细胞生物实验报告
细胞生物学
实
验
论
文
年级：2012级师范2班
姓名：田金梅
学号：222012317011114
指导老师：魏玲
人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析
（西南大学生命科学学院重庆400715）
摘要：细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速
的一种实验技术，掌握细胞培养技术有利于我们掌握一种非常重要的实验技术方法。本次实验通过用人体外周血淋巴细胞为材料，进行PHA处理然后再37℃下培养72小时，并在离培养终止3~4小时添加秋水仙素处理，然后经过低渗离心固定的反复操作，将细胞收集以及处理成合适的装片，然后通过冰片滴片的方式，再由Gemesa 染液染色，再镜检，找到含46条染色体合适的细胞，再用显微拍照技术拍照，得到的图片经过简单处理，剪切，并测量数据，最后得到核型分析图谱。
关键词：细胞培养；PHA；人体外周血淋巴细胞；染色体装片制备; 核型分析
综述：细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，也是当前细
胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验, 它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。细胞培养是指从体内组
织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单
个细胞或细胞群。近年来发展起来的核移植、细胞杂交、DNA介导的基因转移以及一些物理图谱的建立，也都需要与细胞培养紧密结合【1—2】。
人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙
素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨
动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1材料：人的静脉外周血（男女各2ml，在校医院添加肝素钠抽取血样）
1.1.2实验工具：恒温培养箱（1）、电冰箱（1）、高压灭菌锅（1）、离心机（1）、普通光学显微镜（7）、显微摄影的照相机（1）、培养瓶（4）、离心管(4)、移液枪(2)、胶头(4)、滴管(4)、烧杯(4)、试管架、插管(5)、试剂瓶(4),载玻片（10）。
1.1.3试剂：肝素、完全RPMI—1640培养粉、秋水仙素、0.075mol/lKCl、植物血球凝集素（PHA）、青霉素、链霉素、小牛血清、秋水仙素、无水酒精、冰醋酸、Giemsa粉末、甘油、甲醇、1/15 mol/L的PH为6.8的磷酸缓冲液。
1.2方法
1.2.1人体外周血淋巴细胞的培养
①接种和培养：在无菌工作台上，打开培养瓶的瓶塞，加入3ml培养基，然后再加入母液为5mg/mL PHA男1女1各加45ul使其终浓度为75ug/ml，男2女2各加50ul使其终末浓度处于83ug/ml,再向每瓶加入0.3mL血液，轻轻摇匀，置37 ℃培养箱中培养72h 。
②培养细胞的秋水仙碱处理：培养终止前3h~4h将新鲜配制的50μg／mL 秋水仙素工作液注入培养瓶中，每瓶40ul使其终浓度为0.6ug/ml，轻轻摇匀，放回培养箱中，继续培养至72h。
1.2.2制片及染色体标本制备
①低渗及离心：小心从培养箱取出培养瓶，用吸管将培养后的血细胞混匀，并移至离心管内，以1000r／min离心10min，吸弃上清液，加入8mL37 ℃预热的0.075mmol／L氯化钾低渗液，用吸管上下吹打约10次，使细胞悬浮于低渗液中，置37 ℃水浴箱中，温育20min，，使低渗充分。
②固定：低渗终止后，加入新鲜配制的卡诺固定液（甲醇：冰醋酸＝3:1）1mL，预固定2min ，打匀，放入离心机内，以1000 r／min离心 8分钟min，
倒掉上清液，继续加入固定液5mL，用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打混合细胞悬液。室温下静置20min，以 1000r／min离心 8min，倒掉上清液。
③重复固定：再加入固定液５mL，用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打成混合细胞悬液，室温下静置20min ，以1000r／min离心8min，倒掉上清液。
④制片：向离心管中加入固定液0.5mL，用吸管轻轻吹打成混合细胞悬液。滴片时，先用吸管吸取少量细胞悬液以1.8m高的距离滴至事先冰冻的洁净载玻片上，每片2~3滴，随即对准玻片吹一口气，以协助细胞的分散，然后在乙醇灯火焰上方过火5秒，最后在烘箱中烘干。
⑤染色：将晾干的玻片标本用Giemsa染液染色20min（用1份Giemsa原液加9份pH6.8的磷酸缓冲液），自来水缓缓冲洗玻片，并烘干，镜检。
⑥结果观察：取制备好的健康人体染色体标本，先用低倍镜观察，选择染色体分散良好、无重叠的分裂中期细胞，转换油镜下仔细观察分析。
1.2.3染色体组型分析
①找好的染色体：在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄并确定数目：２n＝４６
②拍照分剪：将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。
③测量与计算: ①将照片上的染色体进行编号, 用直尺测量每一染色体的长度, 此长度为其绝对长度。②计算每一染色体的相对长度, 即每条染色体的长度除以全部染色体的总长度。③测量染色体短臂和长臂的长度, 并求出其臂比, 即长臂长/ 短臂长。④将测量的数据记入表相应栏内
④配对: 根据染色体的相对长度、臂比、次缢痕的有无和位置、形状大小, 随体有无, 着丝点位置, 将其相同表型的染色体从照片上剪下来, 将其同源染色体配成对。
⑤排列：染色体的排列通常是从大到小, 按长度顺序编号, 等长的染色体, 把短臂长的放在前面, 具有特殊标记的如具随体的染色体, 一般排在最后, 性染色体要单独列出。
⑥分类: 以臂比数值确定着丝点位置, 据此可将染色体分成五种类型, 即
正中部着丝点染色体(M ) 臂比( 长/ 短) 1.0。
中部着丝点染色体( m ) 臂比( 长/短) 1.0-1.7
近中着丝点染色体s( m )臂比( 长/ 短) 1.7-3.0
近端着丝点染色体( st ) 臂长( 长/短) 3.0-7.0
端部着丝点染色体(t )臂比( 长/短) 7.0 以上
将所得的各项数据填入下列表中