GB/T 4789.2-2008 菌落总数检验培养基
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ ，30 ℃±1 ℃ 。
3.2 冰箱：2 ℃~5 ℃ 。
3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃ 。
3.4 天平：感量0.1g 。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具o.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL 、500 mL 。
3.9 无菌培养皿：直径90 mm 。
3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3.11 放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM1）自动判读仪。
4 培养基和试剂
4.1 平板计数琼脂培养基
4.2 磷酸盐缓冲液
4.3 无菌生理盐水：称取8.59 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min 。
4.4 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中。
4.5 1 mol/L 盐酸（HCl ) ：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL 。
4.6 PetrifilmTM 菌落总数测试片和压板。
设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ ，30 ℃±1 ℃ 。
3.2 冰箱：2 ℃~5 ℃ 。
3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃ 。
3.4 天平：感量0.1g 。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具o.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL 、500 mL 。
3.9 无菌培养皿：直径90 mm 。
3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3.11 放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM1）自动判读仪。
4 培养基和试剂
4.1 平板计数琼脂培养基
4.2 磷酸盐缓冲液
4.3 无菌生理盐水：称取8.59 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min 。
4.4 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中。
4.5 1 mol/L 盐酸（HCl ) ：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL 。
4.6 PetrifilmTM 菌落总数测试片和压板
第一法平板菌落计数法
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，5 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min ，制成1：10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 ：10 的样品匀液。
6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1： 10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。
6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1 mL 无菌吸管或
吸头。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。
6.1.6 及时将15 mL~20 mL 冷却至46 ℃ 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃ 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
6.2 培养
6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃ 培养48h±2h 。水产品30 ℃±1 ℃ 培养72h±3h.
6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ) ，凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。
6.3 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony - forming units , CFU ）表示。
6.3.1 选取菌落数在30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。
6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
7 结果的表述
7.1 菌落总数的计算方法
7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。
7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l ）计算：
N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1 )
式中：
N ― 样品中菌落数；
∑C ― 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
nl ― 第一个适宜稀释度平板上的菌落数；
n2 ― 第二个适宜稀释度平板上的菌落数；
d ― 稀释因子（第一稀释度）。
7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 ，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。
7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300 之间，其中一部分小于30 或大于300 时，则以最接近30 或300 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
7.2 菌落总数的报告
7.2.1 菌落数在100 以内时，按“四舍五人”原则修约，采用两位有效数字报告。
7.2.2 大于或等于100 时，第三位数字采用“四舍五人”原则修约后，取前两位数字，后面用0代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五人”原则修约后，采用两位有效数字。
7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
第二法菌落总数Petrifilm TM测试片法
8 检验程序
除将平板计数琼脂培养基改成PetrifilmTM 菌落总数测试片外，其他与第5 章相同。
9 操作步骤
9.1 样品的稀释
按照6.1.1~6.1.2 制备1:10 的样品匀液后，用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸( HCL ）调节pH 至6.6~7.2 。
9.2 接种
根据对样本污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液进行检验。将测试片置于平坦实验台表面，揭开上层膜，用吸管或微量移液器吸取1 mL 样品匀液，垂直滴加在测试片的中央，将上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上层膜，将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养膜上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。每个稀释度
接种两张测试片。
9.3 培养
将测试片的透明面朝上，水平置于培养箱内。可堆叠至20 片，培养温度和时间同6.2 。
9.4 计数
9.4.1 培养结束后立即计数，可肉眼观察计数，或用菌落计数器、放大镜、PetrifilmTM 自动判读仪计数。选取菌落数在30 ~300 之间的测试片计数。
9.4.2 计数所有红色菌落。细菌浓度很高时，整个测试片会变成红色或粉红色，将结果记录为“多不可计”。
9.4.3 有时，当细菌浓度很高时，测试片中央没有可见菌落，但圆形培养膜的边缘有许多小的菌落，其结果也记录为“多不可计”；进一步稀释样品可获得准确的读数。
9.4.4 某些微生物会液化凝胶，造成局部扩散或菌落模糊的现象。如果液化现象干扰计数，可以计数未液化的面积来估算菌落数。
10 结果的表述
食品中菌落总数的测定 一、实验目的 （1）学习和掌握测定食品中菌落总数的基本方法 （2）学会菌落总数的报告方式 二、实验材料 1、仪器与设备：恒温培养箱、托盘天平、电炉、吸管、三角瓶、平皿、试管、试管架、酒精灯、灭菌刀或剪刀、75%酒精棉球、玻璃蜡笔。 2、培养基和试剂：75%乙醇、0.85%生理盐水、琼脂培养基：胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、 琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.0±0.2 3、检样：利乐包装鲜牛奶250ml 三、实验方法与步骤 1、检验程序 菌落总数检验程序： 检样→做成几个适当倍数的稀释液→选择2-3个适宜稀释度各以1ml之量分别入灭菌平皿内→每皿内加入46℃15-20ml营养琼脂→置36±1℃恒温箱内培养（48±2）h取出→菌落数→报告 2、检样稀释及培养 （1）以无菌操作，将检样包装打开，用吸管取25ml鲜牛奶，放于含有225ml灭菌生理盐水的500ml灭菌玻璃三角瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠），经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。 （2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。 （3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。 （4）根据食品卫生检验标准要求和检样的菌落数量，选择3个连续适宜稀释度即10、10－1、10－2，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿15ml~20mL，并转动平皿使与稀释检样混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 （6）等琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1mL样品所含菌落总数。 四、检样中细菌菌落总数的计算与报告 1、菌落计算方法 （1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300 CFU之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数， ②稀释度的选择 应选择平均菌落数在30～300 CFU之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，按以下公式计算：
菌落总数的测定 基础知识： 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每g（mL）检测样品所生长出来的细菌菌落总数。由于厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际其中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生长过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。中国国家标准是国内常用的检验方法。 菌落总数测定的卫生学意义： 食品本身的新鲜程度 加工、贮存运输过程中是否受到污染 卫生学指标：食品中菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全 面的评价。 细菌在平板计数琼脂上的菌落特征蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征方法来源：
GB 4789.2-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 1、范围 本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。 本标准适用于食品中菌落总数的测定。 2、术语和定义 菌落总数aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 3、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃~5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 无菌袋。 3.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。 3.7 无菌培养皿：直径90mm。 3.8 放大镜或/和菌落计数器。 4、培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 按照称取23.5g培养基溶于1000mL蒸馏水的比例进行配置，分装到锥形瓶，121℃高压灭菌15min。 4.2 0.85%无菌生理盐水 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水。一般用1000mL锥形瓶配置，称取6.8g的氯化钠，加入800mL蒸馏水，121℃高压灭菌15min。
【说明】蛋糕具有松软香甜，携带方便、食用简单等特点，因此成为人们居家生活特别是旅途中不可或缺的一种美食，深受人们的喜爱。测定蛋糕中的菌落总数可以用来判定其被微生物污染的程度及卫生质量，它反映蛋糕在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着蛋糕产品质量的优劣，因此，测定蛋糕中的菌落总数具有重要意义。目前应用于测定食品中菌落总数的方法有: 纸片法、电阻抗法等。本实验采用国标法(GB\T 对独立包装小蛋糕中菌落总数进行测定。并与GB 7099-2003糕点、面包卫生标准中规定的冷加工糕点中菌落总数≤10000（cfu/g）的数据对比初步判断样品是否符合卫生要求。 一、实验目的 1、学习并掌握测定蛋糕中菌落总数的方法及原理。 2、通过对比实验验证冷藏对蛋糕的保鲜及抑菌作用。 3、了解菌落总数测定在食品卫生学评价中的意义。 二、实验原理 菌落总数即为食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法。细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、实验设备与材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1℃，30℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。
微生物学检验菌落总数的测定 1 原理 微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列 不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。 2 材料和仪器 2.1 平皿：φ90mm 。 2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。 2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.4 灭菌锅。 2.5 恒温培养箱 2.6 涂棒。 2.7 酒精灯。 2.8 超净工作台。 2.9 磁力搅拌器。 2.10 漩涡振荡器 3 检验程序 菌落总数的检验程序见下图。 方法①↙ ↘方法② ↘ ↙
4 操作步骤 4.1 培养基和试剂的配制 4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用） 牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20g 蒸馏水1L pH 7.0～7.2 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。 4.1.2 无菌生理盐水的配制： 称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。 4.2 样品的稀释： 4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装 数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。 4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀 释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。 4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL 无菌吸管或吸头。 4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。 4.2 平板接种与培养 接种方法1： 用1mL无菌吸管或微量移液器分别吸取不同稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中（每个稀释度做三个重复），再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45~50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-8，10-9，10-10。 接种方法2： 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取0.2ｍＬ稀释液均液于计数培养基平板上，将稀释液涂布均匀，吸附，在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。（计算时需要把0.2mL的倍数也计算在稀释倍数内） 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-7，10-8，10-9。 ４.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时借用放大镜或菌落计数器，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示 4.3.1 选取菌落数在30~300之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平行平板的平均数。
菌落总数检验步骤 第一法平板菌落计数法 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，5 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min ，制成1：10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 ：10 的样品匀液。6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。 6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1 mL 无菌吸管或吸头。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。 6.1.6 及时将15 mL~20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 6.2 培养 6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48h±2h 。水产品30 ℃±1 ℃培养72h±3h. 6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ) ，凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。 6.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony - forming units , CFU ）表示。 6.3.1 选取菌落数在30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 7 结果的表述 7.1 菌落总数的计算方法 7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。 7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l ）计算： N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1 ) 式中： N ― 样品中菌落数； ∑C ― 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； nl ― 第一个适宜稀释度平板上的菌落数； n2 ― 第二个适宜稀释度平板上的菌落数；
（三）计数和报告 1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。 3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。 4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。 5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。 6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。
食品中细菌总数和菌落总数是怎么样测定的？ 满意答案 ㄨ蓶羙╰菰° 9级 2009-11-02 一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。国内外菌落总数测定方法基本一致，从检样处理、稀释、倾注平皿到计数报告无何明显不同，只是在某些具体要求方面稍有差别，如有的国家在样品稀释和倾注培养进，对吸管内液体的流速，稀释液的振荡幅度、时间和次数以及放置时间等均作了比较具体的规定。检验方法参见：GB4789.2-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》SN0168-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品菌落计数》三、说明（一）样品的处理和稀释：1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。2．无菌操作：操作中
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。 所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。 (三)实验器材 (1) 菌落总数的测定： 1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 牛肉膏3.0 g 蛋白胨10.0g NaCl 5.0g 水1000mL pH7.4～7.6 将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后到入烧杯。也可放在称量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。在上述烧杯中先假如少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加入琼脂，再在石棉上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达7.6。反之，用1mol/LHCL 进行调节。 无菌生理盐水：需用生理盐水浓度是0.9%：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100毫升。 2)器材试剂：牛肉膏蛋白胨 NaCl 1moL/LNaOH 1moL/LHCL 灭菌水高压蒸气灭菌锅培养皿三角烧瓶带玻璃塞瓶天平试管牛角匙pH试纸（pH5.5-9.0）棉花记号笔纱布吸管麻绳牛皮纸量筒玻璃棒电热炉称量杯灭菌三角瓶灭菌的具塞三角瓶灭菌平皿灭菌吸管灭菌试管
GB/T 4789.2-2008 菌落总数检验培养基 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ ，30 ℃±1 ℃ 。 3.2 冰箱：2 ℃~5 ℃ 。 3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃ 。 3.4 天平：感量0.1g 。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具o.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL 、500 mL 。 3.9 无菌培养皿：直径90 mm 。 3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3.11 放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM1）自动判读仪。 4 培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 4.2 磷酸盐缓冲液 4.3 无菌生理盐水：称取8.59 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min 。 4.4 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中。 4.5 1 mol/L 盐酸（HCl ) ：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL 。 4.6 PetrifilmTM 菌落总数测试片和压板。 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ ，30 ℃±1 ℃ 。 3.2 冰箱：2 ℃~5 ℃ 。 3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃ 。
3.4 天平：感量0.1g 。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。 3.7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具o.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL 、500 mL 。 3.9 无菌培养皿：直径90 mm 。 3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 3.11 放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM1）自动判读仪。 4 培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 4.2 磷酸盐缓冲液 4.3 无菌生理盐水：称取8.59 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min 。 4.4 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中。 4.5 1 mol/L 盐酸（HCl ) ：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL 。 4.6 PetrifilmTM 菌落总数测试片和压板 第一法平板菌落计数法 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，5 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min ，制成1：10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 ：10 的样品匀液。 6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1： 10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。 6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1 mL 无菌吸管或
检验报告 实验名称：菌落总数的检验 实验方法：平板计数法 商品名称：夸夸唔、有友、奇爽、乐棒棒、香猪脆、香脆肚。 参照标准：GB4789-17 2011 总负责人：熊经理 检验人员:徐恒琴、崔艳霞、游惠 检验时间： 2011年7月26—8月6号
2011年8月8日 菌落总数的检测 平板计数法 一、实验目的 为了进一步了解与熟悉我们产品的操作规范和关键点的控制，掌握菌落总数的检验方法和了解超净工作台的操作规范。 二、实验仪器设备和所需试剂及试剂的配制。 1、实验仪器及设备 杀菌锅YXQ—LS—SU 编号5090、无菌超净工作台SW—CJ—IC 编号24、JJ-Z型组织捣碎机、隔水或智能恒温培养箱GHP—9080、出厂编号13475、烘箱ZFD—5040(全自动型鼓风干燥箱）、蒸馏水制备机、灭菌过的250ml锥形瓶、1ml吸量管、10ml的吸量管、酒精灯、锥形瓶1000ml、培养皿、电子天平AL104、电磁炉、锅、锅铲、PH试纸、恒温水浴锅HH —4 出厂标号160.53。 2、试验试剂及配制 2.1主要试剂：琼脂、无菌生理盐水、无菌水、75%的酒精、1moL/L 氢氧化钠、1moL/L的盐酸。 2.2药品试剂 2.21琼脂：准确称取12.5g胰蛋白胨、酵母浸膏7.5g、葡萄糖 3.0g、琼脂37.5g、蒸馏水2500ml，加入至锅中煮沸溶解，先加入琼脂将其熬化，在加入其它样品，直至样品熬化即可关掉火，冷却后调解PH值（7.0左
右即可）。酸性用氢氧化钠调节、碱性用盐酸进行调节，将在1200C高压灭菌15min即可。 2.22无菌生理盐水：准确称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中。 2.23无菌水：吸取1000ml的蒸馏水，将在1200C高压灭菌15min即可。 2.24 1moL/L氢氧化钠：称取40g的氢氧化钠溶于1000ml的蒸馏水中在1200C高压灭菌15min即可。 2.45 75%的酒精：分别吸取400ml的95%的无水乙醇和100ml的蒸馏水与500ml的容量瓶中。 2.46 1moL/LDE 盐酸：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml，在1200C高压灭菌15min即可。 三．试验步骤 1 、样品的稀释 1.1固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 ml 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 ml样品置盛有225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。36 ℃〒1 ℃ 48 h〒2 h. 2、检样与接种：25 g(ml)样品+225 ml稀释液，均质，10 倍系列稀释选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 ml 分别加入
山西梁汾醋业有限公司 文件类别及编号：LF-GC-01 版次共页第页 菌落总数测定的标准操作规程 1. 目的 规范山西老陈醋菌落总数测定的操作规程，保证山西老陈醋产品的质量。 2. 适用范围 酿造食醋和配制食醋菌落总数的测定。 3. 仪器设备 恒温培养箱，冰箱，恒温水浴箱，天平（0.1g）,均质器，振荡器；无菌吸管1ml(0.01刻度)、10ml(0.1ml刻度)或微量移液器及吸头；无菌锥型瓶，250ml/500ml; 无菌培养皿：直径90mm；PH计或精密PH试纸；放大镜或菌落计数器 4.培养基和试剂 4.1平板计数琼脂培养基， 成分： 胰蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 2.5g 葡萄糖 1.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000ml PH7.0±0.2 制法：将上述加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节PH。分装试管或锥型瓶，121℃高压灭菌15min。 4.2磷酸盐缓冲液
成分： 磷酸二氢钾（KH 2PO 4 ） 34.0g 蒸馏水500ml PH 7.2 制法： 贮存液：称取34.0g磷酸二氢钾溶于500ml蒸馏水中，用大约175ml的1mol/L 氢氧化钠溶液调节PH,蒸馏水稀释至1000ml存于冰箱。 稀释液：取贮存液1.25ml,用蒸馏水稀释至1000ml,分装于适宜容器中，121摄氏度高压灭菌15分钟。 4.3无菌生理盐水 成分： 氯化钠8.5g 蒸馏水1000ml 制法：8.5克氯化钠溶于100ml蒸馏水中121摄氏度高压灭菌15分钟。 5 检验程序
6操作步骤 6.1样品的稀释 6.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1min～2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。 6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）
菌落总数的测定 (GB 4789.2—2010) 一、目的 1、学习并掌握食品中菌落总数测定方法和原理。 2 、了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。 二、原理 细菌数量的表示方法由于所采用的计数方法不同而有两种：菌落总数和细菌总数。 1、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。以CFU/g（mL）来表示。一定条件包括培养基成分、培养温度和时间、pH、是否需要氧气等。 按国家标准方法规定，即在需氧情况下，36 ±1℃培养48±2 h，能在平板计数琼脂上生长发育的细菌菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。 菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 2 菌落总数测定的卫生学意义 （1）菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 （2）食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全面的评价。 3、细菌总数 指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1 g或1 mL样品中的细菌总数来表示。 三、材料 1、食品检样 2、培养基平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 3、其它无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培养箱等。 四、流程 1、检样 2、做几个适当倍数的稀释液 3、选择2~3个适宜稀释度各1 mL,分别加入灭菌平皿内 4、平皿内倾注15～20 mL琼脂培养基，混匀 5、36 ±1℃培养48±2小时或（24±2）小时 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量 7、计算菌落总数→报告 五、步骤 (一) 取样、稀释和培养 1、以无菌操作取检样25g（mL），放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1～2min，制成1:10的均匀稀释液。 2、用1 mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内，振摇试管或反复吹打混合均匀，制成1:100的稀释液。 3 、另取1 mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1 mL吸管 4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。同时分别取1ml稀释液（不含样品）加入两个灭菌平皿内作空白对照。 5 、稀释液移入平皿后，将冷却至46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平皿，混合均匀。 6、待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，水产品30±1℃温箱内培养72±3h。如样