AKTA explorer 100蛋白质快速纯化工艺开拓系统使用体会
作者：苏伟明马润娣
来源：《科技创新导报》2011年第06期
摘要:AKTA Explorer 100蛋白质快速纯化工艺开拓系统是美国通用电器公司生产的分离纯化蛋白质以及核酸等生物大分子的装置。我室使用该系统先后分离纯化了福安泰-03和重组福安泰-03,在使用过程中碰到了一些问题并积累了一些经验。
关键词:使用快速纯化开拓系统体会
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)02(c)-0248-01
AKTA Explorer 100蛋白质快速纯化工艺开拓系统是美国通用电器(GE)公司(原瑞典安玛西亚公司)生产的分离纯化蛋白质以及核酸等生物大分子的装置。可以选用离子交换(Ion Exchange,IEX)、凝胶过滤(chromatography Fechange,GF)、疏水相互作用(Hydrophobic Interaction Chromatography media,HIC)、亲和层析(Affinity Chromatography,AC)和反向层析(Reversed Phase Chromatography, RPC)等不同分离原理的柱填料来实现生物大分子的分离纯化。该系统内使用隋性气体管道,环境温和,减少对蛋白质活性的影响。能用于纯化工艺的全新开发和优化工作,该系统能设定方法自动运行,分析纯化通量大,有三个光吸收检测点,分离样品能自动分部收集(流速范围:0.01～100ml/min;UV-900紫外光/可见光检测器,波长范围:190～
700nm;pH/C-900pH/电导检测器,pH范围:2-12;电导范围:1μS/cm～999.9mS/cm;Frac-900组分收集器)。
AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统特点:能够快速大量纯化重组蛋白,并可以进行重组药物蛋白的中试生产,具有自动缓冲液制备;系统配有专家辅助软件,提供系统操作、分离方法、凝胶资料等协助及多个专业纯化方案建议。无论做肽图分析,或是做各种重组蛋白的制备生产,都能满足。我室使用该系统先后分离纯化了福安泰-03[1-3]和重组福安泰-03[4],过程中碰到了一些问题并积累了一些经验。
1 低流速基线上升类似长城垛口不断出现,加大流速基线回复稳定
(1)紫外流通池有小气泡集聚,流通池后连接flow restrictor。用1mol/L NaOH,95%乙
醇,1mol/L醋酸冲洗;
(2)缓冲液没有脱气,缓冲液脱气,缓冲液超声脱气10min;每天关机前,自动清洗1次。
2 裂开的色谱峰
(1)柱头胶与柱头之间有空隙。压紧柱头。
(2)若反相层析出现,可样品缓冲液与A液不同,将样品用A液溶解。
3 在于凝胶过滤层析多次进样
下游纯化最后一步往往用凝胶过滤分子筛去除一些杂蛋白和盐。由于上样量只有1%～5%柱体积,限制了产量,其实真正目标蛋白与杂蛋白在1/3柱体积后才被洗脱,首1/3柱体积的洗脱液将洗脱凝胶介质分子量范围以上的大蛋白,而最后1/3柱体积则洗脱盐等小分子。解决方法:上样5%柱体积样品后洗脱1/3柱体积可以上第二次5%柱体积样品,洗脱3/2柱体积后,上第三次5%样品,可大大缩短纯化时间及增加处理量。
4 pH曲线对pH变化无响应[5]
(1)电极玻璃膜可能破碎。如破碎,更换电极。
(2)pH响应缓慢或不能校准。检查电极玻璃膜。如玻璃膜变干,将电极浸在电极缓冲液中过夜,电极可恢复;如玻璃膜受污染,按照Monitor pH/C-900用户手册4.3节清洗电极。
(3)不正确/不稳定的pH读数。如怀疑流动池有空气,小心轻敲流动池或将流动池倾斜将空气排除。或用缓冲液以20mL/min的速度冲洗流动池30s。在pH电极后使用节流阀FR-902。检查pH电极的校准。
5 泵P-900的问题[6]
(1)在泵头和侧板之间液体泄漏。活塞密封或冲洗膜装配不正确或磨损。如老化,更换活塞密封。
(2)低洗脱液流速和噪声。①按照Pump P-900用户手册4.4节拆卸泵头并当活塞移动时检查活塞弹簧。必要则更换之。②如弹簧腐蚀,检查活塞密封和冲洗膜。确保在用高盐浓度含水缓冲液工作时活塞冲洗系统总在使用。③检查活塞是否损坏,如果损坏按照Pump P-900用户手册4.5节更换活塞。④记住用新的零件更换活塞密封和冲洗膜。
(3)连接器周围泄漏和/或周围有结晶物。拧下连接器,并检查是否损坏或装配不正确。如果损坏则更换连接器;用手指轻轻拧紧连接器。
(4)反常的泵压。检查泵功能,进行压力记录,或通过在UNICORN检查压力。通过观察在Check菜单的活塞冲程指示器和压力迹线,可以找到功能反常的泵头。压力记录不正常的原因,如泵头捕集有空气;连接处泄漏;活塞密封泄漏;检查阀功能不正常。
(5)仪器使用一个月后,要更换在线滤膜,减少柱前压力;