中国修复重建外科杂志2010年10月第24卷第10期
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大鼠端粒酶逆转录酶转染星形胶质细胞培养液对 缺氧缺血神经元的保护作用
段周谨
【摘 要】 目的
屈艺
赵凤艳
唐彬秩 李姣
母得志
端粒酶逆转录酶 （telomerase reverse transcriptase， TERT） 是决定细胞生长与寿命的关键因素， 方法 构建大鼠全长
也与细胞抵制应激和减少凋亡密切相关。通过构建脑神经元体外缺氧缺血再灌注 （hypoxia-ischemia-reperfusion， HI-RP） 模型， 探讨大鼠 TERT 转染星形胶质细胞 （astrocytes， AS）的培养液对 HI 损伤神经元的影响。 TERT 表达质粒 pcDNA3-TERT。取 20 只新生 3 d SD 大鼠处死后取大脑皮层， 分离培养 AS， 通过脂质体介导用 pcDNA3TERT 及 pcDNA3 转染 AS， 作为 pcDNA3-TERT 转染组及 pcDNA3 转染组， 以未转染质粒的 AS（未转染组） 作为对照。 免疫细胞化学染色检测各组 AS 特异性标志物胶质纤维酸性蛋白 （glial ?brillary acidic protein， GFAP） 及目的基因 TERT 的表达。分别收集 pcDNA3-TERT 转染组、 pcDNA3 转染组、 未转染组的 AS 条件培养液 （astrocyte conditioned medium， ACM）分别为 TERT-ACM、 ， p-ACM 及 ACM。取 60 只新生当天 SD 大鼠， 处死后取大脑皮层进行神经元原代培养， 取培 养 8 ～ 9 d 的大鼠神经元随机分为对照组、 ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组及正常组。前 4 组分别于无血清 DMEM 培养基及含 ACM、 p-ACM、 TERT-ACM 的无血清 DMEM 培养基中进行 HI 培养 3 h 后， 再体外模拟 RP 3、 18、 6、 24、 36 h ； 正常组神经元不作处理。采用 MTT 法测定神经元存活率、 比色法测定神经元培养液中乳酸脱氧酶 （loctate dehydrogenase， LDH） 活性、 TUNEL 法检测神经元凋亡情况。 结果 免疫细胞化学染色示， 未转染组、 pcDNA3-TERT 转染组 及 pcDNA3 转染组的 GFAP 阳性细胞百分率分别为 98%、 99%、 98% ； 未转染组与 pcDNA3 组未见 TERT 表达， pcDNA3TERT 转染组 TERT 阳性细胞百分率达 98%。MTT 检测显示， 对照组、 ACM 组、 p-ACM 组及 TERT-ACM 组神经元存活 率均较正常组降低， LDH 活性及 TUNEL 检测凋亡指数均较正常组增高， 其 差异均有统计学意义 （P < 0.05） 。ACM 组、 p-ACM 组与对照组比较， HI 3 h 及 RP 3 h 神经元存活率均增高， 在 LDH 活性及凋亡指数均降低， 差异有统计学意义 （P < 0.05） 但之后各时间点各项指标差异无统计学意义 ； （P > 0.05） 。各时间点 TERT-ACM 组与对照组、 ACM 组和 p-ACM 组 比较， 神经元存活率均增高， LDH 活性及凋亡指数均降低， 差异有统计学意义 （P < 0.05） 各时间点 p-ACM 组与 ACM 组 ； 各项指标比较， 差异均无统计学意义 （P > 0.05） 。 【关键词】 端粒酶逆转录酶 R743.31 结论 经质粒 pcDNA3-TERT 转染 AS 培养液处理的大鼠神经元对 神经元 缺氧缺血 再灌注 大鼠 HI 损伤有更强的耐受性， 转染 AS 培养液可能对 HI 神经元具有保护作用。 星形胶质细胞 文献标志码 ： A 中图分类号 ：Q785
PROTECTIVE EFFECT OF CONDITIONED MEDIUM FROM ASTROCYTES TRANSFECTED WITH TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE ON HYPOXIA-ISCHEMIA NEURONS/DUAN Zhoujin, QU Yi, ZHAO Fengyan, TANG Binzhi, LI Jiao, MU Dezhi. Department of Pediatrics, West China Second Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China. Corresponding author: QU Yi, E-mail: quyi712002@https://www.doczj.com/doc/791026917.html, 【Abstract】 Objective Telomerase reverse transcriptase (TERT) is the key factor to determine cell growth and lifespan. Meanwhile, it is tightly related to resistance of cell to stress and apoptosis. However, up till now little is known about the role TERT plays in nervous system. To investigate the effect of conditioned medium from astrocytes (AS) transfected with TERT on neurons subjected to hypoxia-ischemia-reperfusion (HI-RP) through construction of in vitro HI-RP model of neurons. Methods An eukaryote expression plasmids containing rat full length TERT gene was constructed as pcDNA3TERT. Twenty newborn rats at age of 3 days were sacrificed and their cerebral cortex were collected for isolation and cultivation of AS. Then AS were transfected with pcDNA3-TERT through liposomes mediation, and positive clones were selected by G418 and expanded for continuous culture to establish the plamid pcDNA3-TERT transfection group. Meanwhile, the empty plasmid pcDNA3 transfection group and the non-transfection group were established as control. The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), which was the specific marker of the AS, was detected by immunocytochemistry, as well as the expression of TERT. Astrocyte conditioned medium (ACM) of the plamid pcDNA3-TERT transfection group was collected as TERT-ACM,
30973236、 30770748） 四川省科技厅基金资助项目 基金项目 ： 国家自然科学基金资助项目 （30825039、 ； （08ZQ026-069） 610041） 作者单位 ： 四川大学华西第二医院儿科 （成都， E-mail: quyi712002@https://www.doczj.com/doc/791026917.html, 通讯作者 ： 屈艺， 研究员， 硕士导师， 研究方向 ： 小儿神经系统疾病，
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while the ACM of the empty plasmid pcDNA3 transfection group and the non-transfection group were collected respectively as p-ACM and ACM. Next, 60 rats at age of 1 day were sacrificed and their cerebral cortex were collected for isolation and cultivation of neurons. The neurons were randomly divided into experimental group and normal group, the experimental group were further divided into 4 groups including control group, ACM group, p-ACM group, and TERT-ACM group. The neurons of control group were subjected to HI damage in serum-free DMEM, and the neurons of ACM group, p-ACM group, and TERTACM group were subjected to HI damage in different medium which contained ACM, p-ACM, and TERT-ACM, respectively. After duration of HI for 3 hours under the environment with 5%CO2, 1%O2, and 94%N2; the neurons of experimental groups were placed in CO2 incubator to imitate RP for 3, 6, 18, 24, and 36 hours in vitro. The neurons of normal group were not subjected to HI and RP treatment. During the treatment of HI-RP, the survival ratio of neurons was detected by means of MTT, the lactate dehydrogenase (LDH) activity of neuron medium with LDH detection kit, and the neuronal apoptosis by means of TUNEL. Results The percentages of GFAP positive cells were 98%, 99%, and 98% in non-transfection group, plasmid pcDNA3-TERT transfection group, and plasmid pcDNA3 transfection group, respectively. There was no expression of TERT in no-transfection group and plasmid pcDNA3 transfection group, and the percentage of TERT positive cells in plasmid pcDNA3TERT transfection group was 98%. Compared with normal group, the survival ratio of the neurons in experimental group were significantly decreased (P < 0.05); the LDH activity of neuron medium and the neuronal apoptosis in experimental group were significantly increased (P < 0.05) throughout the duration of HI-RP. Compared with control group, the survival ratio of the neurons in ACM group and p-ACM group were significantly increased (P < 0.05); the LDH activity of neurons medium and the neuronal apoptosis in ACM group and p-ACM group were significantly decreased (P < 0.05) during the early stage of HI-RP (HI 3 hours and RP 3 hours), but at later time points, there was no significant difference in the above indexes (P > 0.05). Compared with control group, ACM group, and p-ACM group, the survival ratio of the neurons were significantly increased (P < 0.05), and the LDH activity of neurons medium and the neuronal apoptosis were significantly decreased (P < 0.05) in the TERTACM group throughout the duration of HI-RP; compared p-ACM group with ACM group, none of the indexes were changed significantly (P > 0.05) throughout the duration of HI-RP. Conclusion Neurons cultured in the conditional medium of the AS transfected with TERT showed stronger tolerability against HI damage ； the conditional medium of AS transfected with so TERT may have protective effect on neurons subjected to HI damage. 【Key words】 Rat Foundation items: National Natural Science Foundation of China (30825039, 30973236, 30770748); Sichuan Science and Technology Department Foundation (08ZQ026-069) Telomerase reverse transcriptase Astrocytes Neuron Hypoxia-ischemia Reperfusion
端粒酶是由端粒酶 RNA 和蛋白质所构成的核糖 核蛋白复合物， 它能以自身 RNA 为模板不断合成端 粒 DNA 并添加到染色体末端， 从而阻止端粒不断缩 短， 进而稳定染色体的长度， 避免细胞因端粒丢失导致 端粒酶逆转录酶 的凋亡 [1-3]。在端粒酶的组成成分中， （telomerase reverse transcriptase， TERT） 是其催化亚基， 也是决定端粒酶活性的关键因素， 对于端粒酶生物学 是决定细胞生长与寿命的关 作用的发挥至关重要 [4-5]， 除了对端粒具有保护作用 键因素 [6-7]。近年研究发现， 外， TERT 还有许多非端粒长度依赖性作用， 这些作用 目前 与细胞抵制应激和减少凋亡密切相关 [8-13]。然而， 对 TERT 在神经系统中的作用了解较少。本实验构建 了大鼠全长 TERT 基因真核表达质粒， 将其转染星形 胶质细胞 （astrocytes， ， AS）获取稳定表达 TERT 基因修 饰的 AS， 并通过体外模拟脑缺氧缺血再灌注 （hypoxiaischemia-reperfusion， HI-RP） 初步探讨 TERT 修饰 AS ， 在保护神经元抵制 HI 脑损伤中的作用。 1 1.1
材料与方法 实验动物及主要试剂、 仪器
新 生 3 d 清 洁 级 SD 大 鼠 20 只， 雄 不 限， 重 雌 体
15 ～ 20 g ； 新生当天清洁级 SD 大鼠 60 只， 雌雄不限， 体重 7 ～ 10 g ； 均由四川大学实验动物中心提供。 胰蛋白酶 （成都哈里公司） DMEM（HyClone 公 ； 司， 美国） FBS（北京元亨金马生物技术有限公司） ； ； Neurobasal Medium、 B27（GIBCO 公 司， 国） 多 聚 美 ； 赖氨酸、 MTT（Sigma 公司， 美国） 质粒提取试剂盒 ； （Qiagen 公司， 德国） FuGENE HD 转染试剂盒、 ； 乳酸 脱氢酶 （lactate dehydrogenase， LDH） 检测试剂盒、 TUNEL 试剂盒 （Roche 公司， 瑞士） 免疫细胞化学试剂盒 ； （北京中杉金桥生物技术有限公司） 质粒 pcDNA3 由 ； 本实验室保 存。 低温常速离心机 （Eppendorf 公 司， 国） CO2 德 ； 恒 温 培 养 箱、 气 培 养 箱 三 （Thermo 公 司， 国） 美 ； DMI4000B 荧光倒置显微镜 （Leica 公司， 德国） 。
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1.2
大鼠全长 TERT 表达质粒的构建 大鼠全长 TERT 基因序列参见 GeneBank（Acces-
组、 ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组及正常组。将 前 4 组神经元用无糖 Earle 液洗 2 次， 然后按照分组加 入不同的培养液 ： 对照组加入 100 μL 无血清 DMEM， ACM 组 加 入 20 μL 无 血 清 DMEM 和 80 μL ACM， p-ACM 组加入 20 μL 无血清 DMEM 和 80 μL p-ACM， TERT-ACM 组 加 入 20 μL 无 血 清 DMEM 和 80 μL TERT-ACM。然后参考文献 [14] 方法进行体外模拟 HI， 即将神经元在 5%CO2、 1%O2 及 94%N2 三气培养 箱中 HI 培养 3 h。再将各组培养液中无血清 DMEM 更换为含 10%FBS 的 DMEM 后， 置于 37℃、 5%CO2 培 养箱中体外模拟 RP 3、 18、 36 h。正常组神经元 6、 24、 不作 HI 及 RP 处理， 并置于含血清 DMEM 中正常培养。 1.6 1.6.1 检测指标 MTT 法测定神经元存活率 对照组、 ACM 组、
sion AY539718）由南京金思特公司合成并克隆至真核 ， 表达质粒 pcDNA3 中， 得到重组质粒 pcDNA3-TERT， 经测序鉴定其序列正确。 1.3 大鼠 AS 培养及质粒转染 取 20 只 新 生 3 d SD 大 鼠， 颈 处 死 后 取 脑 部， 断 剥离大脑皮层， 0.25% 胰蛋白酶消化， 经 以离心半径 10 cm、 000 r/min 离心 5 min 后， 1 制成细胞悬液。以 5 × 10 个 /L 细胞密度接种于预先包被多聚赖氨酸的
8
培养瓶中， 37℃、 于 5%CO2 孵箱中培养 8 d。待细胞 基本融合， 换液后于摇床上振荡 18 h ； 同上法再次行 胰蛋白酶消化及离心后， 制成细胞悬液， 1 × 10 个 /L 以
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细胞密度接种传代。取第 3 代 AS 经胶质纤维酸性 蛋白 （glial ?brillary acidic protein， GFAP）免 疫 细 胞 化学染色鉴定， 其纯度达 98% 以上后， 5 × 10 个细 取
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p-ACM 组 及 TERT-ACM 组 于 HI 3 h 及 RP 3、 18、 6、 24、 h 时， 36 各取 8 孔， 加入 5 g/L MTT 10 μL， 37℃ 于 避光孵育 4 h 后， 完全吸除 MTT， 加入 DMSO 100 μL， 37 ℃ 孵 育 20 min 后 于 560 nm 处 酶 标 仪 读 取 吸 光 度 （A） ； 值 同法检测 12 孔正常组 A 值。计算各组细胞存 活率， 细胞存活率 =（待检测组 A 值 / 正常组 A 值） × 100%。 1.6.2 比色法测定神经元培养液中 LDH 活性 LDH 活性检测参照试剂盒说明书进行。对照组、 ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组于 HI 3 h 及 RP 3、 18、 6、 24、 36 h 时， 各取 8 孔培养基上清， 同上法离心 5 min， 再次 收集上清液 ； 每组各吸取 100 μL 上清液置于 96 孔板， 与 100 μL 试剂盒提供的反应混合液充分混匀， 避光室 温孵育 30 min， 分别于 490 nm 及 690 nm 处酶标仪读 取A值； 同法检测正常组 12 孔神经元培养液的 A 值。 LDH 活性 =A490 － A690。 1.6.3 TUNEL 法 检 测 神 经 元 凋 亡 情 况 对 照 组、 ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组于 HI 3 h 及 RP 3、 6、 18、 24、 h 时， 36 各取 8 孔 参照 TUNEL 试剂盒说 明书进行 TUNEL 检测。4% 多聚甲醛固定爬片， PBS 洗 3 次， 每次 3 min ； 0.2%Triton X-100， 加 冰浴 2 min ； PBS 洗 3 次， 每次 3 min ； TUNEL 反应液， 37℃避 加 于 光孵育 60 min ； 洗 3 次， PBS 每次 3 min ； DAB 染色， 苏 木素复染， 乙醇梯度脱水， 二甲苯透明， 中性树脂封片， 光镜下观察。随机取 10 个视野， 计数细胞核呈棕色 的 TUNEL 阳性细胞， 计算阳性细胞百分率作为凋亡指 数。同法对 12 孔正常组进行 TUNEL 检测。 1.7 统计学方法 采用 SPSS13.0 统计软件包进行分析。数据以均 数 ± 标准差表示， 组间比较采用单因素方差分析， 两两 比较采用 SNK 检验， 值 < 0.05 为有统计学意义。 P
胞接种至 6 孔培养板。待 AS 融合达 80% 时， 取部分 AS 按 FuGENE HD 转 染 试 剂 盒 说 明 书， 真 核 表 达 用 质 粒 pcDNA3-TERT 及 空 质 粒 pcDNA3 转 染 分 别 作 为 pcDNA3-TERT 转染组及 pcDNA3 转染组 ； 另一部 分 AS 不进行转染为未转染组。转染 48 h 后， 用终浓 度为 0.35 mg/mL（通过多次预实验得到的最佳筛选浓 度） G418 进行阳性克隆筛选， 周后得到阳性克隆， 的 2 降低 G418 终浓度至 0.10 mg/mL（根据预实验得到的 能给细胞实施一定筛选压力， 又对细胞生长影响较小 的适宜维持浓度） 并维持， 进行扩增培养。将扩增培养 的 转 染 pcDNA3-TERT 的 AS（5 × 10 个）换 无 血 清
6
培养基培养 18 h， 收集稳定表达 TERT 的 AS 条件培 养液 （astrocyte conditioned medium， ACM） 同上法离 ， 心 15 min， 取上清即为 TERT-ACM。同上法收集未转 染质粒的 ACM 及空质粒 pcDNA3 稳定转染的 ACM （p-ACM） 。用免疫细胞化学法进行 GFAP 检测及目的 基因 TERT 的检测， 光镜下观察。随机选取 10 个视野， 计数细胞核呈棕色的阳性染色细胞， 计算阳性细胞占 总细胞的百分率。 1.4 大鼠神经元分离及纯化 取 60 只新生当天 SD 大鼠， 同上法处死大鼠后剥 离大脑皮层， 0.25% 胰蛋白酶消化后制成细胞悬液， 经 以 1 × 10 个 /L 细胞密度接种于预先包被多聚赖氨酸
9
的 96 孔 培 养 板 中， 100 μL/ 孔， 养 液 为 Neurobasal 培 Medium 和 B27（体积比为 49 ∶ 1） 每 2 天半量换液， ， 7 d 时对培养的细胞行神经元特异性烯醇化酶免疫细 胞化学染色鉴定， 结果显示神经元纯度达 98%。 1.5 大鼠神经元 HI-RP 模型制备及分组 取上述培养 8 ～ 9 d 的大鼠神经元随机分为对照
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意义 （P > 0.05） TERT-ACM 组 A 值均明显高于 ACM ； 2
结果 2.1 AS 基因转染和克隆筛选
质 粒 pcDNA3-TERT 及 空 质 粒 pcDNA3 转 染 AS 后， 胞 有 少 量 死 亡 ； 入 终 浓 度 为 0.35 mg/mL 的 细 加 G418 约 48 h 后， 细胞开始大量死亡。2 周时未转染质 粒的细胞在 G418 作用下全部死亡， 转染质粒的细胞中 有抗性克隆生长。免疫细胞化学染色观察示， 未转染 组、 pcDNA3-TERT 转染组及 pcDNA3 转染组 GFAP 阳 性细胞百分率分别为 98%、 99%、 98%（图 1） 。未转染 组与 pcDNA3 转染组未见 TERT 表达， pcDNA3-TERT 转染组 TERT 阳性细胞百分率达 98%（图 2） 。 2.2 MTT 法测定神经元存活率 正常组 A 值为 0.79 ± 0.04。ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组及对照组与正常组比较， 值均降低， A 差 异有统计学意义 （P < 0.05） 。ACM 组、 p-ACM 组与对 照组比较， HI 3 h 及 RP 3 h 时 A 值有增高， 在 差异有统 计学意义 （P < 0.05）但之后各时间点差异均无统计学 ， 意义 （P > 0.05） TERT-ACM 组与对照组比较， ； 各时间 点 A 值均增高， 差异均有统计学意义 （P < 0.05） 。各时 间点 p-ACM 组与 ACM 组 A 值比较， 差异均无统计学
表1 Tab.1 组别 Group 对照组 Control group ACM 组 ACM group p-ACM 组 p-ACM group TERT-ACM 组 TERT-ACM group
* *
组、 p-ACM 组， 差异有统计学意义 （P < 0.05） 。见表 1。 ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组及对照组存活率 变化趋势与 A 值一致， 见图 3。 2.3 LDH 活性检测 正常组 LDH 活性为 0.14 ± 0.03。对照组、 ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组 LDH 活 性 均 于 RP 3 h 达峰值， RP 18 h 降至最低， 于 之后有升高趋势。ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组及对照组与正常组比较， LDH 活性均增高， 差异均有统计学意义 （P < 0.05） 。 ACM 组、 p-ACM 组与对照组比较， LDH 活性于 HI 3 h 及 RP 3 h 均降低， 差异有统计学意义 （P < 0.05）但之 ， 后各时间点差异均无统计学意义 （P > 0.05） TERT； ACM 组 各 时 间 点 LDH 活 性 与 对 照 组 比 较 均 降 低， 差异有统计学意义 （P < 0.05） 。各时间点 p-ACM 组 与 ACM 组 LDH 活性比较， 差异均无统计学意义 > （P 0.05） ；而 TERT-ACM 组 与 ACM 组、 p-ACM 组 比 较 LDH 活性均明显降低， 差异均有统计学意义 （P < 0.05） 。见表 2。 2.4 TUNEL 法检测神经元凋亡 正常组无明显阳性染色， 凋亡指数为 1.2% ± 0.2%。
各组各时间点 MTT 检测神经元 A 值 （n=8， ± s） x
A values of injured neurons in each group during HI-RP by MTT（n=8， ± s） x RP 3 h 0.41 ± 0.03# 0.49 ± 0.03*# 0.49 ± 0.03*# 0.68 ± 0.04* RP 6 h 0.52 ± 0.04# 0.51 ± 0.04# 0.53 ± 0.04# 0.77 ± 0.03* RP 18 h 0.61 ± 0.04# 0.60 ± 0.04# 0.62 ± 0.04# 0.79 ± 0.05* RP 24 h 0.53 ± 0.04# 0.52 ± 0.03# 0.54 ± 0.04# 0.71 ± 0.03* RP 36 h 0.49 ± 0.03# 0.51 ± 0.03# 0.52 ± 0.03# 0.68 ± 0.05*
HI 3 h 0.38 ± 0.03# 0.46 ± 0.03*# 0.45 ± 0.03*# 0.65 ± 0.04*
# 与对照组比较 P 值 < 0.05， 与 TERT-ACM 组比较 P 值 < 0.05
Compared with control group, P < 0.05; #compared with TERT-ACM group, P < 0.05 表2 Tab.2 组别 Group HI 3 h 0.51 ± 0.05# 0.45 ± 0.04*# 0.44 ± 0.04*# 0.36 ± 0.04* 各组各时间点神经元培养液 LDH 活性检测 （n=8， ± s） x
LDH activity of neurons medium in each group during HI-RP（n=8， ± s） x RP 3 h 0.52 ± 0.04# 0.46 ± 0.05*# 0.46 ± 0.05*# 0.36 ± 0.04* RP 6 h 0.38 ± 0.03# 0.39 ± 0.04# 0.38 ± 0.03# 0.30 ± 0.04* RP 18 h 0.31 ± 0.03# 0.32 ± 0.03# 0.31 ± 0.04# 0.27 ± 0.03* RP 24 h 0.44 ± 0.04# 0.44 ± 0.04# 0.45 ± 0.05# 0.35 ± 0.03* RP 36 h 0.38 ± 0.04# 0.39 ± 0.04# 0.38 ± 0.04# 0.28 ± 0.02*
对照组 Control group ACM 组 ACM group p-ACM 组 p-ACM group TERT-ACM 组 TERT-ACM group
* *
# 与对照组比较 P 值 < 0.05， 与 TERT-ACM 组比较 P 值 < 0.05
Compared with control group, P < 0.05; #compared with TERT-ACM group, P < 0.05
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ACM 组、 p-ACM 组、 TERT-ACM 组及对照组与正常组 比较， 凋亡指数均增高， 差异有统计学意义 （P < 0.05） 。 ACM 组、 p-ACM 组与对照组比较， 凋亡指数在 HI 3 h 及 RP 3 h 均降低， 差异有统计学意义 （P < 0.05）但之 ， 后各时间点差异无统计学意义 （P > 0.05） TERT-ACM ； 组与对照组比较， 各时间点凋亡指数均降低， 差异有统 计学意义 （P < 0.05） 。各时间点 ACM 组与 p-ACM 组
比较凋亡指数， 差异均无统计学意义 > 0.05） TERT（P ； ACM 组与 ACM 组、 p-ACM 组比较， 凋亡指数均明显 降低， 差异有统计学意义 < 0.05） （P 。见表 3、 4。 图 3
讨论
在脑组织中神经胶质细胞数量远多于神经元， 其
中主要是 AS， 除了连接、 支持及固定脑组织外， 还 AS
1a
1b
1c
2a
2b ACM p-ACM TERT-ACM
2c
(%)
100 80 60 40 20 0 HI 3 h RP 3 h RP 6 h RP 18 h RP 24 h RP 36 h
3
4a
4b
图1
4c
b pcDNA3 转染组
4d
c pcDNA3-TERT 转染组
4e
图2 免疫细胞化学
c pcDNA3-TERT 转染组 图 3 MTT 检测各组各时间点神经元存活 1 （× 率 图 4 TUNEL 法检测各组 RP 24 h 时神经元凋亡 400） a 正常组 b 对照组 c ACM 组 d p-ACM 组 e TERT-ACM 组 Fig.1 Expressions of GFAP detected by immunocytochemistry (× 400) a Non-transfection group b Plasmid pcDNA3 transfection group c Plasmid pcDNA3-TERT transfection group Fig.2 Expressions of TERT detected by immunocytochemistry (× 400) a Non-transfection group b Plas-
免疫细胞化学染色观察各组 GFAP 表达 （× 400） a 未转染组 染色观察各组 TERT 表达 （× 400） a 未转染组 b pcDNA3 转染组
mid pcDNA3 transfection group
e
apoptosis of each group detected by TUNEL at RP 24 hours (× 400) TERT-ACM group
c Plasmid pcDNA3-TERT transfection group Fig.3 Survival ratio of neurons during HI-RP a Normal group c ACM group b Control group
Fig.4
1 d
Neuronal
p-ACM group
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表3 Tab.3 组别 Group 对照组 Control group ACM 组 ACM group p-ACM 组 p-ACM group TERT-ACM 组 TERT-ACM group
* *
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各组各时间点神经元凋亡指数 （n=8， x ± s） %，
Neuronal apoptosis in each group during HI-RP（n=8， x ± s） %， RP 3 h 50.0 ± 4.8# 40.0 ± 3.9*# 41.0 ± 3.9*# 31.0 ± 3.1* RP 6 h 36.0 ± 3.0# 37.0 ± 2.8# 35.0 ± 3.1# 22.0 ± 2.2* RP 18 h 29.0 ± 3.1# 29.0 ± 2.8# 30.0 ± 3.3# 21.0 ± 2.2* RP 24 h 53.0 ± 4.5# 52.0 ± 4.6# 53.0 ± 4.2# 32.0 ± 3.5* RP 36 h 45.0 ± 4.2# 45.0 ± 4.5# 46.0 ± 4.2# 26.0 ± 3.0*
HI 3 h 49.0 ± 4.2# 40.0 ± 4.0*# 41.0 ± 3.5*# 30.0 ± 3.1*
# 与对照组比较 P 值 < 0.05， 与 TERT-ACM 组比较 P 值 < 0.05
Compared with control group, P < 0.05; #compared with TERT-ACM group, P < 0.05
可以分泌多种神经营养因子， 调节神经元周围环境， 参 与神经元生长、 发育、 分化、 迁移及功能成熟
[15-18]
导致端粒功能障碍、 生长停滞和复制性衰老。解慧琪 等 [6] 通过用含 TERT cDNA 基因的质粒 pGRN145 体 外转染已趋近复制衰老的人成纤维细胞， 明显延长了 细胞寿命， 说明 TERT 在阻止细胞衰老过程中起关键 作用。近年研究显示， TERT 除参与端粒酶构建调节细 胞寿命外， 还具有许多非端粒酶依赖性生物学效应， 如 参与调控细胞 Ca2+ 分布 [24]、 线粒体功能 [25-26]、 能量代 谢 [27]、 生长因子分泌 [28-30]、 凋亡基因表达 [30-31] 等多种 生物学行为。TERT 主要通过哪种生物学效应调节 AS 功能， 是需要着重探讨的问题。 既往研究表明， 的神经调节作用以保护作用为 AS 主， 表现为 ： ①维持内环境稳定 ： 通过调节离子、 神经递 质及代谢物， 维持中枢神经系统内环境的稳态 [32]。② 维持突触功能， 调节突触可塑性 ： 借助与神经元之间的 双向信号传导， 可诱导突触形成， 改建突触结构， 调节 突触信号传递， 并可反馈调节神经元活动 [33]。③分泌 和抗氧化功能 [34] ： 可分泌产生一系列细胞因子， 如神 经营养因子调节神经发育 ； 中维生素 E 和谷胱甘肽 AS 等含量高， 具有抗氧化功能。虽然 AS 的神经调节作用 表现各异， 但研究发现， 功能调节的关键因素是细 AS 胞内 Ca2+ 浓度， 及谷氨酸、 ATP 等胶质源性神经递质 的摄取与释放 [35]。根据既往研究提示， TERT 在调控 细胞 Ca2+ 分布和跨膜转运中起重要作用 [24，28]， 我们认 为 TERT 可能通过调控 AS 的 Ca2+ 浓度及胶质源性神 经递质的摄取与释放来调节 AS 的功能， 但其具体作用 途径及机制尚需进一步研究。
4 参考文献
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。近
年有研究表明， 在脑缺血性疾病中， 可以通过无氧 AS 代谢产生乳酸供能。摄取过量兴奋性氨基酸、 调节离 子通道以及提供神经营养因子等方式调节神经元胞外 环境， 从而对神经元起保护性作用
[19-21]
。本研究中， 我
们在获取未转染、 pcDNA3 转染及 pcDNA3-TERT 转 染的 AS 培养液前， 采用无血清培养基培养 18 h， 这种 短暂的缺血， 可能刺激 AS 以糖酵解的方式产生并释 放乳酸和能量， 使所收集的培养基中乳酸及三磷酸腺 苷 （adenosine triphosphate， ATP） 增多， 可以为处于 HI 状态下的神经元所利用 ； 同时， 释放的 ATP 及其代 AS 谢产物腺苷， 参与神经网络兴奋性的调节， 可以降低突 触囊泡释放的几率及减少自发性兴奋性突触后电流的 频率
[22]
， 抵制神经元损伤。此外， 有研究发现， 损伤 HI
可以使 AS 上的 L 型电压依赖性钙通道上调， 可能参 与反应性 AS 释放神经营养因子、 细胞因子、 生长因子 等， 增强 AS 对神经元的保护性作用 [23]。本研究结果 显 示， HI 和 RP 早 期 在 （HI 3 h 及 RP 3 h） ACM 组、 ， p-ACM 组受损神经元的 MTT 活性及神经元存活率均 比对照组高， LDH 活性较对照组低， 而 之后以上指标 与对照组比较无明显差异， 这可能与 ACM、 p-ACM 中 含有 AS 代谢产物及分泌物， 如乳酸、 ATP、 神经营养因 子等有关 ； 而在 RP 后期， 随着这些物质的损耗以及神 经元的兴奋毒性损伤加剧， 其保护性作用降低。而在 TERT-ACM 组各时间点受损神经元的存活率均比对照 组、 ACM 组及 p-ACM 组高， 提示除了以上保护性因素， 稳定转染了大鼠 TERT 基因的 AS 还存在其他神经保 护机制， 这些机制与 TERT 的生物学功能相关。 作为端粒酶的催化亚基， TERT 最经典的功能是 参与端粒酶的激活， 通过端粒保护作用延长细胞寿命。 正常人体细胞中端粒随着细胞生长不断缩短， 并最终
中国修复重建外科杂志2010年10月第24卷第10期
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（本文编辑 ： 刘丹）
小鼠神经小胶质细胞 小鼠神经小胶质细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠神经小胶质细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠神经小胶质细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠神经小胶质细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠神经小胶质细胞 2、组织来源：小脑组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠神经小胶质细胞细胞简介： 小鼠神经小胶质细胞分离自正常小鼠小脑组织，主要功能： （1）神经胶质出现在大脑发育早期向成熟阶段转化的过程中。 （2）当程序性细胞死亡时，或在大脑发育的过程中，中枢神经系统受损或受到病理损坏时，神经胶质可做为大脑的巨噬细胞。 （3）胶质细胞能在II类组织相容性复合体表达CD4阳性T细胞时表达抗原，能进行Fc介导的巨噬作用，并且与造血细胞和巨噬细胞组织共享抗原。 本公司生产的小鼠神经小胶质细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯
缺氧类型及影响缺氧耐受性的因素 一、实验目的： 复制不同类型的缺氧模型，观察不同类型缺氧时呼吸变化规律和皮肤黏膜颜色的变化特点；观察中枢神经系统功能状态不同、外界环境温度不同及年龄不同对缺氧耐受性的影响；了解临床应用冬眠及低温疗法的意义；掌握对照实验和控制实验条件重要性。 二、实验材料： 18～22g小鼠，新生鼠；500Iml广口瓶（带有橡皮管及橡皮塞）2个， 1ml注射器（配针头），剪刀，镊子。钠石灰，氯丙嗪，生理盐水，亚硝酸钠溶液，亚甲蓝，冰。 三、实验方法： 1. 乏氧性缺氧（氯丙嗪处理） i.取2只小鼠，观察正常呼吸频率(次/10s)，并注意其呼吸深度。 观察活动等一般情况及耳、尾、口唇的颜色。取两只小鼠，标 记为A、B，分别按0.1ml/10g腹腔注射氯丙嗪和生理盐水,之 后将小鼠 A只放入冰块上10～15min。 ii.将2个广口瓶口瓶塞所连的移液管分别插入2个大量筒a、b中，记录液面最低点数据va1, vb1。a广口瓶加入钠石灰，b 广口瓶加入等量的钠石灰,待A鼠进入冬眠期时，将两只小鼠 分别同时放入广口瓶a、b中，插塞紧橡皮塞。记录量筒液面 下降量及小鼠的反应状况和存活时间。 2 亚硝酸钠中毒
i.取小白鼠2只，观察正常呼吸频率及皮肤黏膜颜色后，分别向 腹腔内注射50g/L亚硝酸钠0.2ml，其中1只在注射亚硝酸钠后，立即腹腔注射10g/l亚甲蓝0.2ml，另一只注入生理盐水 0.2ml作为对照。 ii.记录小鼠存活时间，小鼠猝死后解剖小鼠尸体，取出肝脏至于滤纸上，观察记录2只小鼠血液、肝脏的颜色。 四、实验结果： 1.实验数据 乏氧性缺氧： va1=61 ml， va2=56ml vb1=58ml，vb2=40 ml va1- va2=5 ml vb1- vb2=18 ml ta=27min tb=16min 小鼠A总耗氧量：R=耗氧量/存活时间/存活时间=0.0076 小鼠B总耗氧量：R=耗氧量/存活时间/存活时间=0.040 小鼠缺氧后皮肤粘膜的颜色：青紫色（紫绀） 2. 亚硝酸钠中毒： 小鼠亚硝酸钠中毒后，血液、肝脏颜色变为咖啡色；另一只小鼠用亚甲蓝解救后，血液、肝脏颜色仍为红色。 小鼠缺氧后皮肤粘膜的颜色：咖啡色
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
缺氧的类型及影响缺氧耐受性的因素试验的讨论问题1
缺氧的类型及影响缺氧耐受性的因素试验的讨论问题小组成员： 1、请给出本实验的五个关键词 缺氧氯丙嗪总耗氧率CO 亚硝酸盐美兰存活时间 2、请指出临床上常用的血氧指标及其意义 ①血氧分压PO2：又称血氧张力，血液中物理溶解的氧越多，血氧分压越高。动脉血氧分压取决于吸入气体的氧分压和外呼吸的功能状态，正常约为100mmHg；静脉血氧分压反映内呼吸状态，正常约为40mmHg。 ②血氧容量CO2max：100ml血液中的血红蛋白完全氧合后的最大带氧量，取决于血液中血红蛋白的量及其与氧结合的能力。 ③血氧含量CO2：100ml血液中实际含有的氧量，包括物理溶解的和与Hb结合的氧量。正常动脉血氧含量约为19ml/dl，静脉血氧含量为14ml/dl，动静脉血氧含量差约为5ml/dl（反映组织从单位容积血液内摄取氧的多少）。 ④血氧饱和度SO2：Hb结合氧的百分数，约等于血氧含量/血氧容量。正常动脉血氧饱和度为95%~98%，静脉血氧饱和度为70%~75%。
6、低张性缺氧的原因与发病机制是什么？血氧变化有何特点？ 原因：吸入气氧分压过低、外呼吸功能障碍、静脉血分流。 发病机制：动脉血氧分压和血氧含量过低，血液中脱氧血红蛋白浓度增高，出现发绀症状。 动脉血氧分压、血氧含量及氧饱和度均降低。 7、血液性缺氧的原因与发病机制是什么？血氧变化有何特点？举例？ 原因：血红蛋白含量减少或性质改变 发病机制：血红蛋白数量减少，血氧容量和血氧含量降低，毛细血管床中的平均血氧分压较低，血氧不易时放入组织。 血氧含量和血氧容量降低，血氧饱和度正常，动静脉血氧含量差减小。 8、循环性缺氧的原因与发病机制是什么？血氧变化有何特点？ 原因：全身性或局部性血液循环障碍 发病机制：组织血流量减少引起组织供氧不足。 动静脉血氧含量差增大。
\篇二：缺氧 缺氧动物模型复制及中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 【摘要】目的：本实验学习复制乏氧性缺氧和血液性缺氧的动物模型方法，观察缺氧过程中呼吸的反应及血液色泽和全身一般情况的变化，并了解温度和中枢神经系统机能状态对缺氧耐受的影响以及对照实验和控制实验条件重要性。方法：通过复制缺氧动物模型，观察不同类型缺氧过程中呼吸、黏膜和血液色泽的变化。通过测定耗氧量和小鼠的存活时间来观察中枢神经系统机能抑制和低温对缺氧的影响。结果：中枢神经系统功能抑制和低温对动物耐受缺氧的影响与对照组相比，存活时间和总耗氧率有显著性差异；复制不同原因造成的不同缺氧类型小鼠都表现出了不同的呼吸频率和存活时间的变化。结论：给小鼠注射氯丙嗪、冰浴降温可显著降低总耗氧率，延长其存活时间（p<0.01）。co中毒、亚硝酸盐可显著缩短小鼠存活时间，降低呼吸频率。美兰可以缓解亚硝酸盐对小鼠的作用，已定程度延长小鼠存活时间，延缓呼吸频率的下降。 【关键词】缺氧氯丙嗪总耗氧率 co 亚硝酸盐美兰存活时间 当供应组织的氧不足，或组织利用氧障碍时，机体的机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧。根据缺氧的原因不同可将缺氧分为低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型，不同类型的缺氧，机体的代偿适应性反应和症状表现有所不同。 1.材料和方法 1.1实验动物：小白鼠（雌性）。 1.2 药品：氯丙嗪(chlorpromazine) 、钠石灰（soda lime)，亚硝酸钠（ sodium nitrite ) 、亚甲基蓝(美蓝）（methylene blue，mb）、 0.9％nacl (physiological saline solution) 、co(carbon monoxide)。 1.3 器材：100、500ml广口瓶和测耗氧装置。 1.4 方法 1.4.1 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 取2只性别相同体重相近的小鼠，准确称取体重，并随机分为生理盐水组和氯丙嗪组。氯丙嗪组按0.1ml/10g体重腹腔注射0.25％氯丙嗪，随即安放在冰浴的纱布上 10~15min，使呼吸频率降至70~80次/min；生理盐水组按0.1ml/10g体重腹腔注射生理盐水，室温放置10－15min，作为对照。之后将2只小鼠分别放入100ml的广口瓶内，连接好测耗氧装置。如右图。 1.4.2 不同原因造成的缺氧 取2只性别相同体重相近的小鼠随机分为乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组。乏氧性缺氧组小鼠放入含有5g钠石灰的100ml密闭瓶中；一氧化碳中毒组小鼠放入500ml密闭瓶，注入10ml co气体。 另取2只性别相同体重相近的小鼠随机分为亚硝酸纳组和亚硝酸纳治疗组。亚硝酸纳组小鼠腹腔注射50g/l亚硝酸纳0.2ml，并随即腹腔注射生理盐水0.2ml；亚硝酸纳治疗组小鼠腹腔注射50g/l亚硝酸纳0.2ml后即刻腹腔注射10g/l亚甲基蓝0.2ml 。 2.观察项目 2.1 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧的影响 记录下小鼠的体重w（g）。从密闭测耗氧装置开始记时到小鼠死亡，分别观察氯丙嗪组和生理盐水组小鼠的存活时间t（min）、总耗氧量a（ml）。按以下公式计算出总耗氧率r[ml/（g·min）]： r[ml/（g·min）]= a（ml）÷w（g）÷t（min） 2.2 不同原因造成的缺氧 乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组：处理前分别测出两鼠的正常呼吸频率（次/min）。待塞
大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。 1.实验材料 剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、 恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO 2 置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等 2.实验步骤 2.1小胶质细胞的混合培养 取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO 恒温细胞培养箱( 37 2 度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。 2.2小胶质细胞的分离和纯化 细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。离心管配
缺氧及影响机体对缺氧耐受性的因素 【摘要】目的：研究温度、中枢神经系统机能状态对乏氧性缺氧小鼠缺氧耐受性的影响以及美兰对亚硝酸钠中毒的血液性缺氧小鼠的影响。方法：小鼠编号1,2分别腹腔注射生理盐水和室温放置10min、0.25%氯丙嗪和低温放置10min，然后分别放入缺氧瓶内，记录小鼠存活时间并测定总耗氧量；小鼠编号3,4分别腹腔注射5%亚硝酸钠溶液0.2ml+生理盐水0.2ml、5%亚硝酸钠溶液0.2ml+1%美兰溶液0.2ml，记录小鼠存活时间及皮肤黏膜颜色脏器变化。结果：2号小鼠存活时间达22.20min未死亡，总耗氧量2.9ml，比1号存活时间长耗氧量少；3号小鼠出现亚硝酸钠中毒，8.32min后死亡，4号小白鼠亚硝酸钠中毒症状缓解，22.20min内未死亡。结论：温度、中枢神经系统机能状态使乏氧性缺氧小鼠缺氧耐受性增强；美兰能治疗亚硝酸钠中毒的血液性缺氧小鼠。 【关键词】缺氧；氯丙嗪；亚硝酸钠；美兰 [Abstract] Objective: To study the influence of temperature, the central nervous system function state of hypoxic hypoxia mouse hypoxia tolerance in mice and methylene blue blood hypoxia sodium nitrite poisoning. Methods:. Methods: mice were numbered 1,2 intraperitoneal injection of normal saline and 10min at room temperature, low temperature 0.25% chlorpromazine and placed 10min, and then placed in hypoxic bottle, record the survival time of mice and determination of total oxygen consumption; mice numbered 3,4 respectively by intraperitoneal injection of 5% sodium nitrite solution 0.2ml+ 0.2ml of physiological saline, 5% sodium nitrite solution 0.2ml+1% methylene blue solution 0.2ml record the survival time of mice, and skin and mucous membrane changes color organ. Results: 2 the survival time of mice was 22.20min not death, total oxygen consumption 2.9ml, long oxygen consumption less than No. 1, No. 3 mice survival time; sodium nitrite poisoning, 8.32min after death, sodium nitrite 4 mice poisoning symptoms, not died within 22.20min. Conclusion: temperature, central nervous system function state of the hypoxic hypoxia mice hypoxia tolerance enhancement; Meilan can treat mice blood hypoxia sodium nitrite poisoning. [keyword] hypoxia; chlorpromazine; sodium nitrite; methylene blue 【引言】氯丙嗪是中枢多巴胺受体的阻断剂，具有镇静、抗精神病、镇吐、降低体温及基础代谢、α-肾上腺素能受体及m-胆碱能受体阻断、抗组织胺、影响内分泌等作用，临床用于控制精神分裂症或其它精神病的躁动、紧张不安、幻觉、妄想等症状；治疗各种原因引起的呕吐；与镇痛药合用，治疗癌症晚期病人的剧痛多巴胺受体阻断剂，低温环境能降低机体的代谢率，但低温环境下氯丙嗪引起的中枢神经系统机能状态对乏氧性缺氧机体的缺氧耐受性的影响及相关研究未见报道，值得研究[1]。亚硝酸钠是工业用盐，具有很强的氧化性，可使血液中的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，失去运输氧的能力而引起组织缺氧性损害。美兰溶液具有一定的抗氧化作用，但其能否缓解亚硝酸钠中毒仍未见报道，本课题组将对其进行进一步的研究。 【材料和方法】 一、材料 1.1器械：鼠笼、电子称、1ml注射器、集气瓶、100ml量筒、1000ml烧杯、计时器、 木塞、橡胶导管、剪刀和镊子 1.2药品或试剂：0.25%氯丙嗪溶液、5%亚硝酸钠溶液、1%美兰溶液、碱石灰固体、生
小胶质细胞原代培养 时间：15天 试剂： 出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠（斯莱克）9只 DF12培养基（GIBCO，C11330）90ml 胎牛血清（FBS）(10%) （GIBCO，10099）5ml 解剖液50ml 1 x胰蛋白酶(0.25%)（Gibco，25200-072）10ml 10mg/ml DNA酶70ul 75%酒精200ml 器材： 酒精棉球1杯（20个） 装有75%酒精的敞口容器1个 原代解剖器械盒（2把中号镊子，1把中号剪刀，1把眼科弯镊，1把眼科直镊，1把眼科剪，2把显微镊，1把显微剪） 洗净消毒后小瓶3个（带盖子） 小平皿4个（带盖子） 解剖镜+冷光源 消毒后卫生纸12张 1ml移液器1把+枪头1盒 10ml玻璃离心管3个 T75大培养瓶3个 消毒后吸管3根 紫外消毒白大褂1件 试剂配制： 中和胰蛋白酶用的完全培养基：DF12 45ml和FBS 5ml混合而成。 步骤： 1、取出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠9只，泡在酒精中消毒后取出大脑，置于放有解剖液的小平皿中，在解剖镜下剥离血管膜 关键：注意无菌操作；剥离血管膜要完全 2、将剥离完血管膜的大脑放入预置有1ml解剖液的青霉素小瓶中，用显微剪剪碎（<1mm3）关键：剪碎效果较用枪头吹吸好，要剪得尽量碎 3、加入两滴DNA酶和1ml胰酶（胰酶终浓度为0.125%），于37℃孵箱中孵育15分钟 关键：每5分钟可略微晃动一下以助于消化 4、取出小瓶，将液体倒入离心管中，加5ml完全培养基，离心（1000rpm*5分钟），取出离心管，吸出上清，再加入5ml无血清培养基，吹打后静置沉降20分钟，将上清用吸管吸出，加入T 75大培养瓶中，放入孵箱中培养，3小时后换液。 关键：静置沉降后吸取上清液时吸取中层（最上层和最下层均不要），避免杂质吸入培养瓶中
机能学实验报告 缺氧的类型及影响缺氧耐受性的因素 摘要： 【目的】：复制不同类型缺氧模型，观察不同类型缺氧时呼吸节律变化规律和皮肤黏膜颜色的变化特点；观察中枢神经系统功能状态不同、外界环境温度不同及年龄不同对缺氧耐受性的影响；了解临床应用冬眠及低温疗法的意义；掌握对照实验和控制实验条件重要性。【方法】：乏氧性缺氧中，分别注射生理盐水和氯丙嗪作为对照，计算耗氧量。亚硝酸钠中毒中，注射亚硝酸钠溶液后，分别注射生理盐水和美蓝作为对照，取肝脏观察血液颜色。【结果】：甲（实验组）耗氧率R=A/W*t=0.0214;乙（对照组）耗氧率R=A/W*t=0.0427。亚硝酸钠中毒：甲组小鼠肝脏颜色：鲜红色; 乙小鼠肝脏颜色：棕褐色。 【结论】：氯丙嗪可缓解缺氧，小鼠存活时间更长；美蓝可解救小鼠亚硝酸钠中毒。 关键词：乏氧性缺氧；亚硝酸钠中毒；温度 引言：当供应组织的氧不足，或组织利用氧障碍时，机体的机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称之为缺氧。缺氧是多种疾病共有的病理过程。许多原因都能使机体发生缺氧。不同类型的缺氧，其机体的代偿适应性反应和症状有所不同。 1、材料 1.1 实验对象：18~22g小鼠，新生鼠；
1.2 器材：生物信号采集处理系统，高灵敏压力换能器；500Iml 广口瓶（带有橡皮管及橡皮塞）2 个，1ml 注射器，剪刀，镊子； 1.3 实验试剂：氯丙嗪；生理盐水，亚硝酸钠溶液，美蓝，冰块。 2、方法 2.1 乏氧性缺氧 1.1.1取两只老鼠先编号，再进行称重，并记下数据。 2.1.2对1号鼠按0.1ml/10g进行腹腔注射氯丙嗪，注射完后冰浴10~15分钟，而对4号鼠则腹腔注射相同量的生理盐水，并将它放在室温下10~15分钟。时间到后，将两只老鼠放入500ml广口瓶内，塞进瓶塞，并将移液管放入盛满水的量筒内计入当时的液面高度数据。 2.1.3实验观察观察皮肤黏膜颜色变化，呼吸频率的快慢，活动强度，至小鼠死亡，记录其存活时间。并读取液面变化量即耗氧量。解剖小鼠尸体，记录肝脏、肺、血液颜色变化。 2.1.4总耗氧量计算根据A（ml），存活时间T（min），鼠体量W（g）三项指标，求出总耗氧量。 2.2 亚硝酸钠中毒 2.2.1取性别相同，体重相近的鼠2只，进行编号，并观察皮肤黏膜色泽。 2.2.2向两只老鼠均注射0.2mlNaNO2,注射完后，立即向2号鼠腹腔内注射美兰溶液0.2ml,向3号老鼠注射相同量的生理盐水作为实验组。 2.2.3 3号鼠死亡后，迅速取肝，观察肝的血液颜色；对2号鼠迅速处死，取肝，并观察肝的血液颜色。
缺氧的类型及影响缺氧耐受性的因素 高伟飞 （浙江中医药大学滨江学院10级临床专业临滨1班4组20102090114） 一、实验目的： 1.观察原因和条件在疾病发生发展中的作用 2.复制几种类型缺氧的模型，观察血液颜色的特点，分析其机制 根据大纲要求： 掌握概念：缺氧、低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织性缺氧，紫绀、肠源性紫绀。 熟悉并理解原因和条件在疾病发生发展中的作用。 熟悉反映血氧情况的一些指标(氧分压、氧含量、氧容量、氧饱和度，动静脉血氧含量差)。 掌握各型缺氧发生的原因及主要发病机制，掌握各型缺氧的特征（血氧变化的特点和皮肤黏膜颜色变化）。 二、实验原理： 当组织供应组织的氧不足，或组织利用氧障碍时，机体的机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧。不同类型的缺氧，其机体的代偿适应性反应和症状也不同。根据缺氧原因不同可将缺氧分为乏氧性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型。 影响机体对缺氧耐受性的因素很多，如年龄、机体的代谢、功能状况以及锻炼适应等。本实验才缺氧的不同环节入手观察呼吸变化及皮肤黏膜的颜色改变。实验通过动物的不同代谢状况、中枢神经系统功能和动物所处环境温度，观察动物的缺氧耐受性。 三、实验对象：小鼠 四、实验材料：电子秤、注射器、钠石灰、广口瓶、测耗氧量装置、剪刀、镊子、滤纸；生理盐水、美兰亚硝酸钠、氯丙嗪、冰块、量筒等 五、实验方法： 1、取2只小鼠，注射及处理： 1号：亚硝酸钠及美兰0.2ml ，左下腹注射 2号：亚硝酸钠及生理盐水各0.2ml ，左下腹注射 注射完，观察，2号小鼠立即死亡，1号小鼠仍存活；然后处死解剖，剪下一片肝脏组
大鼠视神经切断后视网膜Muller 细胞及小胶质细胞变化特点 唐茂丹1），陈家波1），孙永芳1），童世琼1），武丽红2），吴春云2 ）（1）昆明医学院05级临床医学（眼视光学专业）；2）组织胚胎学教研室，云南昆明 650031） ［摘要］目的观察视网膜M uller 细胞和小胶质细胞在大鼠视神经切断后的变化特点．方法应用大鼠视 神经完全横断模型，随机分为术后1d 、3d 、7d 、14d 4个损伤组和假手术组（ 每组n ＝5）；分别用M uller 细胞和小胶质细胞特异性标记物谷氨酰胺合成酶（GS ）和OX-42，进行免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP ）法染色，以显示视网膜M uller 细胞和小胶质细胞的变化．结果在视神经切断后，大鼠视网膜M uller 细胞GS 阳性产物立即增粗、深染，并与周围细胞紧密联系在一起，3d 达高峰，14d 明显减弱；小胶质细胞OX-42的阳性产物表达在视神经切断后7d 明显增强，14d 达高峰．结论 视神经切断后大鼠视网膜 M uller 细胞反应性增生，小胶质细胞被激活，但反应高峰晚于M uller 细胞，其作用有待进一步研究． ［关键词］视神经切断；M uller 细胞；小胶质细胞；大鼠 ［中图分类号］R774；R779.12［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2010）01－0001－05 Immunohist ochemical St udy of Muller Cells and Micr oglia Cells Responses t o Opt ic Ner ve Tr ansect ion in Rat s TANG Mao －dan 1），CHEN Jia －bo 1），SUN Yong －fang 1），TONG Shi －qiong 1） ， WU Li －hong 2），WU Chun －yun 2 ） （1）2005Year of Clinical Medicine （Ophthalmology and Optometry ）；2）Dept.of Histology and Embryology ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To study features of the retinal M uller cells and microglia cells in rats after optic nerve transection ．Methods We built the optic nerve transection model which was randomly divided into five groups ：four injury groups （n ＝5in each group ：the 1，3，7，and 14day groups post optic nerve injury ），control group （n ＝5）．Then we observed the changes of M uller cells and glial cells which is immunohistochemically streptavidin-perosidase stainned by using anti-GS （glutamine synthetase ）and anti-OX-42antibody （amoeba-like glial cell line-specific marker ）．Results The expression of （GS ）-immunoreaction （GS-IR ）increased significantly compared to the control group ．The most significant change occurred in the 3-day group ．the expression of GS-IR had a descending tendency in the 7-day and 14-day groups compared to the 3-day group ．And immunoreaction of 0X-42increased significantly compared to the control group ，at day 7post-axotomy were markedly expressed ，and in 14day group reached the peak ．Conclusions Rat retinal M uller cells are reactive gliosis after optic nerve transection and have roles of protecting the retinal neurons and repairing the injury retina ；The response of microglial cell are the same as M uller cells basically with the exception 昆明医学院学报2010，（1）：1～4Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R ［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30760093） ［作者简介］唐茂丹（1985～），女，云南昆明市人，在读本科生，昆明医学院2005级临床医学（眼视光学专业）.［通讯作者］吴春云．E-mail:wuchunyunkm@https://www.doczj.com/doc/791026917.html,
缺氧的类型和影响缺氧耐受性的因素 一、实验目的 （1）通过复制不同类型缺氧，了解缺氧的分类原则。 （2）观察不同类型缺氧时的表现以及呼吸节律和皮肤粘膜颜色的变化规律 二、观察指标 动物一般状况，呼吸频率和深度，存活时间，皮肤粘膜和肝脏颜色改变 三、方法与步骤 （一）乏氧性缺氧 1. 取钠石灰少许（约5g）和1只小鼠放入密封广口瓶内，观察和记录动物缺氧前的一般状况、呼吸频率（次/10s）和深度、皮肤和口唇颜色。随后塞紧瓶塞，记录时间，每3min重复观察上述指标1次，如有其他变化，随时记录，直至动物死亡。 2. 动物尸体留待其他缺氧实验完成后，再依次打开腹腔，观察和比较血液和肝脏颜色。（二）血液性缺氧 1．一氧化碳中毒性缺氧：准备一氧化碳发生装置。将1只小鼠放入广口瓶中，观察其正常表现后与一氧化碳发生装置连接。用刻度吸管取甲酸3ml放于试管内，沿试管壁缓慢加入浓硫酸2ml，塞紧（可用酒精灯稍加热，加速CO的产生，但不可过热，以免液体沸腾。如果CO产生过多过快，则动物迅速死亡，而血液颜色改变不明显）。观察指标与方法同上。 2．亚硝酸钠中毒性缺氧：选取体重相近的小鼠2只，观察正常指标。分别通过腹腔注射5％亚硝酸钠0.3 ml，随后立即取其中 1只动物腹腔内注入 l％亚甲蓝溶液0.3 ml，另 1只立即注入生理盐水 0.3 ml；观察指标方法同上。比较 2只小鼠的表现及死亡时间。 （三）氰化物中毒性缺氧 （1）取小鼠 1只，观察正常指标后，腹腔注射0.l％氰化钾 0.2 ml。 （2）观察2只小鼠上述指标的变化及死亡时问。 1、将测氧瓶内空气容积装置的全部管道充满水，并向量筒加水至刻度， 2、将缺氧瓶上的两橡皮管全部打开，其中之一与装置相连， 3、装置内水因虹吸作用吸入缺氧瓶内，待瓶内全部充满水时，立即夹紧装置的弹簧夹， 4、读出量筒上液面下降的毫升数，即为缺氧瓶内的空气容积。 药品：钠石灰（NaOH·CaO） 1%咖啡因（小剂量能提高大脑皮质的兴奋性，振奋精神，减 少疲劳。大剂量则有兴奋延脑呼吸中枢及血管运动中枢的作用，对抗中枢性抑制。小鼠腹腔 注射1%咖啡因0.1ml/10g） 0.25%氯丙嗪 (有镇静、抗精神病、镇吐、降低体温及基础代谢、 阻断α-肾上腺素能受体及M-胆碱能受体、抗组胺及影响内分泌等作用。抑制体温调节中枢， 在物理降温及其它药物配合下可使体温降至正常以下，此时器官活动减少，组织代谢及耗氧
缺氧的类型及影响缺氧耐受性的因素试验的讨论问题 小组成员： 1、请给出本实验的五个关键词 缺氧氯丙嗪总耗氧率 CO 亚硝酸盐美兰存活时间 2、请指出临床上常用的血氧指标及其意义 ①血氧分压PO2：又称血氧张力，血液中物理溶解的氧越多，血氧分压越高。动脉血氧分压取决于吸入气体的氧分压和外呼吸的功能状态，正常约为100mmHg；静脉血氧分压反映内呼吸状态，正常约为40mmHg。 ②血氧容量CO2max：100ml血液中的血红蛋白完全氧合后的最大带氧量，取决于血液中血红蛋白的量及 其与氧结合的能力。 ③血氧含量CO2：100ml血液中实际含有的氧量，包括物理溶解的和与Hb结合的氧量。正常动脉血氧含量约为19ml/dl，静脉血氧含量为14ml/dl，动静脉血氧含量差约为5ml/dl（反映组织从单位容积血液内摄取氧的多少）。 ④血氧饱和度SO2：Hb结合氧的百分数，约等于血氧含量/血氧容量。正常动脉血氧饱和度为95%~98%，静脉血氧饱和度为70%~75%。 ⑤氧解离曲线：PO2与SO2之间的关系曲线，S型。血氧饱和度变小，氧解离曲线右移。 ⑥P50：血氧饱和度为50%时的血氧分压，反映Hb与氧的亲和力。 3、影响机体缺氧耐受性的因素有哪些？ 年龄、身体机能和代谢状态、营养、锻炼等都是影响机体缺氧耐受性的因素。总的来说就是耗氧过大（供氧不足）及用氧障碍两点。 4、请简要归纳缺氧时机体功能代谢的变化。 急性缺氧由于机体来不及代偿而较易发生功能代谢障碍，慢性缺氧时通常既有代偿性反应又有损伤性反应。呼吸系统主要是代偿性肺通气量增加；循环系统主要是心排出量增加、血流重新分布、肺血管收缩和毛细血管增生；血液系统主要是红细胞增多、向组织释氧能力增强；神经系统会出现意识模糊甚至丧失；细胞、组织主要是对氧的摄取和利用能力增强 5、缺氧可以分为哪几种类型？ 血液性缺氧、低张性缺氧、循环性缺氧、组织性缺氧。 6、低张性缺氧的原因与发病机制是什么？血氧变化有何特点？ 原因：吸入气氧分压过低、外呼吸功能障碍、静脉血分流。 发病机制：动脉血氧分压和血氧含量过低，血液中脱氧血红蛋白浓度增高，出现发绀症状。 动脉血氧分压、血氧含量及氧饱和度均降低。 7、血液性缺氧的原因与发病机制是什么？血氧变化有何特点？举例？ 原因：血红蛋白含量减少或性质改变 发病机制：血红蛋白数量减少，血氧容量和血氧含量降低，毛细血管床中的平均血氧分压较低，血氧不易时放入组织。 血氧含量和血氧容量降低，血氧饱和度正常，动静脉血氧含量差减小。 8、循环性缺氧的原因与发病机制是什么？血氧变化有何特点？ 原因：全身性或局部性血液循环障碍 发病机制：组织血流量减少引起组织供氧不足。
小胶质细胞与相关疾病的研究现状 摘要：大脑由神经胶质细胞和神经元两类细胞组成。胶质细胞占全部脑细胞的比例随着生物进化程度的升高而增高。在果蝇胶质细胞约占脑细胞的25%，而在人类则占90%，提示其对脑高级功能可能具有重要作用。神经胶质细胞广泛分布于周围和中枢神经系统中，数量远远超过神经元，约为神经元的数十倍[1]。小胶质细胞（miroglia，MG)是胶质细胞的一种，为中枢神经系统中的免疫细胞，是中枢神经系统抵抗病原体入侵的第一道防线。当病原微生物进入脑组织后，小胶质细胞迅速做出反应，识别、吞噬病原微生物，呈递抗原和分泌多种生物活性物质。目前对于小胶质细胞的功能及调节机制研究较多，但是在其对疾病的研究中还不系统。本文将对其在疾病中的功能的研究进展作一综述，为进一步的研究作参考。 关键字：小胶质细胞，神经退行性疾病，中枢神经系统病毒感染 中枢神经系统（central nervous system,CNS）由神经元和神经胶质细胞所组成。神经胶质细胞的数量为神经元数量的 10倍以上,小胶质细胞占神经胶质细胞总数的 5%～20%, 小胶质细胞的数量与神经元的数量相当。小胶质细胞在中枢神经系统内分布广泛, 在脑内各区均有分布。小胶质细胞是脑内固有的免疫效应细胞,被认为是中枢神经系统内的主要免疫效应器, 起免疫监视作用, 能对中枢神经系统损伤
做出级联反应。小胶质细胞的免疫效应功能及分布的广泛性,使其在中枢神经系统稳态的维持和损伤修复的实现中发挥极其重要的作用[2]。 1.生物学特性 小胶质细胞的形态具有高度可塑性，静止时它体小致密呈长形。核中染色质甚浓，核随细胞体的长轴亦呈长形。小胶质细胞在苏木精－伊红染色切片中别具特征；突起短，密布大量小枝形似棘刺[3]。小胶质细胞的数量虽不多,但在灰、白质中都有,有些吞噬的小胶质细胞来自血细胞的生成中的单核细胞干细胞，而不是神经起源的，在受伤后出现许多侵入的噬食细胞。在成年中枢神经系统（CNS）内至少有三种不同功能状态的小胶质细胞：存在于正常CNS内的静止小胶质细胞,病理情况下激活或反应性小胶质细胞,吞噬性小胶质细胞。MG 形态通常为分枝状的，较均匀地分布在各个区域，这种状态被称为静息状态。静息状态的 MG 胞体不运动, 很少表达表面标记，很少释放细胞因子、趋化因子，而且不涉及吞噬作用。静息状态的MG 通过分枝状的、可运动的大量突起完成对脑部微环境的监视作用。当脑部出现外伤、撞击等急性伤害，以及实验诱导的应激及神经退行性疾病模型中，MG的形态发生显著的改变，突起缩短、胞体肥大，被称为“变形虫样”形态，此形态的 MG 被认为处于活化状态。小胶质细胞能表达多种模式识别受体，包括Toll-like受体和“清道夫”受体等，这些受体能够识别入侵中枢神经系统的细菌、病毒和真菌等病原微生物[4]。小胶质细胞活化后释放少量ATP，刺激星形胶质细胞大量释放ATP，诱导自
影响小鼠缺氧耐受性的因素 摘要【目的】复制不同类型的缺氧模型，观察不同类型缺氧时呼吸变化规律和皮肤黏膜颜色的变化特点；观察中枢神经系统功能状态不同、外界环境温度不同对缺氧耐受性的影响；了解临床应用冬眠及低温疗法的意义；掌握对照实验和控制实验条件重要性。【方法】用小白鼠设立对照组和实验组，复制不同缺氧类型的模型，观察小白鼠的呼吸节律、皮肤黏膜的变化，观察不同耐氧耐受性因素的影响。【结果】小鼠缺氧后皮肤粘膜的颜色变青紫色；注射氯丙嗪的小鼠先呼吸变缓慢，活动迟缓，之后呼吸加快；另一只小鼠呼吸急促，活动活跃；之后呼吸逐渐减弱。小鼠A总耗氧量为，小鼠B总耗氧量。小鼠亚硝酸钠中毒后，血液、肝脏颜色变为暗红色；用亚甲蓝解救后的小鼠，血液、肝脏颜色仍为鲜红色。【结论】当动物中枢神经系统功能抑制和降低动物所处的环境温度时，其代谢率会降低，组织细胞耗氧量减少，而增强机体的缺氧耐受性；氯丙嗪能够缓解缺氧，使小鼠存活时间更长；亚甲蓝为还原剂，可抑制小鼠亚硝酸钠中毒反应。 关键词：缺氧类型；缺氧耐受性；氯丙嗪；亚甲蓝 Abstract:【Objective】copy of different types of anoxia model, to observe oxygen to breathe as different types of variation and the changing characteristics of color of skin mucous membrane; Observe different condition of central nervous system function, and the external environment temperature, the influence of different to anoxia tolerance; Understand the clinical application and the significance of hypothermia therapy hibernate; Master control experiment and control experimental conditions importance.【Method】established in mice in the control group and the experimental group, copying, oxygen types of model different mice breathing rhythms observe the changes skin mucous membrane, and observe different factors which influence the oxygen resistance tolerance. 【Aesult】mice after the color of skin and mucosa oxygen variable green purple; The mice injected chlorpromazine breathing become slow, activity first after delay, breathe faster; Another mice shortness of breath activity; After breathing decreased. Mice for A total oxygen consumption , total oxygen consumption mouse B. Mice sodium nitrite, blood and liver after the poisoning color into wine; After with methylene blue rescue the mice, blood and liver are still bright red color.【Conclusion】when animals central nervous system function suppression and reduce the environmental temperature in animal and their metabolic rate can be reduced, tissue cell oxygen consumption reduced and increase the body's anoxia tolerance; Chlorpromazine can alleviate hypoxia, make mice live longer; Methylene blue as reducing agent, can restrain sodium nitrite toxic reaction in mice. Keyword:Anoxia type; Anoxia tolerance; Chlorpromazine; Methylene blue 当供应组织的氧不足，或组织利用氧障碍时，机体的机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧。缺氧是多种疾病共有的病理过程。许多原因都能使机体发生缺氧。根据缺氧的原因不同可将缺氧分为乏氧性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型。 影响机体对组织缺氧耐受性的因素很多，如年龄、机体的代谢、功能状况以及锻炼适应等。当动物中枢神经系统功能抑制和降低动物所处的环境温度时，其代谢率降低，组织细胞耗氧量减少，而增强机体的缺氧耐受性，可延长其死亡时间。 本实验从缺氧的不同环节入手通过密闭装置、注射亚硝酸钠等复制小鼠乏氧性缺氧、血