动 物 学 研 究 1997,18(2):221—227CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Z oological Research
随机扩增多态D NA影响因素的研究3
陈永久 张亚平33
(中国科学院昆明动物研究所细胞与分子进化开放研究实验室 昆明 650223)
摘要 随机扩增多态DNA(RAPD)分析受诸多因素的影响,我们发现不同厂家制造的PCR扩增仪,不同厂家出品的TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液,RAPD反应体
系中的引物浓度,Mg2+浓度,dN TP浓度,BSA(牛血清白蛋白)和明胶,以及模板
DNA的量等均可能对RAPD结果有不同程度的影响。为了使RAPD结果在不同实验
室间具有重复性和可比性,提高RAPD数据的科学价值,我们建议在RAPD分析过
程和文章写作中应规范化。方法部分,除一般写明的引物浓度、TaqDNA聚合酶单位
数、dN TP浓度、每一次PCR反应的循环条件和循环数等外,还应注明PCR仪的制
造厂家及型号、TaqDNA聚合酶生产厂家、PCR缓冲液的成分、Mg2+浓度,模板
DNA浓度等。
关键词 RAPD,影响因素,规范化
RAPD(random amplified polymorphic DNA)技术是1990年由Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。RAPD是一种以10bp左右的短寡核苷酸为引物的PCR反应,这些引物所含的G+C含量一般为50%—70%,在一定的退火条件下能与基因组DNA中互补顺序配对,启动DNA的合成(Williams等,1990;Welsh 等,1991)。与RFL P相比,RAPD具有以下优越性:①RAPD不需要使用同位素;②无需知道受试材料基因组DNA序列的信息;③绝大多数RAPD标记遵从孟德尔遗传;④操作过程简便,快速等。
RAPD技术已被广泛应用于动植物的遗传作图,遗传多样性,以及分类与进化等方面的研究,成为检测DNA多态性的有效遗传标记(王文等,1994;张忠廷等,1994;Tigst 等,1994)。通常的RAPD扩增条件是:94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸2 min,每个反应包括40个循环,以及94℃预变性200s,,72℃最后延伸300s(Williams 等,1990;Welsh等,1991)。Williams和Welsh曾指出影响RAPD的一些因素,主要是PCR反应的温度、离子强度及随机引物的长短等。国内外不少学者也对RAPD的退火温度和引物长短对扩增效果的影响作过讨论,确定退火温度的高低直接影响RAPD的结果,且主要表现为RAPD标记的弱带数目的增减,明带与弱带交叉出现(Williams等,1990;Welsh等,1991;张忠廷等,1994)。Caetano-Anolles等使用
*国家杰出青年人才科学基金、国家自然科学基金、王宽诚基金、云南省应用基础研究基金和留学回国人员基金资助
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本文1996年1月8日收到,同年12月13日修回
222动 物 学 研 究18卷
10bp以下的随机引物(>5bp),得到了很好的RAPD扩增效果,并称此技术为DAF (DNA amplification fingerprinting)(Caetano-Anolles等,1991)。然而,RAPD的发展历史毕竟较短,很大程度上这项技术还有待于继续完善。由于影响RAPD的因素较多, RAPD结果在不同实验室间的重复性和可比性一直困扰着研究者们,也给该技术的应用带来不便。这主要是不同实验室在RAPD的操作过程和文章写作中未能标准化的结果。我们对国内近两年发表的有关RAPD分析文章的调查表明,几乎所有的文章在方法中仅写明部分可能影响RAPD的因素,一般未注明TaqDNA聚合酶来源、PCR缓冲系统的成分、PCR扩增仪生产厂家、模板DNA的浓度等,似乎对这些因素有不同程度的忽视。本文拟研究上述易为研究者忽略的因素对RAPD结果的影响,以促进RAPD分析向标准化发展。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验分别采用懒猴和冬虫夏草作为RAPD分析的材料来源,基因组DNA的提取方式为:懒猴用蛋白酶K法(王文等,1994),冬虫夏草用CTAB法(Jeffrey等,1991),提取的总DNA均经苯酚,1∶1的苯酚和氯仿(氯仿异∶戊醇=24∶1)混合液以及氯仿(氯仿异∶戊醇=24∶1)分别抽提12—24h,取上清液加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后用适量的TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,p H8.0,1mmol/L ED TA)溶解,保存于4℃备用。
1.2 PCR参数的选择
在研究中,RAPD扩增的基本条件是:PCR反应体积为10μl,其中包括10mmol/L Tris-HCl,p H9.0,50mmol/L KCl,2.5mmol/L M gCl2,0.1mmol/L的每种dN TP, 0.001%明胶或4mg/ml的BSA,0.2μmol/L引物,25ng的基因组DNA,1U Taq DNA聚合酶(华美生物工程公司出品),反应混合物用20μl石蜡油覆盖。每个反应为40个循环,每个循环包括94℃变性60s,36℃退火60s,72℃延伸120s。首次循环前先在94℃预变性200s,最后一次循环后在72℃延伸300s,并且每次PCR反应均设置不含DNA模板的空白对照。
我们每次仅改变1个PCR参数,并保持其他条件不变,以确定该参数对RAPD结果的影响。我们研究的参数包括以下一些:
1. 2.1 不同公司生产的PCR扩增仪(军事医学科学院北京新技术研究所研制的1109型PCR扩增仪和美国STRA T GEN E公司制造的Robocycler Gradient40型PCR扩增仪)。
1. 2.2 不同厂家(华美生物工程公司和北京医科大学免疫室)生产的TaqDNA聚合酶。
1. 2.3 模板DNA浓度。模板DNA样品经倍比稀释,分成4组。观察不同模板DNA 的量对RAPD结果的影响情况。
1. 2.4 缓冲系统(包括Mg2+浓度,dN TP浓度,BSA和明胶等)。
1.3 RAPD产物的检测
RAPD产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离,溴化乙锭染色后在STRA TA GEN EEa2 gleEyesⅡ自动成像仪成像。
2 结果和讨论
RAPD 技术发明以来,广泛应用于动物,植物,微生物等各个领域遗传多样性研究,基因作图,家畜的品系鉴定及物种的进化研究。尽管RAPD 技术有许多其他分子生物学技术无法比拟的优点,但在一定程度上还有待于进一步完善。目前发现影响RAPD 结果的因素很多,主要有:引物的长短、引物的G %+C %的含量、参加反应的引物浓度、TaqDNA 聚合酶的来源及用量、PCR 扩增仪的厂家与性能、PCR 反应的变性、退火和延伸的温度与时间、缓冲液的组成(Mg 2+浓度,是否加BSA 与明胶,dN TP 的浓度等)、模板DNA 的量等。通常在做RAPD 时,引物的长短,G %+C %的含量,引物的量,TaqD 2NA 聚合酶的用量及PCR 反应的变性,退火和延伸温度与时间均受到人们的重视,在RAPD 操作过程中通常也是恒定的,而其中TaqDNA 聚合酶的来源,PCR 扩增仪的生产厂家与性能,缓冲液的组成(Mg 2+的浓度,dN TP 浓度,是否加BSA 与明胶等)以及参加PCR 反应的模板的量,这些因素往往被人们所忽视。下面我们对容易被人们忽视的,但又对RAPD 结果产生影响的几个因素进行探讨。
2.1 我们分别使用军事医学科学院北京新技术应用研究所研制的1109型PCR 扩增仪和美国STRA TA GEN E 公司制造的Robocycler Gradient40型RCR 扩增仪对懒猴和冬虫夏草DNA 样本进行RAPD 扩增,在其它反应条件均相同的情况下,获得的RAPD 结果有差异,表现为一些弱带的增减,但差异不很显著。因为不同厂家生产的PCR 扩增仪在性能上有些不同,而导致RAPD 扩增结果的差异。
2.2 我们用华美生物工程公司生产的TaqDNA 聚合酶及配套的缓冲液和北京医科大学免疫室生产的TaqDNA 聚合酶及配套的缓冲液在使用酶的单位数分别为1U 和0.5U ,并且控制其他PCR 反应条件均相同的情况下,都用美国STRA TA GEN E 公司制造的PCR 仪进行随机扩增。观察不同厂家生产的TaqDNA 聚合酶和不同酶的量是否对RAPD 结果产生影响。图1列出扩增的结果,从懒猴和冬虫夏草扩增的RAPD 谱带看,上述两个厂家生产的TaqDNA 聚合酶扩增的RAPD 结果有些差异,有的表现在片段的分子量大小,也有的是扩增的片段数目多少不一;同时,不同TaqDNA 聚合酶的量扩增的RAPD 结果也有差异,使用1U TaqDNA 聚合酶扩增的谱带明显比使用0.5U TaqDNA 聚合酶扩增的谱带多。这说明:(1)不同产家从不同的菌株上分离的TaqDNA 聚合酶可能在性能上有些差异,从而导致扩增结果的差异;(2)TaqDNA 聚合酶的量引起扩增结果的差异,可能与RAPD 反应的随机扩增有关。
2.3 我们将懒猴和冬虫夏草的模板DNA 稀释成4个不同的梯度,即参加PCR 反应的模板DNA 浓度分别为1.25ng 、5ng 、20ng 、80ng 。在美国STRA TA GEN E 公司生产的Robocycler Gradient40型PCR 仪上,分别用华美生物工程公司生产的TaqDNA 聚合酶进行随机扩增。图2显示了OPF06和OPG05扩增的RAPD 结果。从图中看出,模板DNA 的量对RAPD 结果有影响,模板DNA 的量多于25ng ,扩增的RAPD 谱带反而会变少。我们认为引起这种现象的主要原因可能是由于随机引物与不同浓度的模板DNA 结合的有所不同。
3222期陈永久等:随机扩增多态DNA 影响因素的研究
图1 为OPG 05引物扩增的RAPD
结果
Fig.1 The RAPD results produced by OPG 05
1—4为冬虫夏草DNA 扩增的RAPD 产物;5—8为懒猴DNA 扩增的RAPD 产物;1、5和2、6分别为1.0U 和0.5U 华美生物工程公司生产的TaqDNA 聚合酶扩增的RAPD 产物;3、7和4、8
分别为1.0U 和0.5U 北京医科大学免疫室生产的TaqDNA 聚合酶扩增的RAPD 产物;M 为λDNA -Hin d Ⅲ/Eco R Ⅰ。
No 1-4are the products amplified by winter worm ,summer grass template DNA.No 5-8are products amplified by slow lorris template DNA.Among those ,No l ,5and No 2,6are the products of 1.0U and 0.5U TaqDNA polymerase produced by Institute of Immunity ,Beijing Medical University respectively.No 3,7and No 4,8are the products of 1.0U and 0.5U Tap DNA polymerase produced by SABC respectively.M is λDNA -Hin d Ⅲ/Eco R Ⅰ.
图2 不同浓度的模板DNA 在OPF06和OPG 05两个随机引物扩增的RAPD 结果
Fig.2 The RAPD results of different concentrations of template
DNA produced by OPF06and OPG 05
(a )为OPF06扩增的RAPD 产物; (b )为OPG 05扩增的RAPD 产物。1—4为模板浓度分别为1.25、5、20、80ng 的冬虫夏草DNA 扩增的RAPD 产物;5—8为模板浓度分别为1.25、5、20、80ng 的懒猴DNA 扩增的RAPD 产物;M 为λDNA -Hin d Ⅲ/Eco R Ⅰ。
(a )is amplified by OPG 05; (b )is produced by OPF06.No 1-4are the products amplified by 1.25,5,20,and 80ng of winter worm.summer grass template DNA respectively ;No 5-8are the products amplified by 1.25,5,20,and 80ng slow lorris template DNA.M is λDNA -Hin d Ⅲ/Eco R Ⅰ。
2.4 我们通过以下方法改变缓冲系统的成分,观察它们对RAPD 结果的影响情况。①422动 物 学 研 究18卷
在RAPD 反应体系中分别使用1.5mmol/L 和2.5mmol/L 的Mg 2+的浓度;②分别加入2mg/mlBSA (牛血清白蛋白)和0.001%明胶等TaqDNA 聚合酶稳定剂;③分别使用0.05mmol/L 或0.1mmol/L 的dN TP 。图3显示了扩增的RAPD
结果。RAPD 反应体系中使用1.5mmol/LMg 2+和0.05mmol/LdN TP 缓冲液,扩增的RAPD 谱带明显少于使用
2.5mmol/LMg 2+和0.1mmol/LdN TP 缓冲液扩增的RAPD 谱带数,表现为明带成弱带或消失,弱带则消失;RAPD 反应体系中若同时加入2mg/ml 和0.001%BSA 和明胶,或只加入其中的任何一种,或不加BSA 和明胶,均可得到RAPD 产物,但得到的RAPD 谱带差异很大,同时加入BSA 和明胶时,RAPD 片段数明显增加,不加BSA 和明胶扩增的片段数明显减少,甚至不扩增。只加BSA 或只加明胶扩增的效果基本一致。以上结果说明在RAPD 反应中,使用2.5mmol/LMg 2+,0.1mmol/LdN TP ,2mg/ml 的BSA 和0.001%的明胶RAPD 扩增的效果较好。其中BSA 和明胶的作用基本相同,我们建议在RAPD 反应中只加一种。
图3 不同浓度的Mg 2+、dN TP 及加入BSA 和明胶条件下,OPF06扩增的RAPD 产物
Fig.3 The RAPD results of different concentration of Mg 2+,dN TP
and jioning BSA and gentin amplified by OPF06
(a )为不同浓度的Mg 2+,dN TP 扩增的RAPD 产物。1—4为懒猴DNA 扩增的RAPD 产物;5—8为冬虫夏草DNA 扩
增的RAPD 产物;其中1,5为1.5mmol/L 的Mg 2+;2,6为2.5mmol/L 的Mg 2+;3,7为0.05mmol/L 的dN TP ;4,8为0.1mmol/L 的dN TP ;
(b )为加入BSA (牛血清白蛋白)和明胶扩增的RAPD 产物;1—4为冬虫夏草DNA 扩增的RAPD 产物;5—8为懒猴
DNA 扩增的RAPD 产物。其中1,5没加BSA 和明胶;2,6只加入0.01%明胶;3,7只加入2mg/ml BSA ;4,8同时加入2mg/ml BSA 和0.01%明胶。M 为λDNA -Hin d Ⅲ/Eoc R Ⅰ。
(a )is products of jioning Mg 2+and dN TP ,No 1-4are the products amplified by slow lorris template DNA ;No 5-8are prod 2
ucts amplificd by winter worm.summer grass template DNA.Among those ,No 1,5by 1.5mmol/L Mg 2+;No 2,6by
2.5mmol/L Mg 2+;No 3,7by 0.05mmol/L dN TP ;No 4,8by 0.1mmol/L dN TP ;
(b )is products of jioning BSA and gentin.No 1-4are the products amplified by winter worm.summer grass template DNA ;No
5-8are products amplified by slow lorris template DNA.No 1,5by jioning neither BSA nor gentin ;No 2,6by jioning 0.001%gentin.No 3,7jioning 2mg/ml BSA ,No 4,8by jioning both 2mg/ml BSA and 0.001%gentin.M is λDNA -Hin d Ⅲ/Eco R Ⅰ.
尽管影响RAPD 的因素很多,但只要条件稳定,其结果具有重复性。因此RAPD 技5222期陈永久等:随机扩增多态DNA 影响因素的研究
622动 物 学 研 究18卷
术本身是稳定的。由于RAPD的发展历史较短,我们国内的一些实验室在从事RAPD研究工作时,可能对影响RAPD结果的某些因素重视不够,因此不同实验室的工作缺乏重复性和可比性,造成RAPD没能充分发挥其应有的科学价值。我们对1993年和1994年发表于中国科学、科学通报、遗传和遗传学报上有关RAPD方面的文章做了一次统计,总共14篇,其中注明PCR仪生产厂家及型号的有5篇,注明引物的生产厂家有11篇,注明TaqDNA生产厂家的有5篇,注明PCR反应条件的有13篇,注明PCR缓冲液成分的有10篇,注明反应系统中引物浓度、TaqDNA聚合酶单位数、dN TP浓度的各有11篇,注明参加反应Mg2+浓度的有9篇,注明是否加入明胶或BSA(牛血清白蛋白)及加入量的有6篇,注明PCR反应模板量的有10篇。几乎没有一篇文章注明所有可能影响RAPD 的因素。从以上的统计数据中可以看出,通常为大家忽视的是PCR扩增仪的厂家和型号、TaqDNA聚合酶的来源等。如果一篇RAPD分析的文章不注明以上这些可能影响RAPD 的因素,那么不同实验室之间很难获得重复性的结果。为了使不同实验室之间的RAPD 结果有重复性和可比性,因此我们建议:当我们在分析RAPD结果时,一定要详细地注明扩增RAPD的PCR仪的厂家和型号;TaqDNA聚合酶厂家和用量;PCR缓冲液生产厂家,包含那些组分;使用的Mg2+浓度;引物的长度;G%+C%含量以及浓度;dN TP的浓度。注明加BSA还是加明胶作为TaqDNA聚合酶的稳定剂;模板DNA的浓度以及RAPD反应的变性、退火和延伸的时间与温度等。以便使RAPD分析具有更好的稳定性, RAPD数据在不同的实验室间具有良好的可比性。
致谢 本文得到中国科学院昆明动物研究所细胞与分子进化开放研究实验室刘爱华教授、林世英老师、苟世康老师、王文、聂龙、宿兵、丁波和朱春玲同志的热情帮助,在此一并致谢。
参 考 文 献
王 文,兰 宏,宿 兵等,1994.云南4个少数民族的随机扩增多态DNA分析.科学通报,39:1900—1903.
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STU DIES ON FACT ORS IN RAN DOM AMPL IFIE D
POLYMORPHIC D NA ANALYSIS
Chen Y ongjiu Zhang Yaping
(L aboratory of Cellular and Molecular Evolution ,Kunming Instit ute of
Zoology ,The Chinese Academy of Sciences ,Kunming 650223)
Abstract
In this paper ,we studied factors which may affect the results of random amplified polymorphic DNA.We found that different PCR am plifier ,TaqDNA polymerase ,and concentration of Mg 2+,dN TP ,BSA ,gentin ,and template DNA may result in different RAPD results.To make the RAPD data more repeative and comparitive ,we recommand that those factors should be clearly stated in all the paper.
K ey words RAPD ,Affected facters ,Standardization
获奖项目介绍
“猕猴属的分子进化研究”获云南省自然科学一等奖
该项目在国家自然科学基金的资助下,率先在国内采用线粒体DNA (mt DNA )限制性片断长度多态(RFL P )分析等先进手段,开展灵长类分子系统学、分子生态学和衰老生物学等方面的研究。开创性地确定了社会结构对基因进化的影响;第一次在分子水平构建了猕猴属8个种23个地理群体的系统树,理清了分类和系统中的一些关键和疑难问题,为进一步综合研究灵长类的分类、起源和进化提供了宝贵的基础性资料。并提出了我国恒河猴的辐射是由西南向东,共有3条路线等一些全新的观点;首次发现在衰老过程中,脑mtDNA 序列无明显变化;同时还改进了mtDNA 的研究方法。共发表研究论文14篇,其中国际核心期刊2篇,国际会议论文4篇,国际专著论文1篇,国内核心期刊4篇。
该项成果侧重于基础理论研究,但在应用上也有一定的意义,该项工作为猕猴这一重要的实验动物提供了丰富的遗传背景资料。
杨若云
(中国科学院昆明动物研究所计划处 650223) 7
222期陈永久等:随机扩增多态DNA 影响因素的研究
肠炎沙门菌随机扩增多态性DNA分子分型(一) 【关键词】肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型 摘要：目的对不同来源的12株肠炎沙门菌分离株进行分子分型。方法分别提取不同菌株基因组DNA，建立和优化随机扩增多态性DNA(RAPD)反应体系,试用22条随机引物对不同菌株进行RAPD扩增，筛选清晰稳定的扩增条带做统计分析。结果筛选到OPG-03、OPG-06、OPG-07和OPG-13共4条随机引物具有鉴别作用，每一菌株均可扩增出4～10条DNA片段，大多数片段在100～2000bp之间，共扩增出42条RAPD条带，其中共有条带7条，多态性条带35条，多态性为833%。不同来源的肠炎沙门菌分离株之间的遗传相似系数在426%～100%之间，在0850的相似性水平上可将12株肠炎沙门菌分离株分为5个不同的亚型。结论应用RAPD技术在分子水平上对肠炎沙门菌进行鉴别和分型具有简便、快速和辨别能力高的优势，对肠炎沙门菌的分子流行病学研究具有较好的应用前景。 关键词：肠炎沙门菌；随机扩增多态性DNA(RAPD)；分型ApplicationofRAPDinmoleculartypingSalmonellaenteritidisisolates Abstract：ObjectiveMoleculartyping12strainsoftheSalmonellaenteritidisisolatedfromdifferentorigins.Metho dsThegenomicDNAofdifferentSalmonellaenteritisstrainswereextractedandrandomamplifiedpolym orphicDNA(RAPD)systemwasdevelopedandoptimized.22randomprimersweretestedtotheanalysiso n12strainsofSalmonellaenteritisisolatedfromdifferentsources,andtheclearandconstantfingerprints wereselectedforstatisticalanalysis.Results4effectiveprimersnamedOPG-03,OPG-06,OPG-07andOP G-13wereselected,withwhicheachstraincouldbeamplified4to10DNAfragmentsof100bp～2000bp.42RAPDbandswereamplified,833%ofthembeingpolymorphic.Thecomparativeresearchoft heclusteranalysisbasedontheRAPDbandsspectrashowedthatthesimilaritycoefficientbetweentwodi fferentstrainsvariedfrom426%to100%,and12Salmonellaenteritisstrainsinthisexperimentcouldbecl assifiedto5groupsaccordingtotheirgeneticrelationship.ConclusionUsingRAPDtosubtypeandcharact erSalmonellaenteritisatmolecularlevelismorerapidandsensitivethanothertypingmethods,whichind icatebroadfutureofapplication. Keywords：Salmonellaenteritis;RAPD;type 菌株分型对肠炎沙门菌的流行病学调查，以及研究其感染和传播机制具有重要意义。随机扩增多态DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD）具有操作简便、快速、敏感及不需先了解目的基因的核酸序列等优点，目前广泛应用于微生物的分子分型和鉴定、物种亲缘关系的确定及分子流行病学等领域的研究〔1-3〕。本研究应用RAPD技术对12株不同来源的肠炎沙门菌进行分子分型，分析指纹图谱对其鉴别的价值并确定不同菌株间亲缘关系，为肠炎沙门菌食源性疾病预防控制和鉴别诊断提供新方法。结果报告如下。 1材料与方法 11材料(1)菌株与来源:12株肠炎沙门菌分别来自病人分离株4株（菌株号为SEWX01～04），生猪肉分离株2株（菌株号为SEWX05，06），熟食样品分离株1株（菌株号为SEYZ08），鸡分离株3株（菌株号为SEYZ11～13），生鸡肉分离株2株（菌株号为SENT19，20）。(2)酶与试剂:TaqDNA聚合酶,DNAMarker，dNTPs(大连宝生物工程有限公司)；溶菌酶,蛋白酶K，RNA 酶,Sarkosyl(上海申能博彩生物工程公司)；其他试剂均为国产分析纯。(3)随机引物:22条随机引物（编号为OPG-01～OPG-22）由上海申能博彩生物工程公司合成,均为10bp，经筛选用于分型的共有4条，分别为:OPG-03：5＇-AATCGGGCTG-3＇；OPG-06：5＇-CGGCCCCTGC-3＇；OPG-07：5＇-GGATCCTGAC-3＇；OPG-13：5＇-CAGCTCCTGT-3＇。 12方法 121基因组DNA提取挑取单菌落接种100ml乳糖发酵(LB)培养基，37℃震荡培养18h，4℃冷
第11章 随机扩增多态DNA的方法和应用 DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。1990年，Williams和 Welsh 等人运用随机引物扩增寻找的多态性 DNA 片段作为分子标记，并将此方法命名为 RAPD（random amplified polymorphic DNA），即随机扩增多态性 DNA（Williams等 1990；Welsh等 1990）。尽管RAPD技术诞生的时间不长，但由于其独到的DNA多态性以及快速、简便等特点，使它成为目前基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进化和分类的重要手段之一。本文将对RAPD技术的基本原理和特点、基本操作程序以及RAPD技术在检测物种遗传多样性中的应用作一简单的介绍。 11.1 RAPD技术的原理和特点 RAPD技术建立在PCR技术的基础上，它是利用一系列随机排列的寡核苷酸（通常为十聚体）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，经EB染色或放射自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增 DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。 RAPD所用的一系列引物各不相同，但对于任一特定的引物来说，它同基因组DNA序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组的某些区域内的分布如符合PCR扩增条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物的3端相距在一定长度范围之内，就可扩增出片段。因此，如果基因组在这些区域发生DNA片段的插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些结合位点的分布发生相应的变化。通过对 PCR产物的检测即可探知基因组 DNA在这些区域内的多态性。 进行RAPD分析时可用引物数很多，虽然对每一个引物而言，其检测基因组DNA多态 性的区域是有限的，但利用一系列引物则可使检测区域覆盖整个基因组。因此，RAPD可以 对整个基因组进行多态性检测。 RAPD技术与其他DNA多态性检测技术如RFLP（restriction fragment length polymorphism）、DNA指纹图（DNA finger-printing）、SSCP（singer-strind conformatation polymorphism）等相比，还具有以下几个特点：①RAPD技术可以在对受试物种（包括动物、植物和微生物）缺乏任何分子生物学研究的背景下，直接对基因组进行多态性分析；②操作简便，一次RAPD扩增实际上就是一次简单的PCR反应，适合大量样本的快速分析；③所需模板DNA量极少，一般一次扩增只需5～50ng的DNA。因此可以从毛发、脱落组织甚至动物的排泄物中提取微量DNA进行直接扩增。这对于珍稀濒危动物和价值很高的种畜、禽的基因组分析是十分有效的（王文等 1994；陈永久等 1997，1998；Gwakisa等 1994；Yi 1995； 本章作者：陈永久，魏 伟，史宪伟，张亚平