，研究微生物的群落结构，借此了解微生物和环境的关系尤为重要。长久以来，微生物群落结构的调查方法一直是建立在分离和培养的方法上，这种方法不但费时费力，而且不能精确地反映混合菌群的组成和多样性，对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达到预期效果［１］。因此用传统培养方法所得出的调查结果不能准确反映微生物群落的组成情况，建立和发展一种不依赖微生物培养的方法来进行微生物群落结构研究是非常必要的。上世纪８０年代末至９０年代以来，分子生物学技术开始被广泛应用于微生物群落结构分析，且发展迅速，研究的焦点集中在具有保守序列的１６ＳｒＲＮＡ上。研究方法包括分子杂交法、ＰＣＲ法、ＳＳＣＰ法、ＤＧＧＥ法、ＴＧＧＥ法、 ＲＦＬＰ法、ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法和克隆基因文库分析法等， 具有很高的灵敏性，与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显的优越性，推动了微生物群落结构研究的快速发展。但是，这些基于 ＰＣＲ的方法可能会在扩增反应中引入误差，降低所 得信息的精确度。荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）作为一种不依赖ＰＣＲ的分子分析技术是以上各种分子标记技术的有益补充，它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体，同时对微生物群落进行评价。目前，ＦＩＳＨ技术广泛应用于微生物分子生态学和环境微生物物学中，已成为微生物群落研究的重要技术手段，对环境中复杂的混合微生物群落进行及时监控和准确鉴定也变得越来越重要，为污染治理和防治提供了新的思路和方法。 １荧光原位杂交技术的发展 １９６９年，Ｐａｒｄｕｅ等［２］和Ｊｏｈｎ［３］两个研究小组开发 了原位杂交技术，用放射性同位素标记的ＤＮＡ或２８ＳｒＲＮＡ与爪蟾卵细胞制备物进行杂交，进行显微 放射自显影检测。这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下，检测出细胞核酸序列，自此，原位杂交技术在染色体进化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。１９８８年，Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ等［４］首次将ＦＩＳＨ技术引入细菌学研究中，使用放射性标记ｒＲＮＡ寡核苷酸探针检测微生物。随着荧光标记的发展，非同位素染料逐渐代替 基金项目：国家高技术研究发展８６３计划专项资助（２００３ＡＡ６０１０２０） 净水技术 ＷＡＴＥＲＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ１６－－
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
仪器设备 1、医用微波炉； 2、水浴锅； 3、OLYMPUS BX51荧光显微镜； 4、OLYMPUS DP11数字显微照相机。 FISH试剂 （1）1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃； （2）20×SSC（）； （3）2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成； （4）25mg/ml蛋白酶K消化液。 （5）变性液(70％甲酰胺+2×SSC，：4ml 20×SSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺。每次新鲜配制。 （6）杂交后洗涤液：20×SSC 4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH 前升至室温。 实验步骤 1、脱蜡： 1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； 2）100％酒精两次，每次2min； 3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 2、蛋白酶处理: 1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 2）37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。 3）×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。 4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。 3、变性： 1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液； 2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； 3）78℃孵育8min； 4）即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min； 5）空气干燥。 4、杂交： 1）准备探针； 2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； 3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片； 4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。 杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片； 6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min； 7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min； 8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 检测：
第22卷哈尔滨师范大学自然科学学报 Vol .22,No .52006 第5期 NAT URAL SC I E NCES JOURNAL OF HARB I N NOR MAL UN I V ERSI TY 荧光原位杂交在微生物学中的应用及进展 3 王继华 杨茹冰 李 晶 (哈尔滨师范大学) 【摘要】 荧光原位杂交技术广泛用于分析复杂环境的微生物群落构成,可以在自然生境中监测和鉴定微生物,并能对未被培养的微生物进行检测.r RNA 为靶序列 寡核苷酸或P NA 探针的荧光原位杂交能提供微生物的形态学、数量、空间分布等信息,现已成为环境科学研究领域中的热点技术.本文对荧光原位杂交技术的发展和在环境微生物学中的应用进行了综述,探讨了该技术应用和发展前景. 关键词:荧光原位杂交;16S r RNA;寡核苷酸探针;P NA;环境微生物;微生物生态学 收稿日期:2006-04-11 3黑龙江省教育厅科技研究资助项目,(10541090),哈尔滨师范大学大学生科技创新基金资助项目,(2005-04) 0 引言 目前,在环境综合治理如废水、废气和固体废弃物的净化和处理中广泛应用生物学方法,因此只有充分了解微生物生态学和群落演替规律等,才能提高环境科学研究中的生物学效能,推动和深化环境整治工作,合理利用环境资源.传统菌种分离培养的鉴定方法不仅耗时费力,而且不能精确的反映混合菌群的组成和多样性,对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达 到预期效果[1] . 近几年,随着分子生物学技术如分子杂交、PCR 、核酸测序等的发展,微生物学研究领域发生 了深刻的变革,灵敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能.借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段.荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridizati on,F I SH )结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息,可以在自然或人工的微生境中监测和鉴定不同的微生 物个体,同时对微生物群落进行评价.F I SH 被广 泛应用于揭示微生物的原位生理学特性和功能,现已成为微生物分子生态学研究的重要技术手段. 1 F I SH 的发展和技术原理 1969年,Pardue 等 [2] 和John [3] 两个研究小组 发明了原位杂交技术(in situ hybridizati on,F I SH ),放射性标记的DNA 或28s RNA 被杂交到 细胞制备物上,通过放射自显影技术(m icr oaut oradi ography,MAR )检测杂交位点,这一技术可以在保持细胞形态完整性的条件下,使核酸序列在细胞内被检测. 其原理是:F I SH 技术检测核酸序列通过荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交,通过激发杂交探针的荧光来检测信号.荧光染料受一定波长(激发波长)的光激发后会发射荧光(发射波长),所以用滤光镜选择合适的激发波长的光,即可显示某一特定的荧光染料.常用的荧光染料的DAP I (在UV 光激发下发出蓝色荧光),
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
荧光原位杂交仪实验报告 实验者：魏兰兰 实验时间：2016/10/18—2016/10/19 一、实验目的 1．探针试剂吸液量定量—10ul； 2．观察探针试剂滴液时是否有残留； 3．观察探针试剂滴液后盖板是否能压紧，是否均匀摊开，石蜡是否能完全浸裹； 4．观察上一步试剂对探针试剂有无影响； 5．观察探针试剂对下一步试剂有无影响； 6．观察37℃恒温16小时后，探针试剂是否挥发； 二、实验器材 1．荧光原位杂交仪 2．10ul取样器 3．一次性枪头 4．探针试剂（墨水稀释液） 三、实验步骤 1．10ul定量：利用10ul取样器确定一次性枪头吸液10ul液面所在的刻度位置，经过多次调整杂交仪柱塞泵电机的吸液步数，最终确定电机的吸液步数为1920时，吸液量恰好是10ul。 2．对反应池1运行以下程序步骤以确定实验目的的2.3.4.6项： 3．对反应池2、5运行以下程序步骤以确定实验目的的2.3.5.6项： 四、实验结果 1．本实验3次吸探针试剂量均在10ul刻度线处； 2．本实验3次滴探针试剂时基本没有残留； 3．本实验3次滴探针试剂后盖板均能压紧，目测无缝隙，石蜡完全
浸裹； 4．反应池1、5的上一步试剂均排液排尽，对探针没有其他影响； 5．反应池2因上一步（二甲苯试剂）排液时恰在中间位置残留大约50ul试剂，导致探针试剂压紧后溢出到盖板外1/4-1/3的液量； 6．由于探针试剂用到石蜡覆盖，排液时石蜡不能完成排尽，故而下一步试剂上还会有部分石蜡覆盖，除此之外无其他影响； 7．反应池1、5经过37℃恒温16小时后，探针试剂基本无挥发且成均匀摊开状；反应池2经过37℃恒温16小时后，探针试剂挥发1/2左右（因有溢出）基本成均匀摊开状。 8．盖板掀开后探针试剂表面有石蜡油，一种可能是实验中扩散到盖板内覆盖探针试剂，另一种可能是盖板掀开后扩散探针试剂表面。
硕士学位论文 荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用 Fluorescence in situ hybridization technology and its application in the field of environment 作者姓名： ** 学科、专业：环境科学与工程 学号： ******** 指导教师： *** 完成日期： 2014/3/26 大连理工大学 Dalian University of Technology
大连理工大学硕士学位论文 摘要 荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。利用FISH 技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。并且展望了FISH技术的未来。 关键词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测 - I -
大连理工大学硕士学位论文格式规范 Abstract Fluorescence in situ hybridization （FISH）is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH. Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring - II -
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
对荧光原位杂交技术的认识 摘要:荧光原位杂交技术（FISH）作为分子水平的微生物检测技术，已成为目前首要生物学核酸检测技术，本文主要介绍了FISH的发展及在污水处理中的应用，重点介绍了在硝化细菌方面的应用，并给出了FISH技术存在的缺陷及改进的方法。 Abstract:Fluorescence in situ hybridization (FISH) , as a microbial molecular detection technology, has become the first biology nucleic acid detection technology. This paper introduces the development of FISH and the application in wastewater treatment, and mainly introduces the application in nitrifying bacteria.Further more,it also describes the disvantages in FISH and the improved methods. 关键词：荧光原位杂交技术（FISH），16S rDNA(16S rRNA),污水生物处理荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization）是在同位素原位杂交技术基础上发展起来的非放射性原位杂交方法，起始于20世纪70年代后期。它以16S rDNA(16S rRNA)探针用特殊的核苷酸分子标记然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维素切片上的定性，相对定量分析。有不同细菌的16S rDNA都有其独特序列，利用这些独特的序列制成的探针可以鉴别和跟踪自然样品中的目标细菌。最初FISH技术应用于医疗事业，目前FISH技术的应用范围也来越广，特别是FISH流程的简化完善和检测灵敏度的提高，使FISH成为一种首要的生物学核酸检测技术。 1.FISH的发展历史 1969 年, Pardue【1】等和John【2】两个研究小组开发了原位杂交技术, 用放射性同位素标记的DNA 或28S rRNA 和爪蟾卵细胞制备物进行杂交, 然后进行显微放射自显影检测。这一技术可以在保持细胞形态完整的条件下, 检测出细胞核酸序列, 自此, 原位杂交技术在染色体进化、肿瘤病人和白血病人的染色体分析以及多种细胞遗传学研究方面得到应用。 早期的同位素标记没有专门的标记方法，将随机同位素标记的碱基添加到
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
荧光原位杂交技术及其应用 摘要：荧光原位杂交技术是一种非常有用的分子细胞遗传学工具，特别是对一些染色体数目异常和复杂染色体异常的诊断，架起了染色体显带技术和分子遗传学之间的桥梁。本文主要就荧光原位杂交技术的发展历程、探针制备和临床应用做一简单的综述。 关键词：FISH；荧光原位杂交；临床应用；产前诊断；肿瘤 Fluorescence in situ hybridization and applications SUN Jingjing,YAN Shouqing (College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China) Abstract:FISH is a powerful molecular cytogenetic technique which allows rapid detection of numerical and complex chromosome aberrations on interphase cells and metaphase spreads, bridging the gap between conventional chromosome banding analysis and molecular genetic DNA studies. This review gives a brief overview of the historical developments of FISH techniques and applications in clinic genetic diagnostics. Key words:FISH; Fluorescence in situ hybridization; Clinical applications; Prenatal diagnosis; Tumor DNA荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法[1]。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增,产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。 1 FISH技术的产生 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获得成功之后，Pardue等同年又以小鼠卫星DNA为模板，利用体外合成的含3H 的RNA为探针成功地与中期染色体标本进行了原位杂交，从而开创了RNA-DNA的同位素原位杂交技术[2]，但是没有得到广泛应用。1974年Evans第一次将染色体显带技术和原位杂交技术结合起来，提高了基因定位的准确性。1981年，Langer等首次采用生物素标记的核苷酸探针(bio-dUTP)成功地进行了染色体原位杂交，建立了非放射性原位杂交技术(Nonisotopic in situ hybridization)，至此，以荧光标记的探针在细胞制片上进行基因原位杂交的技术建立起来。1985年这项技术被引进到植物。1986年，Cremer与Licher等分别证实了荧光原位杂交技
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
荧光原位杂交（FISH） 1.样品处理与固定(约4h，可提前准备) （1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min 弃去上清液； （2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液； （4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液； （5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。 2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备） （1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用； （2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆盖样品孔，室温放置10-30min分钟； （3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次； （4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。 3.透化与脱水（约1h） 现配proteinase k buffer：50mL 1M Tris/HCl0.5mL0.5M EDTA1mL 5M NaCl1mL10%SDS 2.5mL dd H2O to50mL pro.k(20mg/mL)25μL （1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘干10分钟； （2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3次，每次1min。 （3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾干。 4.杂交（约2h） （1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖； （2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度
荧光原位杂交实验（FISH） 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。 1实验方法原理： 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。 杂交所用的探针大致可以分类三类：1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-
小麦的起源 小麦源于何处？其祖先是谁？对这类问题很多人都会感到惊异，怎么会想出这类怪问题？小麦不是全世界到处都长吗？其祖先难道不是小麦？看起来这些问题都很简单，但细究起来可有点不那么容易了。下面我们就来看看日本遗传学家木原均（生于1893年10月21日）是如何来探明这些问题的。 1918年，日本科学家坂村彻确定了小麦正确的染色体数，他发现一粒系小麦（Einkorngroup）核内有14条染色体（2n=14），二粒系小麦（Emmergroup）有28条（2n=28），普通系为42条（2n=42）。在坂村彻工作的基础上，木原均选用五倍体开始他的研究。其五倍体是四倍体的波兰小麦（Triticumpolonicum，2n=4x=28）和六倍体的斯卑尔脱小麦（T.spelta，2n=6x=42）的杂交种，染色体数为35，其中14条来自波兰小麦（二粒系），21条来自斯卑尔脱小麦（普通系）。经过研究，木原均提出了“染色体组”的概念，认为在小麦中每个染色体组为7条染色体。 这之后，木原均就不同系的小麦染色体组进行分析，观察其染色体组同源的程度。他建立了一种方法即观察染色体的配对，视配对的完全程度来判定其是否同源。在两个染色体组之间，如果新有的染色体都配对，则两个组完全同源；若完全不配对，则非同源；部分染色体配对，即可判定两个组部分同源。根据这种方法，他判定二倍体（一粒系）、四倍体（二粒系）、六倍体（普通系）的染色体组组成分别为AA、AABB、AABB-DD，此外他还发现四倍体小麦中有一部分种中有新的染色体组G，因此除了先前新知的三个小麦系外，还有第四个系即提莫菲维小麦系（T.timopheevigroup，AAGG）. 至此木原均查明栽培小麦的祖先是些微不足道的野生植物。一个祖先是一粒小麦（T.monococcum，AAGG），另一个是节节麦（Aegilopssquavrosa）；还有一个是拟斯卑尔脱山羊草（Ae.speltoides）或其近似种（BB），先是一粒小麦与拟斯卑个脱山羊草或其近似种杂交，形成一个杂种（AB），因是远缘杂交，杂种不育，但偶然情况下此杂种的染色体加倍成为AABB，繁衍出二粒系，野生的二粒系小麦（AABB）与节节麦（DD）杂交，形成一新杂种（ABD），同样此杂种在偶然条件下染色体加倍，成为AABBDD，此后就繁衍成普通系小麦即今天的栽培小麦。 此后，他又去世界各地考察，查明小麦的发源地是在里海以西的阿塞拜疆及其周围地区，也即是外高加索一带。 纯种高秆抗锈病小麦的基因型应怎样写 1990年版新编高级中学生物课本(必修)第177页，有一小麦杂交育种的复习题。写出高秆(D)抗锈病(T)和矮秆(d)易染锈病(t)的两个亲本小麦的基因型，是解决这一问题的关键。结果有的学生认为：高秆抗锈病小麦的基因型应是DDDDDDTTTTTT，矮杆易染锈病小麦的基因型应是ddddddtttttt。当问到理由时，答曰小麦是六倍体。他们的看法有没有道理呢？只有明白了小麦的进化历程，才能作出明确的回答。 据调查分析，小麦(普通小麦)的祖先是“一粒小麦”(小麦属)，是具有(AA)染色体组的二倍体植物。大约在1万年前，一粒小麦与具有(BB)染色体组的二倍体山羊草(山羊草属)天然杂交，杂种(AB)的染色体又自然加倍，而形成了具有(AABB)染色体组的四倍体二粒小麦。此后，大约在3000年前，四倍体二粒小麦又与山羊草属的另一个种——节节草(它具有DD 染色体组)天然杂交，杂种后代又获得了染色体自然加倍的机会，就形成了具有(AABBDD)染色体组的六倍体小麦。由于染色体来源于不同的属，所以叫做异源六倍体。尽管每个染色