orexinA和OX1R在新生鼠与成年鼠延髓分布的比较*宁穗，宋娜娜，刘自兵，李莉，曹银祥，钱源，朱大年，沈霖霖
复旦大学上海医学院生理与病理生理学系，上海(200032)
Email:llshen@https://www.doczj.com/doc/7b2869135.html,
摘 要： 本文研究orexinA(OXA)和orexin1型受体(OX1R)在新生鼠与成年鼠的延髓分布及比较。新生大鼠(1-5d)，成年(6-8w)SD大鼠，取其延髓，采用免疫组织化学方法和图像分析技术，观察OXA和OX1R在新生鼠与成年鼠的延髓的分布。结果显示OXA免疫反应阳性纤维和OX1R免疫反应阳性细胞在新生和成年SD大鼠延髓有广泛分布，都主要在延髓腹外侧区(ventrolateral medulla, VLM)和舌下神经核(hypoglossal nucleus, XII)分布比较明显。在这两个区域，新生鼠组的OX1R免疫反应阳性细胞的相对光密度值均低于成年鼠组(P<0.001)。结果表明随着大鼠发育成熟，OX1R表达水平增加，可能与其生理功能完善有关。OXA免疫反应纤维和OX1R免疫反应阳性细胞在延髓的VLM和XII的表达提示可能与心血管和呼吸活动的调节有关。
关键词：orexinA，orexin1型受体，免疫组织化学，大鼠，延髓
中图分类号：R332.3
1．引言
1998年，Sakurai T等[1]在下丘脑中发现了两种与进食有关的新的神经肽：orexinA(OXA)和orexinB(OXB)，由于当时观察到其作用与瘦素(Leptin)的作用相反，而命名为增食因子。研究发现orexin神经元特异性分布在下丘脑，包括穹隆周区、下丘脑外侧区、背中核等[1-2]。orexin通过作用于G蛋白耦联受体(G protein-coupled cell surface receptors, GPCRs)发挥作用。其受体有两种亚型：增食因子1型受体(orexin type 1 receptor, OX1R)和增食因子2型受体(orexin type 2 receptor, OX2R)，这两种受体亚型表达几乎遍及整个脑部，提示orexin的生理活性并不只是公认的促进摄食。后来的研究发现，orexin除了比较公认的促进摄食的作用外，还可影响能量代谢、内分泌、呼吸、睡眠-觉醒、心血管活动和觉醒维持等多种生理活动[3-5]。众所周知，延髓是心血管活动和呼吸调节的重要中枢。由于orexin神经元的投射途径和其受体在中枢神经系统中的分布尚不完全清楚，orexin受体在新生鼠延髓的表达也鲜见报道，故本研究使用免疫组化的方法对OXA和OX1R在新生和成年SD大鼠延髓分布进行观察和比较，为深入了解延髓的OXA和OX1R在心血管活动和呼吸调节中的作用奠定形态学基础。2．材料和方法
2.1. 材料
2.1.1实验动物SD大鼠(复旦大学上海医学院实验动物中心和中科院实验动物中心)。
2.1.2仪器 CM 1900型LEICA冰冻切片机(德国LEICA公司)；LEICA DMLB 显微镜(德国LEICA公司)；LEICA DC300F成像系统(德国LEICA公司)。
*本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20040246051，D.N. Zhu）和国家自然科学基金（项目编号：30670771，L.L. Shen）的资助。
2.1.3 主要试剂兔抗大鼠OXA多克隆抗体，兔抗大鼠OX1R多克隆抗体(sigma公司)，ABC免疫组化试剂盒和二甲基联苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB)(上海华美公司和博士德公司)。
2.2方法
2.2.1 实验动物分组新生(1-5d)和成年(6-8w)SD大鼠各五只，雌雄不计。
2.2.2免疫组织化学方法动物麻醉后，以4％多聚甲醛经左心室灌注固定，取出脑组织，在4％多聚甲醛溶液中进行2-4h后固定，然后20％和30％蔗糖溶液先后沉底。沉底的脑组织保留延髓并修块，以30μm的厚度连续冰冻切片(新生鼠由闩部开始往上0.9mm为切片范围，成年鼠由闩部开始往上1.5mm为切片范围)。将脑片置于96孔板中，每孔2张，一张做OXA免疫反应染色，另一张做OX1R免疫反应染色，并留出空白对照组。用兔抗大鼠orexinA多克隆抗体检测orexinA在延髓的分布，用兔抗大鼠OX1R多克隆抗体检测OX1R 在延髓的分布。4％多聚甲醛再次固定脑片组织，室温，10min。0.3％H2O2孵育脑片，室温，10min，去除内源性过氧化物酶的活性。加入正常山羊血清，37℃孵育30min，阻断非特异性结合，吸去封闭液，加入兔抗orexinA抗体或兔抗OX1R抗体，37℃孵育2h后转入4℃冰箱过夜。加入生物素化的二抗，37℃孵育30min。加入ABC复合物，37℃孵育30min。以上各步骤间均用0.01M的PBS洗片，5min×3。DAB显色8～10min，PBS终止反应。贴片，通风处自然晾干后，依次脱水、透明、中性树胶封片。空白对照组用磷酸盐缓冲溶液代替一抗。镜下观察时阳性表达部位呈棕黄色。
2.2.3图像处理根据George Paxinos & Charles Watson大鼠图谱定位神经核团，用ImageMeasure图像分析系统测定每张脑片相关神经核团和区域的阳性光密度(positive optical density, POD)和背景光密度(background optical density, BOD)，计算出每张切片相关神经核团或区域的相对光密度(relative optical density, ROD)，ROD=(POD－BOD)/ BOD，然后算出每只SD大鼠连续切片的同一种抗体的所有免疫组化切片的平均ROD作为一个样本。
2.3统计方法
使用EXCEL软件，采用成组样本的t检验，以P<0.05为有统计学差异。
3．结果
3.1 orexinA和orexin1型受体在新生和成年SD大鼠延髓的分布
3.1.1 orexinA在新生和成年SD大鼠延髓的分布
在新生鼠和成年鼠延髓有OXA免疫反应阳性纤维广泛分布，没有显示OXA免疫反应阳性神经元。图1显示的是一例OXA免疫反应阳性纤维在成年鼠延髓的表达。从图中可见OXA免疫反应纤维染色较深，主要在舌下神经核(XII)和延髓腹外侧区(VLM)比较明显(图1中的C、D、E、F)。空白对照组未发现阳性染色(图1B)。
3.1.2 Orexin1型受体在新生和成年SD大鼠延髓的分布
OX1R免疫反应阳性细胞在新生鼠和成年鼠延髓有广泛分布(图2A、图3A)。从图中可见OX1R免疫反应阳性细胞在新生鼠和成年鼠的舌下神经核(XII)和延髓腹外侧区(VLM)染色更明显(图2和图3中的C、D、E、F)。空白对照组均未发现阳性染色(图2B和图3B)。
3.2orexin1型受体在新生和成年SD大鼠延髓表达水平的比较
用ImageMeasure 图像分析系统对新生和成年大鼠延髓OX 1R 免疫组织化学结果进行半定量分析，得到OX 1R 免疫反应阳性细胞在新生和成年SD 大鼠XII 和VLM 区的相对光密度。OX 1R 免疫反应阳性细胞的相对光密度在新生鼠XII 是0.188±0.039 (n=5)，在成年鼠XII 是0.376±0.034(n=5)。OX 1R 免疫反应阳性细胞的相对光密度在新生鼠VLM 是0.252±0.019(n=5)，在成年鼠VLM 是0.500±0.063 (n=5)。故在XII 和VLM ，新生鼠组OX 1R 免疫反应阳性细胞相对光密度均低于成年鼠组(P<0.001) (见图4)。
图1. OXA 免疫反应纤维在成年SD 大鼠延髓的分布
Fig.1. Distribution of OXA-like-ir fibers in the medulla of adult SD rat
Scale bar, 1mm (A-B) and 50μm (C-D) and 20μm (E-F).
Abbreviation: XII: hypoglossal nucleus, VLM: ventrolateral medulla
图2. OX 1R 免疫反应阳性细胞在新生SD 大鼠延髓的分布
Fig.2. Distribution of OX 1R-like-ir positive cells in the medulla of neonatal SD rats
Scale bar, 1mm (A-B) and 50μm (C-D) and 20μm (E-F).
Abbreviation: XII: hypoglossal nucleus, VLM: ventrolateral medulla E
F E F
图3. OX 1R 免疫反应阳性细胞在成年SD 大鼠延髓的分布
Fig.3. Distribution of OX 1R-like-ir positive cells in the medulla of adult SD rats
Scale bar, 1mm (A-B) and 50μm (C-D) and 20μm (E-F).
Abbreviation: XII: hypoglossal nucleus, VLM: ventrolateral medulla
图4. OX 1R 免疫反应阳性细胞ROD 在新生与成年鼠XII 和VLM 的比较。
Fig. 4. Comparison of ROD of OX 1R-like-ir positive cells
in XII and VLM of neonatal and adult SD rats. (n=5)
***P<0.001 vs neonatal rats.
4．讨论
orexin 主要在下丘脑神经元内合成，有orexinA 和orexinB 两种[1]。1998年发现其功能
主要与摄食有关，认为它促进摄食，而且与瘦素
(leptin)的作用相反，因此称为增食因子。后来的研究发现
orexin 还与体内其它生理活动的调节有关，已有大量的证据显示orexin 在心血管活动的中枢性调节中起到一定的作用，大鼠侧脑室内微注Orexin 可使动脉平均压剂量依赖性增加，心率增加[6]。发现Orexin 受体还分布在脑内许多组织，如自主神经和内分泌控F E
制区域，且增加下丘脑室旁核对心血管活动的调节[7]。丘脑下部的穹隆周区是众所周知的防御反应的中心，而防御反应是以相伴随的动脉血压、心率、呼吸频率的增加为特征的。2003年，Yuji Kayaba等[8]用orexin基因敲除鼠和正常野生鼠做为实验对象，来研究orexin是否参与防御反应。研究人员向麻醉的野生鼠的穹隆周区微量注射GABA-A受体拮抗剂荷包牡丹碱，动物的动脉血压、心率、呼吸频率呈剂量依赖性增加，在orexin基因敲除鼠微量注射相同的药物也可以观察到相似的变化，但是强度小且持续时间短，提示orexin参与正常大鼠防御反应，这是第一次用生理学实验证实内源性的orexin在中枢神经系统对心血管和呼吸活动起调节作用。延髓也是基本呼吸中枢所在部位，在呼吸节律的产生过程中发挥着至关重要的作用。近年来的研究发现一些orexin神经元支配着兴奋时能引起明显上气道发生通气改变的舌下神经核团和产生呼吸节律的前包钦格区[9-10]。由于orexin神经元的投射途径和其受体在中枢神经系统中的分布尚不完全清楚，orexin受体在新生鼠延髓的表达也鲜见报道，而延髓是心血管活动和呼吸调节的重要中枢，因此确定orexin及其受体在新生和成年SD大鼠延髓的分布及其重要，为进一步深入了解orexin在延髓对心肺活动的调节作用奠定形态学基础。由于OXA与OX1R的亲和力较强，且OX1R对OXA有选择性，故本实验中观察OXA 和OX1R在SD大鼠延髓的分布，并比较新生和成年大鼠的区别。
本实验结果显示OXA的阳性纤维在新生鼠和成年鼠的延髓有广泛分布，没有OXA的阳性细胞的表达，这与已报道的结果一致[11]。本实验中发现OXA免疫反应阳性纤维主要在舌下神经核(XII)和延髓腹外侧区(VLM)较明显（图1），在成年鼠组比新生鼠组明显，但因OXA免疫反应阳性纤维较难进行图像处理分析，故在本实验中没有进行统计分析。实验提示下丘脑的OXA神经元向延髓上述区域有投射。
本实验也发现OX1R免疫反应阳性细胞在延髓有广泛分布，在新生鼠和成年鼠的舌下神经核(XII)和延髓腹外侧区(VLM)分布比较明显，与OXA免疫反应阳性纤维在这两区域的分布一致，其他地方为散在分布。本实验结果与Hervieu等[12]的报道都提示延髓部位OX1R 免疫反应阳性细胞的分布也是广泛的。但与其他报道Orexin在延髓孤束核(nucleus of the solitary tract, NTS)和疑核(nucleus ambiguous, NA)调节心血管活动不完全一致[13-14]。延髓XII 颅神经核发出舌下神经，支配全部舌内肌和舌外肌，并调节气道平滑肌活动。在延髓腹外侧区(VLM)有调节心血管活动的神经元，被称为心交感中枢，又是化学感受神经元所在的区域，呼吸节律产生的前包钦格复合体(pre-B?tzinger Complex, PBC)也位于VLM内，故VLM区是重要的心血管和呼吸活动调节中枢，结果发现延髓VLM内不仅有OXA免疫反应阳性纤维投射，而且有OX1R免疫反应阳性细胞的表达，提示orexin可能参与对心肺活动的调节。
随着动物的生长发育，生理功能逐渐完善，OX1R免疫反应阳性细胞在新生鼠和成年鼠的延髓表达是否有差异？为此计算了两组大鼠延髓XII和VLM区OX1R免疫反应阳性细胞相对光密度值，结果发现新生鼠的上述两个区域的相对光密度值均低于成年鼠组(P<0.001)，差别有极显著意义。结果显示，随着大鼠发育成熟，延髓XII和VLM 区OX1R表达水平是增加的，可能提示Orexin对心肺活动的调节也趋于完善。
本研究中发现不仅OXA阳性反应纤维在大鼠延髓的XII和VLM有投射，而且OX1R 阳性反应神经元在延髓XII和VLM分布，并随着大鼠发育成熟表达增加，这些结果都有利于今后在整体大鼠或新生大鼠离体脑片实验中选择相应的Orexin亚型或受体阻断剂来研究orexin对心血管和呼吸等其他多种功能的调节效应。
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Distribution of orexinA and orexin type 1 receptor
in the medulla of neonatal and adult rats
Sui Ning, Na-Na Song, Zi-Bing Liu, Li Li,Yin-Xiang Cao,
Yuan Qian, Da-Nian Zhu, Lin-Lin Shen
(Department of Physiology and Pathophysiology, Shanghai Medical College,
Fudan University, Shanghai 200032, China)
Abstract
Present study investigated the distribution of orexinA-like-immunoreactivity (OXA-like-ir) and orexin type 1 receptor-like-immunoreactivity (OX1R-like-ir) in the medulla of neonatal and adult Sprague-Dawley (SD) rats. OXA-like- and OX1R-like-ir were separately observed in the medulla
of neonatal (1-5d) and adult (6-8w) SD rats by using immunohistochemical techniques and software of ImageMeasure. Expressions of OXA-like- and OX1R-like-ir were observed throughout the medulla of neonatal and adult rats. OXA-like-ir fibers and OX1R-like-ir positive cells were both in the ventrolateral medulla (VLM) and hypoglossal nucleus (XII) mainly. In the VLM and XII, relative optical density (ROD) of OX1R-like-ir positive cells in neonatal rats was less than that in adult rats (P<0.001). The expression of OX1R-like-ir increased in adult rat may indicate its important role in physiological functions with maturation. The presence of orexinA-like-ir fibers and OX1R-like-ir neurons in the XII and VLM both is in support of its proposed role in regulation of cardiovascular and respiratory activities.
Keywords: orexinA；orexin type 1 receptor；immunohistochemistry；rat；medulla oblongata
作者简介：宁穗，女，硕士研究生，主要研究心血管和呼吸活动的神经调节。宋娜娜，女，博士研究生，主要研究心肺功能的耦合。朱大年：教授，博士生导师。沈霖霖：教授，博士生导师。