四川大学
硕士研究生课程考试试卷
四川大学生命科学学院制
Western blot
摘要：本文主要是针对Western blot的原理及操作进行了简单的阐述，Western
印迹法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。同时对Western blot在实际操作中应注意的细节问题进行了归纳以及与其它免疫技术就抗体检测方面进行了比较。
关键词：Western blot；免疫反应抗体；转膜；显色；蛋白条带
印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Western blot），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
一、Western blot的原理
Western blot的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。Western blot首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的
印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。
除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。
在Western blot实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。
二、分类
Western Blot显色的方法主要有：放射自显影、底物化学发光ECL、底物荧光ECF、底物DAB呈色。
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、Western blot的操作（间接的用二抗）
WB概述: 检测原理:
图表1 WB实验试剂配制方法
图表2 SDS-PAGE胶的配制
1、蛋白质样品（抗原）的制备：
①细胞的处理方法：向收集到的细胞中加入RIPA裂解缓冲液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，终浓度为2ug/ml）在冰上裂解30—60min，然后再插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次，再离心12000rpm3-5min，吸取上清备用。
组织的处理方法：按实验要求将组织从动物体内取出（样品不宜反复冻融），取少量（1-2g左右）放入玻璃匀桨器中研磨成匀浆，然后转入EP管中进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次5-7秒，重复5-6次，再离心
12000rpm3-5min，吸取上清备用。
②上述两种方法得来的样品处理液还要加入1/4体积左右的5X上样Buffer，然后放在沸水浴中加热3-4min使蛋白变性，方可作为样品点样。（注意：在加热组织裂解液时，肝脏和肾脏组织要特别注意其本身浓度，最好是在制作裂解液时
就适当稀释，否则加热后会凝结成固态。还有些组织处理后很粘稠，有带丝状物，这是未裂解的核酸，可以适当离心后再用。）
2、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
①根据要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝胶（一般釆用10%的SDS－PAGE）
②将已配制好的凝胶装入电泳仪中（注意不要漏液）。
③设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样。一般裂解液我们按10-20ul/道点样，重组蛋白按1-2ug/道点样。
④把电泳装置与电源连接好，将电压调至100V电泳10-20min，待溴酚蓝迁移出积层胶位置再换用200V，30-40min后关闭电源。
⑤从电泳装置上卸下凝胶玻璃板，用水冲洗干净，准备转膜。
3．转膜（湿转）
①将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的容器中，浸泡几分钟。
②带上手套，准备好滤纸和NC膜（83mm×75mm），尽量避免污染滤纸和膜，将裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，驱除留于膜上的气泡。
③打开转移盒并放置浅盘中，用转移缓冲液将海绵垫完全浸透后将其放在转移盒壁上，海绵上再放置一张浸湿的滤纸。
④按“海绵—滤纸—凝胶—NC膜—滤纸—海绵”的顺序装置好（注意不能有气泡且装置电极槽不能放反）
⑤将冰盒装入缓冲液槽，注满4℃预冷的转移缓冲液。
⑥将整个装置放在冰浴中用磁力搅拌器搅拌，连接好转移电极恒流300mA转移90min。电转完毕后，将NC膜作好记号置于5%的脱脂奶粉（PBS配制）中封闭，37℃2小时或4℃过夜。
4．加一抗与抗原结合
①将加样槽洗涤干净，将膜用一次性手套覆盖好，按标记和实验设计切下膜条并作好记号，按顺序置于加样槽中加入相应的一抗约1ml(PBS-T加入5%脱脂奶粉中加入抗体，配制量根据盛放膜的器具大小而定)，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
②室温下于摇床孵育2h或4℃过夜。
③弃去一抗（一般可以回收再次利用），膜条仍置于加样槽，每个槽中的膜用PBS-T在摇床洗涤洗涤5min左右，换液，反复4-5次。
5．加二抗与一抗的结合
①根据实验需要和设计选择合适的酶标二抗和稀释浓度（PBS-T加入2.5%脱脂奶粉中加入抗体），每个加样槽中加入二抗1ml左右室温下于摇床孵育1h，注意保证膜的所有部分同溶液接触。
②弃去二抗，膜条仍置于加样槽，每个槽加PBS-T在摇床洗涤洗涤5min左右，换液反复4-5次。
6．显色反应（重组蛋白一般用AP显色或是DAB显色，裂解液一般用发光法）
① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker 记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存
② AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66mlNBT溶液和33ml BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37℃可加速反应）5-15min。对照Marker 记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。
③底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱要控制好时间）。
四、Western blot要注意的一些问题
1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH））；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清；空白对照（不加一抗，用PBS-T代替）；无关对照（用无关抗体）
2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。
3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。
4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；APS和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。
5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。
6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。
8、在显色发光时要特别注意二抗所对应的显色方法，特别是在发光时要注意发光时间和显影时间的控制，以看得清楚目的条带为标准。
总而言之，做Wetern blot实验熟练撑握原理和操作是前提，关键是统筹整
个实验流程，合理安排，注意细节，这样才能保证实验的高效性和准确性。
参考文献：
[1]黄培堂等译. 分子克隆实验指南（第三版）（中译版）.第十八章蛋白质相互作用研究技术．北京：科学出版社, 2002年9月出版
[2]汪家政.蛋白质技术手册. 第五章变性条件下的凝胶电泳.北京：科学出版社，2000.
[3]郭晓军.蛋白质电泳实验技术. 第四章常规聚丙烯酰胺凝胶电泳.北京：科学出版社，1999.
[4]https://www.doczj.com/doc/761105263.html,/doc/showarticle.asp?newsid=9232
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:
一、原理
二、分类
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
三、主要试剂
四、主要步骤
五、实验常见的问题指南
1.参考书推荐
2.针对样品的常见问题
3.抗体
4.滤纸、胶和膜的问题
5.Marker的相关疑问
6.染色的选择
7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题
9.条件的摸索
10.方法的介绍
11.结果分析
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类
western显色的方法主要有以下几种：
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲
叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1 mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12. 8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
（可以参看分子克隆）
四、主要步骤
生物秀为您搜集了现阶段几乎网上所有的Western Blot的中英文资料，仅供实验参考，可以根据自己实验的实际情况进行调整：
Western Blot PROTOCOL：
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五、实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：
1. 参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlo w ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题
B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF 行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMS F就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C. 细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？
解答：一般地5* 106就足够了。
D. 同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对Western Blot有无影响?
解答：能，没有问题，我们做过。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－1 0％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。
J. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm 2。
S. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
3. 抗体
T. 做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性
的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）
W. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
4. 滤纸、胶和膜的问题
X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别？
解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp 的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。
就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
Y. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
Z. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？
解答：可以。
AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？
解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？
解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。
CC. 采用tank system有什么讲究？
解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如28V 14－16hrs。
DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？
解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。
EE. 膜一般要如何处理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
FF. 如果是6×8转印膜，要加多少一抗？
解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。
GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
解答：无要求。
HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？
解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（3 0%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge，湿转36V ，3－5hrs就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－page，48V 10hrs－16hrs。
KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0. 2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜？
解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、
方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是1 00%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。
PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE 阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合研究。
还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。
5. Marker的相关疑问
MM. 我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。
解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。
NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-H RP）。但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！
解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30k d，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。
2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker 有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。
3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。
6. 染色的选择
OO. Western Blot哪种染色好？
解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。
（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。
7. 参照的疑问
PP. 是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？
解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。
QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗？
解答：分析一般的结果没问题。
RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适？
解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。
SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？
解答：不是的，半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。
TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好？
解答：选用beta-actin就可以。
8. 缓冲液配方的常见问题
UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris 和盐酸配出来的呢？
解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。
VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？
解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。
XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？
解答：可以在下面几个问题上找找原因。1. 封闭液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。
YY. 加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。
ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween 吗，浓度多大？
解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl，0.2g of KCl，and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by aut oclaving.
AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下?
解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度
过夜。
BBB. 实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鲜加入：65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)
是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl，50 mmol/L，pH 7.5; NaCl，150 mmol/L; NP-40，1%; 脱氧胆酸钠，0.5%; SDS，0.1%; EDTA，1 mmol/L; PMSF，1 mmol/L; Leup eptin，2 μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制剂？解答：做２－Ｄ绝对不推荐使用ＮＰ－４０（因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做ＷＢ无所谓，做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很
大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下。
CCC. Western Stripping Buffer的配方
解答：METHOD1
1、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS
二次发光protocol:1.stripping buffer洗膜：50度水浴30分钟，摇床上摇10-20分钟。
2、1*PBST洗：摇床上摇30分钟。
3、封闭，加一抗，二抗（同第一次发光）
METHOD2
（50ml总量）：?-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至50 ml。
方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用T TBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。
该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。
METHOD3
1、beta-metaptoethanol 35ul
2、10%SDS 1ml
3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul
4、dH2O 3.34ml
50-55℃，30min。
METHOD4
stripping buffer应该是可以放置很久的。不过我习惯于现配——毕竟，加了β-mercaptoet hanol 以后太难闻了，配了就用；而且，有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，现配还是很方便的。每次用量5ml少了点，我每次用50ml。
METHOD5
0.5M NaCl，0.5M HAc；室温摇床15min。
METHOD6
将用过的膜泡在1*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加一抗，二抗（同第一次发光），实践证明方法完全可行。
不管用那种方法，洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次。
9. 条件的摸索
DDD. 用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解-80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，取
《机械制造技术基础》 课程大作业2 大批生产转向节机械加工工艺 及关键问题分析 院（系）： 专业：机械设计制造及其自动化 学生： 学号： 班号： 2012 年5 月
1.题目及要求 (1)机械加工工艺路线（工序安排） a)①工艺方案分析（加工重点、难点） b)②工序编排（加工顺序、内容） c)③加工设备和工艺装备 (2)关键问题分析（Ⅰ、Ⅱ、┅、┅） ①加工工艺问题 ②装夹问题 ③生产率问题 ④新技术 (3)解决关键问题的工艺措施（参阅资料） (4)零件三维图及二维工程图
2. 工艺方案分析 此转向节有多处加工表面，且空间位置复杂，它们之间都有一定的位置要求。根据待加工表面的分布和特点，可以把这些加工表面分为三组。分别为杆部及法兰盘、体部和转向臂。现分述如下： (1) 以中心孔定位加工法兰盘及杆部 以车削为主，配合磨削完成M20×（有效长度）端头螺纹，?28?0 .15?0 .03轴颈， ?44?0 .15?0 .03轴颈，?56?0 .15?0 .03轴颈以及端面A 、B 、C 、D 、E 、F 和倒角的加工。 (2) 以?28?0 .15?0 .03、?56?0 .15?0 .03轴颈、中心孔以及端面A 定位加工转向节臂部和体部 这一组加工表面包括：转向节臂上和体部凸台处?15销孔、16±铣扁、?45 0 +0 .05主销孔及其端面，体部?26沉孔和M20×上的销孔。 (3) 以?45 0 +0 .05主销孔及其端面定位加工的体部 这一组加工表面包括：?20凸台及上面的M10螺纹孔，体部的上下锥孔，法兰盘上4个螺纹孔间距42的两R10凸台及其上的? 10. 3螺栓孔和主销孔铣断。 这些加工表面之间有着一定的位置要求，主要包括： 1) ?45 0+0 .05主销孔，位置尺寸910 +0 .5； 2) 端面F ，位置尺寸72 ?0.5 0； 3) 上下螺栓孔?10. 3～10. 5，位置尺寸26±； 4) 转向节臂部销孔?15位置尺寸124±； 5) 体部?26沉孔，保证尺寸18±； 加工重点：由于主销孔和法兰面、轴颈是其他加工表面精加工的尺寸基准和定位基准，其尺寸和位置精度要求较高。因此采用互为基准的方式进行加工。即先以轴颈和法兰面为定位基准加工主销孔，再以主销孔为定位基准加工法兰面和轴颈。 由以上分析可知，对于上述的加工表面，可以按照上述的先后顺序，借助专用夹具在通用机床上加工完成。
1．刀具后角是指后刀面与切削平面间的夹角。 3．精车铸铁时应选用（YG3）；粗车钢时，应选用（YT5）。 4．当进给量增加时，切削力（增加），切削温度（增加）。 8．机床型号由字母与数字按一定规律排列组成，其中符号C代表（车床）。 11．定位基准与工序基准不一致引起的定位误差称（基准不重合）误差，工件以平面定位时，可以不考虑（基准位置）误差。 12．机床制造误差是属于（系统）误差，一般工艺能力系数C p应不低于（二级）。 15．工艺过程是指用机械加工方法直接改变原材料或毛坯的形状、尺寸和性能，使之成为合格零件的过程。 一、简述切削变形的变化规律，积屑瘤对变形有什么影响？（8分） 变形规律：ro↑，Λh↓；Vc↑，Λh↓；f↑, Λh↓; HB↑, Λh↓ 积屑瘤高度Hb↑,引起刀具前角增加，使Λh↓ 六、加工下述零件，以B面定位，加工表面A，保证尺寸10＋0.2mm，试画出尺寸链并求出工序尺寸L及公差。（8分） L＝mm 2201.0- 九、在六角自动车床上加工一批18 03 .0 08 .0 φ+-mm滚子，用抽样检验并计算得到全部工件的平均尺寸为Φ17.979mm，均方根偏差为0.04mm，求尺寸分散围与废品率。 尺寸分散围：17.859－18.099mm 废品率： 17.3% 1．工序是指一个工人在一台机床上对一个（或多个）零件所连续完成的那部分工艺过程。 2．剪切角增大，表明切削变形（减少）；当切削速度提高时，切削变形（减少）。 3．当高速切削时，宜选用（硬质合金）刀具；粗车钢时，应选用（YT5）。 4．CA6140车床可加工公制，英制，模数和径节等四种螺纹。 5．不经修配与调整即能达到装配精度的方法称为（互换法）。 6．当主偏角增大时，刀具耐用度（减少），当切削温度提高时，耐用度（减少）。 11．定位基准面和定位元件制造误差引起的定位误差称（基准位置）误差，工件以平面定位时，可以不考虑（基准位置）误差。 12．测量误差是属于（随机）误差，对误差影响最大的方向称误差敏感方向。 13．夹紧力的方向应与切削力方向（相同），夹紧力的作用点应该（靠近）工件加工表面。 一、金属切削过程的本质是什么？如何减少金属切削变形？（8分）
《制造技术基础A》教学大纲 课程编码：08297019 课程名称：制造技术基础A 英文名称：Fundamentals of Manufacturing Technology A 开课学期：6 学时/学分：68 / 4 （其中实验学时：8学时） 课程类型：学科基础必修课 开课专业：机械类专业本科生 选用教材：《机械制造技术基础》吉林大学、机械工业出版社2004年1月第一版 主要参考书： 1、卢秉恒、于骏一、张福润主编：《机械制造技术基础》，机械工业出版社1999年版。 2、包善斐、王龙山、于骏一主编：《机械制造工艺学》，吉林科技出版社1995年版。 3、王宝玺主编：《汽车拖拉机制造工艺学》，机械工业出版社2000年出版。 4、周泽华主编：《金属切削原理》，上海科学技术出版社2000年出版。 执笔人：邹青 一、课程性质、目的与任务 《制造技术基础》是学科基础必修课，具有较强的实践性和应用性，为将来解决制造中的技术问题打基础，是机械类专业学生的一门主干技术基础课。本课程的任务是培养学生掌握金属切削过程的基本规律，掌握机械加工的基本知识，能选择加工方法与机床、刀具、夹具及加工参数，掌握机械加工精度和表面质量的基本理论和基本知识，使学生具有工艺设计和夹具设计的基本技能。通过实践教学环节培养学生分析解决工程实际问题的能力和工程设计能力。 在教学过程中要综合运用先修课程中所学到的有关知识与技能，结合各种实践教学环节，进行机械工程技术人员所需的基本训练，为学生进一步学习有关专业课程和有目的从事机械设计、制造工作打下基础。因此制造技术基础课程在机械类专业的教学计划中占有重要的地位和作用。 二、教学基本要求 1、掌握下列基本理论：金属切削基本理论；机械制造质量分析与控制理论；零件机械加工工艺规程设计及装配工艺设计原理；机床夹具设计原理；设计工艺性评价。 2、了解下列知识：机械加工方法与装备；计算机辅助机械制造；先进制造技术。 3、掌握下列基本技能：能够按实验指导书进行实验操作，并能初步分析结果；能够制订中等复杂程度零件的机械加工工艺规程；能够设计中等复杂程度的机床夹具。 4、初步掌握下列基本技能：能够综合分析制造过程中的一般问题；能够设计一般机器的装配工艺规程。 5、注重培养学生的思维能力，采用理论与实践相结合的方法进行教学，培养和提高学生分析解决工程实际问题的能力和工程设计能力。 三、各章节内容及学时分配 第一章绪论（3学时） 教学目的与要求
机械制造技术基础（试题1） 班级姓名学号成绩 一、填空选择题（30分） 1．刀具后角是指。 2．衡量切削变形的方法有两种，当切削速度提高时，切削变形（增加、减少）。 3．精车铸铁时应选用（YG3、YT10、YG8）；粗车钢时，应选用（YT5、YG6、YT30）。 4．当进给量增加时，切削力（增加、减少），切削温度（增加、减少）。 5．粗磨时，应选择（软、硬）砂轮，精磨时应选择（紧密、疏松）组织砂轮。 6．合理的刀具耐用度包括与两种。 7．转位车刀的切削性能比焊接车刀（好，差），粗加工孔时，应选择（拉刀、麻花钻）刀具。 8．机床型号由与按一定规律排列组成，其中符号C代表（车床、钻床）。 9．滚斜齿与滚直齿的区别在于多了一条（范成运动、附加运动）传动链。滚齿时，刀具与工件之间的相对运动称（成形运动、辅助运动）。 10．进行精加工时，应选择（水溶液，切削油），为改善切削加工性，对高碳钢材料应进行（退火，淬火）处理。 11．定位基准与工序基准不一致引起的定位误差称（基准不重合、基准位置）误差，工件以平面定位时，可以不考虑（基准不重合、基准位置）误差。 12．机床制造误差是属于（系统、随机）误差，一般工艺能力系数C p应不低于（二级、三级）。 13．在常用三种夹紧机构中，增力特性最好的是机构，动作最快的是 机构。 14．一个浮动支承可以消除（0、1、2）个自由度，一个长的v型块可消除（3，4，5）个自由度。 15．工艺过程是指 。
二、外圆车刀切削部分结构由哪些部分组成？绘图表示外圆车刀的六个基本角度。（8分） 三、简述切削变形的变化规律，积屑瘤对变形有什么影响？（8分） 四、CA6140车床主传动系统如下所示，试列出正向转动时主传动路线及计算出最高转速与 最低转速。（8分） 五、什么叫刚度？机床刚度曲线有什么特点？（8分） 六、加工下述零件，以B面定位，加工表面A，保证尺寸10＋0.2mm，试画出尺寸链并求出工序尺寸L及公差。（8分）
机械制造技术基础实验指 导书本科 Newly compiled on November 23, 2020
机械制造技术基础 实验指导书 编写：詹友基 福建工程学院机械与汽车工程学院 2013 年 8 月 目录 一、车刀几何角度测量 二、切削变形系数测量实验 三、切削力实验 四、机床动、静刚度的测定 五、加工精度统计分析 六、切削温度实验
实验1 车刀几何角度测量 一、实验目的与要求 1、了解车刀量角仪的结构与工作原理。 2、进一步熟悉车刀切削部分的构造要素，巩固和加深对刀具各标注平面参考系及标注角度基本定义的理解。并掌握车刀测量方法。 3、通过对车刀各剖面内角度的测量与计算，进一步理解它们之间几何关系。 4、测量给定车刀的几何角度，将测得的数据填入表格中，并对测量结果进行分析。 二、实验设备与工具 1、仪器：车刀量角仪 2、测量用车刀：45°外圆车刀，75°外圆车刀，90°外圆车刀，切断刀，大刃倾角车刀。 三、车刀量角仪的结构与使用方法 1、图1-1量角仪(本校制造) 图1-1 量角仪（本校） 量角仪由底置l、转盘9、立柱3和刻度盘6、测量片7等零件组成。底盘1用来安装立柱3，并以销2孔为中心刻着±100°的转盘9，当转盘9两侧面的基线对准底盘刻线转90°时。定位块10的d面是垂直的。当测量片7的指针对着刻度盘0°时，测量片7的b 面与转盘9的平面是平行的，而且垂直于C面、A面。立柱3的上下移动靠螺母4来调整。 2、图1-2量角仪（哈尔滨工业大学） 图1-2 量角仪（哈尔滨工业大学）
量角仪由底座l 、平台3、立柱7和大小扇形盘6、11、大小指针5、10等零件组成。 底座l 呈圆盘形，平台3可绕底座中心转动，底座外缘左、右各有刻度l00°，当基线板2对准圆盘刻线0°时，活动尺4侧边与指针5下端的测量板平面垂直。测量板5上有三个测量刃口A 、B 、C ，其所在平面即为测量车刀角度时的测量平面。当小指针l0和大指针5均为0°时，刃口A 与平台平面平行，B 、C 与平台平面垂直。 四、实验步骤和方法(本校制造) 要测量某一车刀角度时，首先应规定一个假定走刀方向，即要先辩明车刀的主、副切削刃及前、后刀面，以确定需要测量角度的位置。然后将车刀放在转动平台上，左或右侧面靠在活动尺的侧面上。 测量角度的顺序通常先测偏角，再测刃倾角，继而测前角、后角。这样调整方便，也可提高工作效率。即测量顺序为： 主切削刃：r k ——s λ——o γ——o α；副切削刃：r k '——s λ'——o γ'——o α'。 （1）主偏角的测量 首先把车刀放在转盘9上，使车刀的侧面与定位块l0的d 面紧密接触，这时可以调整螺母4，使滑块5上下移动，然后转动转盘9，使车刀主刀刃贴合于测量片7的A 面，这样转盘9刻线对着底盘l 的数据给予处理，即是主偏角的角度。 （2）刃倾角的测置 测量刃倾角的方法基本上是同测量主偏角角度一样，所不同的是调整测量片7的b 面与主刀刃贴合，这样可以在刻度盘6直接读出刃倾角的角度。 （3）前角的测量 测量前角的方法是车刀放转盘9上，使车刀的侧面与定位块l0的d 面紧密接触，然后转动转盘9，(测量片7处于车刀主剖面位置)，此时调整测量片7的b 面与车刀的前刀面贴合，这样可以在刻度盘6上直接读出前角角度。 （4）后角的测量
Comment [u1]: 这几种属于传统的切 削加工，特种加工包括：电火花成型加工和电火花线切割加工,超声波加工等 1 1.制造工艺过程：技术准备，机械加工，热处理，装配等一般称为制造工艺过程。 2.机械加工由若干工序组成。工序又可分为 安装，工位，工步，走刀。 3.按生产专业化程度不同可将生产分为三种类型：单件生产，成批（小批,中批,大批）生产，大量生产。 4.材料去除成型加工包括 传统的切削加工和特种加工。 5.金属切削加工的方法有 车削，钻削，镗削，铣削，磨削，刨削。 6.工件上三个不断变化的表面 待加工表面，过渡表面（切削表面）， 已加工表面。（详见P58） 7.切削用量是以下三者的总称。 （1）切削速度，主运动的速度。 （2）进给量， 在主运动一个循环内刀具与工件之间沿进给方向相对移动的距离。（3）背吃刀量 工件上待加工表面和已加工表面件的垂直距离。8.母线 和 导线 统称为形成表面的 发生线。9.形成发生线的方法 成型法，轨迹法，展成法，相切法。10.表面的成型运动是保证得到工件要求的表面形状的运动。 11.机床的分类：（1）按机床万能性程度分为：通用机床，专门化机床，专用机床。 （2）按机床精度分为：普通机床，精密机床，高精度机床。（3）按自动化程度分为：一般机床，半自动机床，自动机床。（4）按重量分为：仪表机床，一般机床，大型机床，重型机床。 （5）按机床主要工作部件数目分为：单刀机床，多刀机床，单轴机床，多轴机床。（6）按机床具有的数控功能分:普通机床，一般数控机床，加工中心，柔性制造单元等。 12.机床组成：动力源部件，成型运动执行件，变速传动装置，运动控制装置，润滑装置，电气系统零部件，支承零部件，其他装置。 13.机床上的运动：（1）切削运动（又名表面成型运动），包括： 1、主运动 使刀具与工件产生相对运动，以切削工件上多余金属的基本运动。 2、进给运动 不断将多 建议收藏下载本文，以便随时学习！ 我去人也就有人！为UR扼腕入站内信不存在向你偶同意调剖沙
《机械制造技术基础》期末考试试题及答案 一、填空题（每空1分，共15分） 1．切削时工件上形成的三个表面是已加工表面、过渡表面和待加工表面。 2．工件与刀具之间的相对运动称为切削运动，按其功用可分为主运动和进给运动，其中 建议收藏下载本文，以便随时学习！ 主运动消耗功率最大。 3．在磨削过程中，磨料的脱落和破碎露出新的锋利磨粒，使砂轮保持良好的磨削能力的 特性称为砂轮的自锐性。 4．按照切削性能，高速钢可分为普通性能高速钢和高性能高速钢两种，超硬刀具材料主 要有陶瓷、金刚石和立方氮化硼三种 5．在CA6140车床上加工不同标准螺纹时，可以通过改变挂轮和离合器不同的离合状态 来实现。 6．CA6140上车圆锥面的方法有小滑板转位法、_尾座偏移法和靠模法。 7．外圆车刀的主偏角增加，背向力F p减少，进给力F f增大。 8．切削用量要素包括切削深度、进给量、切削速度三个。 9．加工脆性材料时，刀具切削力集中在刀尖附近，宜取较小的前角和后角。 10．在车削外圆时，切削力可以分解为三个垂直方向的分力，即主切削力，进给抗力和切深抗力，其中在切削过程中不作功的是切深抗力。 11．金刚石刀具不适合加工铁族金属材料，原因是金刚石的碳元素与铁原子有很强的化学亲和作用，使之转化成石墨，失去切削性能。 12．研磨可降低加工表面的粗糙度，但不能提高加工精度中的位置精度。 13．滚齿时，刀具与工件之间的相对运动称范成运动。滚斜齿与滚直齿的区别在于多了一条附加运动传动链。 14．为了防止机床运动发生干涉，在机床传动机构中，应设置互锁装置。 15．回转,转塔车床与车床在结构上的主要区别是,没有_尾座和丝杠 二、单项选择题（每题1分，20分） 1、安装外车槽刀时，刀尖低于工件回转中心时，与其标注角度相比。其工作角度将会：（ C ） A、前角不变，后角减小； B、前角变大，后角变小； C、前角变小，后角变大； D、前、后角均不变。 2、车外圆时，能使切屑流向工件待加工表面的几何要素是：（A ） A、刃倾角大于0°； B、刃倾角小于0°； C、前角大于0°； D、前角小于0°。 3、铣床夹具上的定位键是用来（B）。 A、使工件在夹具上定位 B、使夹具在机床上定位 C、使刀具对夹具定位 D、使夹具在机床上夹紧 4、下列机床中，只有主运动，没有进给运动的机床是（ A ） A、拉床 B、插床 C、滚齿机 D、钻床 5、车削外圆时哪个切削分力消耗功率为零？（ B ） A、主切削力； B、背向力； C、进给力； D、摩擦力。 6、在金属切削机加工中，下述哪一种运动是主运动（ C ） A、铣削时工件的移动 B、钻削时钻头直线运动 C、磨削时砂轮的旋转运动 D、牛头刨床工作台的水平移动 7、控制积屑瘤生长的最有效途径是（ A ）
安徽三联学院 《机械制造技术基础》实验指导书 交通工程学院实验中心
实验1 、车刀几何角度测量 一、实验目的与要求 1了解车刀量角台的构造与工作原理。 2掌握车刀几何角度测量的基本方法。 3加深对车刀各几何角度、各参考平面及其相互关系的理解。 二、实验实施的条件 仪器：回转工作台式量角台 = 00） 车刀： 1直头外圆车刀（λ s 2直头外圆车刀（λ < 00） s 三、实验具体步骤 图1-1所示，回转工作台式量角台主要由底盘1、平台3、立柱7、测量片5、扇形盘6、10等组成。底盘1为圆盘形，在零度线左右方向各有1000角度，用于测量车刀的主偏角和副偏角，通过底盘指针2读出角度值；平台3可绕底盘中心在零刻线左右1000范围内转动；图1-1 量角台的构造定位块4可在平台上平行滑动，作为车刀的基准；测量片5，如图1-2所示，有主平面（大平面）、底平面、侧平面三个成正交的平面组成，在测量过程中，根据不同的情况可分别用以代表剖面、基面、切削 平面等。大扇形刻度盘6上有正副450的刻度，用于 测量前角、后角、刃倾角，通过测量片5的指针指 出角度值；立柱7上制有螺纹，旋转升降螺母8就 可以调整测量片相对车刀的位置。 1利用车刀量角台分别测量λs = 00 、λs < 00 的直头外圆车刀的几何角度： 要求学生测量κr、κr＇、λs、γo、αo、αo ＇等 图1-2 测量片 共6个基本角度。 2记录测得的数据，并计算出刀尖角ε和楔角β。 1、实验方法 1根据车刀辅助平面及几何参数的定义，首先确定辅助平面的位置，在按着几何角度的定义测出几何角度。
2通过测量片的测量面与车刀刀刃、刀面的贴合（重合）使指针指出所测的各几何角度。 2、实验步骤 1首先进行测量前的调整：调整量角台使平台、大扇形刻度盘和小扇形刻度盘指针全部指零，使定位块侧面与测量片的大平面垂直，这样就可以认为：（1）主平面垂直于平台平面，且垂直于平台对称线。 （2）底平面平行于平台平面。 （3）侧平面垂直于平台平面，且平行于平面对称线。 2测量前的准备：把车刀侧面紧靠在定位块的侧面上，使车刀能和定位块一起在平台平面上平行移动，并且可使车刀在定位块的侧面上滑动，这样就形成了一个平面坐标，可以使车刀置于一个比较理想的位置。 3测量车刀的主（副）偏角 （1）根据定义：主（副）刀刃在基面的与走刀方向夹角。 （2）确定走刀方向：由于规定走刀方向与刀具轴线垂直，在量角台上即垂直于零度线，故可以把主平面上平行于平台平面的直线作为走刀方向，其与主（副）刀刃在基面的投影有一夹角，即为主（副）偏角。 （3）测量方法：顺（逆）时针旋转平台，使主刀刃与主平面贴合。如图1-3所示，即主（副）刀刃在基面的投影与走刀方向重合，平台在底盘上所旋转的角度，即底盘指针在底盘刻度盘上所指的刻度值为主（副）偏角κr（κr＇）的角度值。 4测量车刀刃倾角（λs） （1）根据定义：主刀刃和基面的夹角。 （2）确定主切削平面：主切削平面是过主刀刃与主加工表面相切的平面，在测量车刀的主偏角时，主刀刃与主平面重合，就使主平面可以近似地看作主切削平面（只有当λs =0时，与主加工表面相切的平面才包含主刀刃），当测量片指针指零时底平面可作为基面。这样就形成了在主切削平面内，基面与主刀刃的夹角，即刃倾角。 （3）测量方法：旋转测量片，即旋转底平面（基面）使其与主刀刃重合。如图1-4所示，测量片指针所指刻度值为刃倾角。 5测量车刀主剖面内的前角γo和后角αo
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
机械制造技术基础知 识点整理
1.制造工艺过程：技术准备，机械加工，热处理，装配等一般称为制造工艺过程。 2.机械加工由若干工序组成。工序又可分为安装，工位，工步，走刀。 3.按生产专业化程度不同可将生产分为三种类型：单件生产，成批（小批,中批,大批）生产，大量生产。 4.材料去除成型加工包括传统的切削加工和特种加工。 5.金属切削加工的方法有车削，钻削，镗削，铣削，磨削，刨削。 6.工件上三个不断变化的表面待加工表面，过渡表面（切削表面），已加工表面。（详见P58） 7.切削用量是以下三者的总称。 （1）切削速度，主运动的速度。 （2）进给量，在主运动一个循环内刀具与工件之间沿进给方向相对移动的距离。 （3）背吃刀量工件上待加工表面和已加工表面件的垂直距离。 8.母线和导线统称为形成表面的发生线。 9.形成发生线的方法成型法，轨迹法，展成法，相切法。 10.表面的成型运动是保证得到工件要求的表面形状的运动。 11.机床的分类：（1）按机床万能性程度分为：通用机床，专门化机床，专用机床。 （2）按机床精度分为：普通机床，精密机床，高精度机床。 （3）按自动化程度分为：一般机床，半自动机床，自动机床。 （4）按重量分为：仪表机床，一般机床，大型机床，重型机床。 （5）按机床主要工作部件数目分为：单刀机床，多刀机床，单轴机床，多轴机床。 （6）按机床具有的数控功能分:普通机床，一般数控机床，加工中心，柔性制造单元等。 12.机床组成：动力源部件，成型运动执行件，变速传动装置，运动控制装置，润滑装置，电气系统零部件，支承零部件，其他装置。
13.机床上的运动：（1）切削运动（又名表面成型运动），包括： 1、主运动使刀具与工件产生相对运动，以切削工件上多余金属的基本运 动。 2、进给运动不断将多余金属层投入切削，以保证切削连续进行的运 动。（可以是一个或几个） （2）辅助运动。分度运动，送夹料运动，控制运动，其他各种空程运动 14.刀具分类： （1）按刀具分为切刀，孔加工刀具，铣刀，拉刀，螺纹刀具，齿轮刀具，自动化加工刀具。 （2）按刀具上主切削刃多少分为单刃刀具，多刃刀具。 （3）按刀具切削部分的复杂程度分为一般刀具，复杂刀具。 （4）按刀具尺寸和工件被加工尺寸的关系分为定尺寸刀具，非定尺寸刀具。 （5）按刀具切削部分本身的构造分为单一刀具和复杂刀具。 （6）按刀具切削部分和夹持部分之间的结构关系分为整体式刀具和装配式刀具。 15.切刀主要包括车刀，刨刀，插刀，镗刀。 16.孔加工刀具有麻花钻，中心钻，扩孔钻，铰刀等。 17.用得最多的刀具材料是高速钢和硬质合金钢。 18.高速钢分普通高速钢和高性能高速钢。 19.高性能高速钢分钴高速钢，铝高速钢，高钒高速钢。 20.刀具的参考系分为静止（标注）角度参考系和工作角度参考系。 21.静止（标注）角度参考系由主运动方向确定，工作角度参考系由合成切削运动方向确定。 22.构成刀具标注角度参考系的参考平面有基面，切削平面，正交平面，法平面，假定工作平面，背平面。
制造技术综合实验 指导书 （机械设计制造及其自动化专业）机汽学院制造工程系
附录一：车刀几何角度测量方法 一、回转工作台式量角台的构造 图1-1为回转工作台式量角台组成原理。底盘1为圆盘形，在零度线左右方向各有1000角度，用于测量车刀的主偏角和副偏角，通过底盘指针2读出角度值；工作台3可绕底盘中心在零刻线左右1000范围内转动；定位块4可在平台上平行滑动，作为车刀的基准；测量 1－底盘、2－工作台指针、3－工作台、4－定位块、 5－测量片、6－大扇形刻度盘、7－立柱、8－大螺帽、 9－旋钮、10－小扇形刻度盘 图1-1 量角台的构造图1-2 测量片 片5，如图1-2所示，有主平面（大平面）、底平面、侧平面三个成正交的平面组成，在测量过程中，根据不同的情况可分别用以代表剖面、基面、切削平面等。大扇形刻度盘6上有正负450的刻度，用于测量前角、后角、刃倾角，通过测量片5的指针指出角度值；立柱7上制有螺纹，旋转升降螺母8可调整测量片相对车刀的位置。 二、测量内容 利用车刀量角台分别测量外圆车刀的几何角度：κr、κr＇、λs、γo、αo、αo ＇等基本角度。记录测得的数据，并计算出刀尖角ε和楔角β。 三、测量方法 1、根据车刀参考平面及几何参数的定义，首先确定参考辅助平面的位置，在按照几何 角度的定义测出几何角度。 2、通过测量片的测量面与车刀刀刃、刀面的贴合（重合）使指针指出所测的各几何角 度。 四、测量步骤 1、测量前的调整：调整量角台使平台、大扇形刻度盘和小扇形刻度盘指针全部指零，使定位块侧面与测量片的大平面垂直，这样就可以认为测量片： 1）主平面垂直于平台平面，且垂直于平台对称线。
四川大学 硕士研究生课程考试试卷 四川大学生命科学学院制 Western blot 摘要：本文主要是针对Western blot的原理及操作进行了简单的阐述，Western 印迹法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。同时对Western blot在实际操作中应注意的细节问题进行了归纳以及与其它免疫技术就抗体检测方面进行了比较。 关键词：Western blot；免疫反应抗体；转膜；显色；蛋白条带 印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Western blot），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
一、Western blot的原理 Western blot的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。Western blot首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。与湿转相比，这种方法要快（15-45 分钟）。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，比如：荧光素异硫氰酸盐标记的二抗（可通过紫外灯产生荧光）；生物素结合的二抗等等。 除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。 在Western blot实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种
第一章机械制造系统和制造技术简介 1.制造系统：制造过程及其所涉及的硬件，软件和人员组成的一个将制造资源转变为产品的有机体，称为制造系统。 2.制造系统在运行过程中总是伴随着物料流，信息流和能量流的运动。 3.制造过程由技术准备，毛坯制造，机械加工，热处理，装配，质检，运输，储存等过程组成。 4.制造工艺过程：技术准备，机械加工，热处理，装配等一般称为制造工艺过程。 5.机械加工由若干工序组成。 6.机械加工中每一个工序又可分为安装，工位，工步，走刀等。 7.工序：一个工人在一个工作地点对一个工件连续完成的那一部分工艺过程。 8.安装:在一个工序中，工件在机床或夹具中每定位和加紧一次，称为一个安装。 9.工位：在工件一次安装中，通过分度装置使工件相对于机床床身改变加工位置每占据一个加工位置称为一个工位。 10.工步：在一个工序内，加工表面，切削刀具，切削速度和进给量都不变的情况下完成的加工内容称为工步。 11.走刀：切削刀具在加工表面切削一次所完成的加工内容。 12.按生产专业化程度不同可将生产分为三种类型：单件生产，成批生产，大量生产。 13.成批生产分小批生产，中批生产，大批生产。 14.机械加工的方法分为材料成型法，材料去除法，材料累加法。 15. 材料成型法是将不定形的原材料转化为所需要形状尺寸的产品的一种工艺方法。 16.材料成型工艺包括铸造，锻造，粉末冶金，连接成型。 17.影响铸件质量关键因素是液态金属流动性和在凝固过程中的收缩性。 18.常用铸造工艺有：普通砂型铸造，熔模铸造，金属型铸造，压力铸造，离心铸造，陶瓷铸造。 19.锻造工艺分自由锻造和模膛锻造。 20.粉末冶金分固相烧结和含液相烧结。 21.连接成型分可拆卸的连接和不可拆卸的连接（如焊接，粘接，卷边接和，铆接）。 22.材料去除成型加工包括传统的切削加工和特种加工。 23.金属切削加工的方法有车削，钻削，膛削，铣削，磨削，刨削。 24.切削运动可分主运动和进给运动。 25.主运动使刀具与工件产生相对运动，以切削工件上多余金属的基本运动。 26.进给运动不断将多余金属层投入切削，以保证切削连续进行的运动。（可以是一个或几个） 27.工件上三个不断变化的表面待加工表面，过渡表面（切削表面），已加工表面。 28.切削要素包括切削用量和切削层的几何参数。 29.切削用量是切削速度，进给量，背吃刀量的总称。 30.切削速度主运动的速度。 31.进给量在主运动一个循环内刀具与工件之间沿进给方向相对移动的距离。 32.背吃刀量工件上待加工表面和已加工表面件的垂直距离。
《机械制造技术基础》实验指导书 机械工程教研室 集美大学机械工程学院
实验须知 实验是获得感性知识，巩固并加深理解课堂讲授的理论，掌握实验操作技术的重要教学环节，为了更好达到上述目的，学生在实验前后必须做到以下各点： 1、每次实验前必须认真预习实验指导书，了解实验目的、要求、工作原理以及实验的步骤和方法。 2、实验时应严格遵守实验室的规章制度及操作规程，不懂之处应主动争取指导，切勿不懂装懂，从而造成不应有的损坏事故。 3、实验必须爱护实验设备、仪器及工卡量具，不许乱摸乱动与本实验无关的设备仪器，不得在实验室游逛及闲谈说笑。 4、实验室当工件安装完毕，开动机床前，须得到指导教师的同意，方可接通电源，开动机床。 5、实验完毕，应将所用工具卡量具及仪器收拾整理好放回原处，并将机床擦拭干净。 6、实验结束后，应在指定时间内交出合乎要求的实验报告，不合格者，将退回重新补做。
实验一车刀几何角度的测量 一、实验目的和要求 1、通过车刀角度的测量，进一步明确各角度的定义； 2、掌握测量车刀几何角度的方法； 3、按1:1绘制外圆车刀工作图，用测量结果标出各角度。 二、实验设备及工具 该车刀量角仪是专供测量车床上各种刀具有关角度使用的量具。该量具主要由五个部分组成，即：如图1所示 1、刀具安放旋转板及测量指针； 2、扇形刻度盘和指针 3、垂直升降杆 4、右侧小刻度盘及指针 5、底座及底座刻度盘 使用时可根据所需测量刀具的角度要求，量得所需测量的角度。 三、仪器使用说明 现以外园车刀为例，说明其具体使用方法如下：测量前，先使量角仪对零，即底座刻度盘上的小指针指向0；同时扇形刻度盘上的指针及右侧刻度盘上的指针均指向0，此时，刀具（杆）的中心线应与扇形刻度盘及指针垂直。 1、测量主偏角 将刀具放在刀具安放旋转板上，刀具侧面紧贴安放旋转板上工字架侧面，位置可调整，转动安放旋转板，使刀具的主切削刃与垂直扇形刻度盘上的指针平面 贴紧，此时观察刀具安装转盘左下方的指针所指底座圆形刻度盘的刻度即为所需
Western bolt 一、实验目的 通过实验了解western blot技术的原理和操作。 二、实验原理 SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。 第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。 化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。 三、实验器材 1.电泳槽，胶板架子 2.转膜仪 3.NC膜 4.电泳电源 5.滤纸 6.摇床 7.X射线摄影暗匣 8.X射线胶片 9.塑料薄膜 四、实验试剂 1.runningbuffer 5xrunningbuffer(1L) Tris 15.1g
名词解释： 1、积屑瘤：在切削速度不高而又能形成连续性切屑的情况下，加工钢料等苏醒材料时，常在前刀面切削处粘着一块剖面呈三角状的硬块，这块冷焊在签到面上的金属称为积屑瘤。 2、刀具磨钝标准：刀具磨损到一定限度就不能继续使用。这个磨损限度称为磨钝标准。国际标准化组织ISO统一规定以1/2背吃刀量处后刀面上测量的磨损带宽度作为刀具的磨钝标准。 3、刀具耐硬度（刀具使用寿命）：刃末好的刀具自开始切削直到磨损量达到磨钝标准为止的净切削时间，称为刀具使用寿命，以T表示。用刀具使用寿命乘以刃磨次数，得到的就是刀具的总寿命。 4、砂轮：砂轮的特性由以下五个因素决定：磨料、粒度、结合剂、硬度和组织。常用的磨料有氧化物系、碳化物系、高硬磨料系三类：粒度表示磨粒的大小程度。结合剂的作用是将磨粒粘合在一起，使砂轮具有必要的形状和硬度。砂轮的强度、耐腐蚀性、耐热性、抗冲击性和告诉旋转而不破裂的性能，主要取决于结合剂的性能。砂轮的硬度是反映磨粒在磨削力的作用下，从砂轮表面上脱落的难易程度。砂轮的组织反映了磨粒、结合剂、气孔三者之间的比例关系。 5、六点定位原理：按一定要求分布的六个支承点来限制工件的六个自由度，从而使工件在夹具中得到正确位置的原理，称为六点定位原理。 6、复映误差：由于工艺系统受力变形的变化而使毛坯的形状误差复映到加工后工件表面的现象，称为误差复映。因误差复映现象而使工件产生加工误差，称为复应误差。 7、工艺系统：机械制造系统中，机械加工所使用的机床、道具、夹具和工件组成了一个相对独立的系统，称为工艺系统。 8、装配：根据规定的技术要求将零件或部件进行配合和联接，使之称为半成品或成品的工艺过程称为装配。 9、机械加工工艺过程是指用机械加工的方法改变生产对象（毛坯）的形状、尺寸和表面质量，使之成为零件的过程。 10、工序：指一个活一组工人，在一个工作地对同一个或同事对几个工件所连续完成的那一部分工艺过程。 11、零件结构的工艺性：指所涉及的零件在能满足使用高要求的前提下制造的可行性和经济性。 12、装配精度：产品设计时根据使用性能要求规定的、装配时必须保证的质量指标。 填空： 1、刀具结构形式：前刀面Ar，主后刀面Aα，副后刀面Aα’，主切削刃S，福切削刃S’，刀尖 2、切削用量三要素：切削速度v 、进给量f（或进给速度vf)和背吃刀量（切削 c 。 深度）a p 3、切削层参数：切削层公称厚度h，切削层公称宽度b，切削层公称截面积A。 4、切削变形程度表示：剪切角、变形系数、剪应变 5、积屑瘤对切削过程的影响：增大前角，增大切削厚度，增大已加工表面粗糙度，影响刀具使用寿命。 6、切屑的基本类型：带状切屑，节状切屑，粒状切屑，崩碎切屑 7、影响切削变形的因素：工件材料，刀具前角，切削速度，切削厚度