中国海洋大学实验报告 年月日姓名：专业年级：同组者： 课程：发育生物学实验题目：硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响 一．【实验目的】 1、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力； 2、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解 二.【实验原理】 重金属污染是近年渔业环境污染的公害之一。随着工农业的发展，浓度严重超标的一些重金属离子被排入水体而造成污染，对鱼类有毒害作用。目前水体中的重金属主要有Cd、Cu、Pb、Zn等。其中Cu离子就具有较强的毒性，可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，使蛋白质变性，因此常被用作杀菌剂。 斑马鱼（Danio rerio）是常见的暖水性（21~32℃）观赏鱼，鲤科,个体小（4~5㎝），常年产卵，鱼卵易收集，性成熟周期短且胚胎透明，便于观察药物对其体内器官的影响。雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，繁殖水温24℃时，受精卵经2~3天孵出仔鱼；水温28℃时，受精卵经36小时孵出仔鱼，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。 在斑马鱼的整个生活周期中，胚胎期和仔稚幼鱼早期发育阶段对重金属污染最为敏感。据报道，波罗的海春天产卵的鲱鱼，在10 ppb 的Cu2+，水的盐度为5.7条件下即对它的受精和发育有影响。30 ppb的Cu2+引起大西洋鲱鱼（Clupea harengus）卵的死亡，而35 ppb 的Cu2+也使太平洋鲱鱼（C.pallasi）的胚胎发生大量死亡[1]。吴玉霖等1990年依据不同金属对褐牙鲆胚胎的滞育、致畸、成活率及孵化率的综合影响指际，得出5种金属对褐牙鲆胚胎的毒性大小顺序为：Cu2+>Zn2+>Cd2+>Pb2+>Cr3+,对仔鱼的毒性大小顺序为Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+>Cr3+ [2]。 三.【实验步骤】 1、实验材料 斑马鱼囊胚、CuSO4为分析纯，充分曝气的去离子水、24孔细胞培养板、恒温培养箱、用充分曝气的蒸馏水配置成浓度为5 mg/L 的CuSO4母液，用时稀释。. 2、实验方法 1）硫酸铜浓度梯度的设定 经查阅文献，确定斑马鱼胚胎发育从受精到孵化出幼鱼过程中的CuSO4半致死浓度和安全浓度范围，设定5个浓度梯度和和1个对照组。 研究表明，Cu2+对大银鱼受精卵的安全浓度为0.00112 mg/L[3]，对鮸状黄姑鱼仔鱼的安全浓度为0.006mg/L[4]，所以设定对照组CuSO4的浓度梯度分别为0（空白对照），0.001 mg/L，0.01 mg/L，0.1 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L。每个浓度组设定4个平行组。使用暴晒后的
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
goosecoid在斑马鱼早期发育中的作用 Wnt/β catenin信号通路在早期胚胎发育中起到非常重要作用,它调控胚胎背腹图式发生。goosecoid(gsc)基因是经典Wnt信号通路的下游靶基因之一,同时对Wnt信号起负反馈抑制作用。之前报道中,gsc在小鼠和人中突变之后都会产生骨骼发育不全等症状,而目前关于gsc在斑马鱼中的具体生理功能还不是很清楚。 之前研究表明,用吗啡基-吗啉基技术(Morpholino,MO)敲低斑马鱼gsc,无明显缺陷。MO由于其作用时间短的限制,不能很好的研究基因在后期发育中的功能。而近年来的出现的基因编辑技术如TALENs,有着靶向高,操作方便的优点,成为可以用于基因功能的研究的新工具。 为了研究gsc在斑马鱼中的具体功能,我们利用TALENs技术,构建了斑马鱼gsc突变体模型,用于研究gsc在斑马鱼中的早期发育中的作用。得到的结果如下:(1)利用TLANEs技术敲除斑马鱼gsc,筛选得到移码缺失7bp的突变体。(2)gsc杂合突变体自交结果显示,突变体早期无明显背腹缺陷,但发育至受精后第五天(5 dpf)时,鱼鳔发育缺陷。 测序表明鱼鳔缺失个体为纯合突变体,经统计其占全部胚胎的21%。表明gsc 突变与鱼鳔缺陷是相关的。(3)对gsc突变体进行石蜡切片及苏木精伊红(HE)染色,结果显示,突变体鱼鳔结构存在。 (4)gsc突变体中,鱼鳔标记基因hb9原位杂交结果显示,鱼鳔发生未受到影响。表明突变体鱼鳔结构正常,但未充气。(5)充气由口、咽、鳔管等多个器官协调完成,而gsc后期特异表达在咽部。 gsc突变体咽部软骨阿尔新蓝染色,及石蜡切片,苏木精伊红染色,结果均表
斑马鱼-全胚胎免疫组织化学染色 斑马鱼胚胎的全组织免疫化学染色被广泛应用，这一技术需要额外的步骤来固定和通透以确保卵膜能够完全被溶液渗透。固定、封闭、抗体孵育、洗脱、通透以及底物显色过程都需要比正常的免疫细胞化学/免疫组化更长的时间，以使得溶液可以渗透到达样品的中心。 实验步骤： 1. 将胚胎置于5ml的器皿中固定1h。固定液的选择要谨慎，取决于两点：一是对于同一 种抗体，在冰冻切片中成功使用的固定液，可用来做全胚胎染色实验，二是根据目的蛋白。可用4%的多聚甲醛或者预混合的固定液来固定，预混合的固定液十分适合于神经蛋白。 使用Pasteur移液管来移动胚胎、吸取溶液，这有利于防止来自于移液管窄末端对胚胎的损坏。 2. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 3. 将胚胎置于冰丙酮/PBS混合液中8分钟。 丙酮可用帮助通透坚固的卵膜，对于其他样品如鸡和鼠这一步可省略。 4. 用含1%Triton的PBS清洗胚胎至少四次，每次5分钟。 5. 用封闭液（含1%Triton、10%胎牛血清的PBS）室温孵育胚胎1h。 6. 阻断过氧化物酶：将胚胎置于含0.1%H2O2的封闭液中4°C过夜。 7. 用封闭液清洗胚胎2次。 8. 将Pasteur移液管末端剪掉形成2ml的管子，用其转移胚胎。加入合适浓度的一抗。 一般在全胚胎染色中抗体孵育的时间比较久，为了防止微生物的生长，在稀释一抗的封闭液中会加入0.02%的叠氮化钠。 9. 样品在混合器上4°C缓慢旋转孵育1-4天。 根据不同的抗体以及胚胎的大小，孵育的时间需要进行一些优化。 10. 用含1%Triton、10%胎牛血清的PBS清洗胚胎3次，每次1h。 11. 用含1%Triton的PBS清洗3次，每次10分钟。 12. 用DAB底物室温孵育胚胎2-3h。 13. 将胚胎转移到一个碟子中，加入新鲜的配制的显示底物（每1mlDAB加5ul的过氧化氢）。 14. 用PBS清洗3次，使得样品达到理想的染色强度。 15. 爬片观察胚胎：观察分析前样品于4°C避光储存。 爬片：用融化的含1%琼脂糖的PBS爬片。一旦加入琼脂糖后，用含70%甘油的PBS 覆盖琼脂糖，再在样品上放置一个盖玻片。
鲁东大学生命科学学院学院20 10 －20 11 学年第二学期学院______________ 专业_____________ 年级________ 班________ 学号 _____________姓名______________ 密封线 学生须将文字写在此线以下 《发育生物学》课程论文 课程号：2522080
.关键词：斑马鱼；发育；葡萄糖；溶液浓度；温度；TCDD 一、斑马鱼简介 斑马鱼(zebra fish)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼。 斑马鱼是一种常见的热带鱼。斑马鱼体型纤细，成体长3-4cm，对水质要求不高。孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼由于个体小，养殖花费少，能大规模繁育，且具许多优点，吸引了众多研究者的注意。经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库里有相关 斑马鱼的资料可供查询和下载，方便了研究。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植技术、突变技术、单倍体育种技术、转基因技术、基因活性抑制技术等已经成熟，且有数以千计的斑马鱼胚胎突变体，是研究胚胎发育分子机制的优良资源，有的还可做为人类疾病模型。斑马鱼已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学模式之一，在其它学科上的利用也显示很大的潜力. 二、斑马鱼的发育过程 1〕卵子的发生 斑马鱼卵子发生过程中乱母细胞的发育是不同步的。在卵子发生早期，核内许多小核仁开始富集，其数目在接下来的时期中可以达到1500个，他们分布在和的外围和靠近内部核膜。 斑马鱼卵子发生过程一般分为5个时期，即StageⅠ-Ⅴ;有时也将StageⅡ和Ⅲ作为一个时期将卵子发生分为4个时期。各个时期的基本特征是： StageⅠ是原始滤泡生长阶段，乱母细胞没有卵黄，是一个有细胞质包围着升值滤泡的圆形球体。其染色体去浓缩并出现灯刷装 状表型，此时DNA高度延伸，形成一个具有典型形态学上的包含RNA和蛋白质的恻环。染色体的这一构型被认为有利于母源性基因的转录激活，其出现与斑马鱼卵母细胞中RNA合成的高速率是一致的。在这时期，卵母细胞和滤泡细胞的微小突起（microvilli）开始伸展并延伸到彼此的区域。一旦形成，这些连接包含粘附连接、细胞桥粒和间隙连接，它们可能与滤泡细胞和卵母细胞间的交流和卵母细胞附近小分子的吸收有关。同时，卵黄膜组分开始在滤泡细胞和卵母细胞之间富集；其他结构，如线粒体、高尔基体和内质网等富集，反映了产生大量产物的需要。 StageⅡ卵母细胞的特点是富集了大量蛋白质和油脂，对于卵子激
年月日姓名：专业年级：同组者 科目：发育生物学实验题目：斑马鱼性腺促熟及早期发育模式 一【目的要求】 1、通过实验操作掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术 2、通过斑马鱼早期发育的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识 二【实验材料】 （一）器材 培养缸、控温棒、解剖镜、显微镜 (二)试剂 经太阳晒过至少一天的自来水 （三）动物 斑马鱼（Danio sp.） 三【实验内容】 （一）亲鱼培育和性腺促熟 挑选体长大于4厘米的斑马鱼放养于鱼缸中，水温保持在28℃左右，放养数量根据鱼缸中水体体积而定，密度5尾\L左右。饲喂亲鱼用的饲料有活性饲料和配合饲料两种，直接购自于观赏鱼市场，要求每天投喂4次，及时清除残饵，隔天换水，快到繁殖季节时将雌雄分养，加强管理。 （三）繁殖 繁殖前一天中午，将雌雄合养于繁殖缸里，要求雌雄比例为2:1。由于斑马鱼有食卵的习性，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔为2-3毫米的网将亲鱼限制在繁殖缸的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。一般次日凌晨到中午可以产卵和受精，受精卵便沉降于缸底，将繁殖后的亲鱼及时转移至别的培养缸中，吸取缸底受精卵，剔除异物以及眼观有白色小斑点、畸形异常卵。 （三）斑马鱼胚胎发育模式 孵化期间，培养用水温度控制在25-28℃，每天要及时清除败育卵，并换水1-2次。按时观察记录斑马鱼胚胎的早期发育过程，绘制斑马鱼的胚胎发育模式图。 1、受精卵：斑马鱼的卵呈圆球形，橙黄色、微透明，直径0.8-0.9 mm。在水中，受精卵卵膜(壳膜)迅速膨胀，出现透明的卵周隙，在壳膜上可以看到呈漏斗状的卵膜孔。 2、卵裂：卵子受精后，细胞质迅速向动物极流动，并集中形成帽状的胚盘。卵裂即在胚盘范围内进行，卵裂属于不全裂，盘状卵裂。第一次分裂为经裂，分裂沟自上而下，但不到达底部，结果分为两个相等的不完整分裂球。第二次分裂仍为经裂，分裂面与第一次垂直，仍是不完全分裂，于是分成大小相似的四个分裂球。第三次分裂亦为经裂，两个分裂面在第一次分裂面两侧，并与第一次分裂面平行，形成两排，每排四个，共八个分裂球。第四次分裂仍为经裂，两个分裂面在第二次分裂面的两侧，并与第二次分裂面平行，分裂为四排每排有四个分裂球，共形成十六个分裂球。第五次分裂，有经裂也有纬裂，分裂面己不整齐，分裂球大小也不一致。以后几次分裂，分裂球愈分愈小。 3、囊胚期：由于细胞不断分裂，数目增多，细胞体积逐渐变小，分裂球层次增加，同时在胚盘与卵黄之间产生一空腔，即为胚盘下腔，此时称囊胚期，又分为囊胚早期、中期和晚期，也称高囊胚、中囊胚和低囊胚。 4、原肠胚期：囊胚晚期后，细胞逐渐向植物半球下包，胚盘变扁，开始进入原肠期。当胚盘下包到卵黄的一半时，胚环最大，背唇呈新月状，此即胚盾开始，即原肠早期。胚盘继续下包到胚胎的三分之二时，由于细胞不断集中于胚环的一处，致使该处呈一盾状隆起即
万方数据
复旦学报（医学版）２００６年１月，３３（１） 脏的发生与发育过程中的作用提供依据。 材料和方法 斑马鱼胚胎固定收集不同发育时期的ＡＢ野 生型斑马鱼（购自俄勒冈大学，斑马鱼养殖系统从美国ＡｑｕａｔｉｃＨａｂｉｔａｔｓ公司引进）胚胎：６ｈｐｆ（ｈｏｕｒｓｐｏｓｔ—ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，受精后６ｈ）、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、２０、２４、３６、４８ｈｐｆ，用４％多聚甲醛溶液固定过夜（至少固定１２ｈ），保存于甲醇溶液中，置一２０℃备用。 引物设计与合成首先根据Ｇｅｎｂａｎｋ数据库查得斑马鱼Ｍｅｆ２ｃｃＤＮＡ序列（Ｇｅｎｂａｎｋ：３０５７５），以包含密码子１３１９～２３８５位的基因序列为ＲＮＡ探针序列，探针序列总长１０６６ｂｐ。ＲＮＡ探针的引物序列（由上海赛百盛生物有限公司合成）为：Ｆｏｒ—ｗａｒｄ：５＇－ＣＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＣ一３ ７Ｒｅｖｅｒｓｅ：５＇－ＣＧＣＣＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＧＡ ＧＡＧ一３ ７。 ＰＣＲ扩增以斑马鱼基因组总ＤＮＡ为模板，用以上两条引物特异扩增ＲＮＡ探针序列。扩增条件为：９５℃预变性２ｍｉｎ，９５℃变性４５Ｓ，５７℃复性４５Ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，重复３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。 合成反义ＲＮＡ探针将纯化的扩增产物连接到ｐＧＥＭ—Ｔ载体（Ｐｒｏｍｅｇａ）中，然后转化到ＤＨ５ａ感受态菌株（博大泰克）中进行克隆。根据Ｈａｒｌａｎｄ的方法［４３抽提转染后的连接载体质粒（测序验证质粒中插入序列是否正确），ＮｏｔＩ内切酶（ＮＥＢ）酶切完全，以其为模板转录合成反义ＲＮＡ探针。 整体原位杂交取不同发育时期的胚胎，用１×ＰＢＳＴ溶液洗去多余的甲醇溶液，将胚胎置于６５℃水浴进行预杂交３ｈ，然后加入所合成的反义ＲＮＡ探针６５℃水浴杂交过夜。多余的探针用０．２×ＳＳＣ溶液洗去，加入ａｎｔｉ—Ｄｉｇ—ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）与反义ＲＮＡ探针结合过夜。未结合的抗体用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去，再加入ＢＣＩＰ／ＮＢＴ／ＮＴＭＴ溶液显色３０ｍｉｎ，迅速用１ＸＰＢＳＴ溶液洗去多余的显色液，在显微镜下观察并记录结果。 结果 探针合成效果琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，本实验中设计的引物能够特异性地扩增目标基因片段。图１Ａ为特异扩增的ＲＮＡ探针序列电泳检测结果，扩增的ＲＮＡ探针序列大小约１０６６ｂｐ。图１Ｂ为酶切后电泳迁移率的改变，２、３泳道是未被酶切的质粒序列，４、５泳道是酶切后的质粒序列。酶切后质粒电泳速率要比未酶切质粒的速率要快。同时，我们将该序列测序后进一步验证（由上海赛百盛生物有限公司测序），连接至ｐＧＥＭ—Ｔ载体中的ＲＮＡ探针的序列是正确的。 图ｌ凝胶分析ＰＣＲ结果（Ａ）和质粒酶切结果（Ｂ）Ｆｉｇ１ＧｅｌａｎａｌｙｓｉｓＰＣＲ（Ａ）ａｎｄｐｌａｓｍｉｄ（Ｂ） Ａ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－５；ＲＮＡｐｒｏｂｅ．Ｂ：１：ｍａｒｋｅｒ；２－３：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ—ｐＧＥＭＴ； ４－５：Ｍｅｆ２ｃＲＮＡ－ｐＧＥＭＴｃｕｔｂｙＮｏｔ－１ 斑马鱼整体原位杂交在斑马鱼胚胎发育早期，Ｍｅｆ２ｃ在胚体中没有自身的转录产物，仅少许从母体自带的Ｍｅｆ２ｃｍＲＮＡ存在，胚体染色呈现为弥散均染状态（图２：ａ，ｂ见封二）。当胚胎逐步发育到１３ｈｐｆ，Ｍｅｆ２ｃ在体节中开始表达，此时约已形成８个体节，表现为在背侧出现两条条带状的深染部位；同时，在心脏中的表达也开始出现，在靠近头侧部出现有深染的片状区域，代表早期的生心区的细胞中有Ｍｅｆ２ｃ表达（图２：ｃｌ，ｃ２见封二）。当胚胎发育至１５ｈｐｆ时，体节以及心脏中Ｍｅｆ２ｃ的表达更加明显，Ｍｅｆ２ｃ在体节的表达表现为各个体节之间能清晰区分，并表现为典型的Ｖ型结构；同时，心脏中的表达表现为生心区细胞开始集中，逐步靠近体轴开始形成心管结构，体现出染色更为集中，由片状染色转变成为线状（图２：ｄｌ，ｄ２见封二）。随着胚胎进一步发育，体节逐步完善，心管逐步形成，Ｍｅｆ２ｃ仍然保持较高的转录水平，体节中表现为随着体节的增多，Ｖ型染色的体节也随之增多；在心脏的表达呈现出明显的线管状结构（图２：ｅ，ｆ见封 －－）。斑马鱼的胚胎发育随着时间的进展而逐步完 万方数据
斑马鱼性腺促熟和早期发育模式 XXX,YYY,ZZZ 一、目的与要求： 1、掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术。 2、加深硬骨鱼早期形态发育模式的理解。 二、实验内容： （一）斑马鱼性腺促熟和产卵调控。 1、斑马鱼特性： 斑马鱼一般4月龄性成熟，5月龄鱼繁殖较好；繁殖周期短，一般7天左右。 雌雄分辨：雌性（偏银灰色，体形丰满，腹部膨大、松软，仰腹可见有明显的卵巢轮廓，手摸富有弹性）；雄性（偏柠檬色，腹部扁平，身材显得修长）。【如图一、图二】 图一：雄鱼图二：雌鱼 精、卵体外受精，体外发育，且速度快。发育速度与温度密切相关：在25℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需36h；在28℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需24h，即胚胎发育成熟。 2、斑马鱼繁殖准备： 将亲鱼雌、雄分开饲喂2～3天（要在饲养箱中加一玻璃隔板，将雌、雄分开，但同时相互之间又要能够看到），繁殖时将雌、雄按1：1或2∶1比例放入产卵池中进行产卵受精。在此过程中一般采用10h光照，14h黑暗的光周期。斑马鱼一般在混合的次日凌晨产卵，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔2～3mm的网将亲鱼限制在产卵池的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。每条雌鱼可产卵300～1000粒。 （二）斑马鱼早期发育观察： 斑马鱼早期胚胎发育主要有以下七个时期（附有相应的时间）： （1）合子期Zygote Period(0-0.75h) （2）卵裂期Cleavage Period(0.75-2.2h) （3）囊胚期Blastula Period(2.25-5.25h) （4）原肠胚期Gastrula Period(5.3-10h) （5）体节期Segmentation Period(10-24h) （6）咽期Pharyngula Period(24-48h) （7）孵化期Hatching Period(48-72h)
斑马鱼胚胎整体原位杂交 (Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos) 北京大学遗传与发育生物学实验室 整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17 说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。 在整个实验中应当注意： (1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。 (2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。避免漏加溶液。 (3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。 (4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。吸时动作要轻。任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。 (5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。 第一天 以下操作需戴乳胶手套。 1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。 1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。 梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。稀释时间宁长勿短。 特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。 1.2 PBST处理5分钟，两次。 2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。 2.1用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度 消化的目的是使探针更容易进入组织中。应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。 理论上换新的酶和新胚胎都应该重试处理时间。 以下操作室温进行，注意溶液预热。 2.2消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。 在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。 每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。 若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。注意及时写上新的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。 2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。 提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。未使用完部分可用于固定胚胎。 用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。 2.4 PBST洗5分钟，两次。
文章编号:1000 5404(2011)04 0389 03 论著 ptges3a 基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达 韩勇军,吴新荣 (510010广州,广州军区广州总医院药剂科) [摘要] 目的 克隆斑马鱼前列腺素E 合酶3a(pro stag land i n E synthase 3a ,pt ges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期 发育中的表达情况。方法 提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备D I G 标记的ptges3a RNA 反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a 在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a 在sh i e l d 期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26hpf 时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36hpf ptges3a 在头部较高表达。结论 ptges3a 可能参与了脑部发育和肾小管形成。 [关键词] 斑马鱼;前列腺素E 合成酶;胚胎发育 [中图法分类号] R 321;R345;R 394.2[文献标志码] A [通信作者] 吴新荣,E m a i :l gzwxrong @y a hoo .co m Expression of ptges3a duri ng early develop m ent in zebrafi sh H an Yong j u n,W u X i n rong (D epart m ent of Phar m acy ,G uang zhou G eneral H o spita l o f G uang zhou M ilita ry Co mm and ,G uangzhou ,G uangdong P rov i nce ,510010,Ch i na) [Abstract ] Obj e cti v e To clone prostag land i n E synthase 3a (ptges3a)gene and investigate its te m pora l and spati a l expression pattern i n zebrafish duri n g earl y deve l o pm en.t Methods The to ta l RNA of different phases of zebrafish e m br yos w as ex tracted .D igox i n labe led RNA probe o f ptges3a w as prepared .W ho le e mbryo m ount in situ hybridization w as e mp loyed to investi g ate the expressi o n patter n of ptges3a during zebrafish e mbryogenesis .Results ptges3a transcri p t w as d istri b uted ub i q u itously before sh ield stage .A t 10 so m ite there w ere detectab le expression o f ptges3a gene in the hindbra i n neural kee,l and at 18 so m ite it w as expressed in the h i n dbra i n .Fro m 26to 36h after post fertilizati o n (hp f),h i g h expressi o n o f ptges3a w as found i n the brai n .ptges3a w as a lso detectab le i n the rena l tubule at 26hp.f C onclusi o n The expression patter n of ptges3a during zebrafish e m bryogenesis suggests that it m ay be critical for the developm ent of bra i n and rena l t u bule .Further i n vestigation on the functi o n of ptges3a is needed . [Key words ] zebrafish;prostaglandin E synthase 3a ;e m bryonic developm ent C orrespond i ng au t hor :W u Xi n rong ,E m ai:l gz w xrong @yahoo .co m 前列腺素(prostag land i n ,PG )E 2是一种重要的前列腺素类物质,参与机体多种生理及病理过程,前列腺素E 合成酶(prostaglandin E synthase 3,ptges3)是PGH 2转化为PGE 2过程中的重要终端限速酶。多项研究[1-3] 结果显示,ptges3在结肠癌、肺癌、头颈部肿瘤、乳腺癌和胃癌中过表达,且与肿瘤的发生、发展密切相关。缺失ptges3的小鼠可以消除炎症,类似于非甾体抗炎药(non steroida l anti i n fla mm atory drug ,NSA I D )作 用的效果[4] ,动脉粥样硬化患者的巨噬细胞中ptges3 有高表达,可诱导血小板破裂[5] 。ptges3可能成为用于治疗疾病和筛选药物的潜在靶点。斑马鱼是近几十年出现的新型模式生物,它有许多优点:个体小、喂养费用便宜;早期胚胎透明,易于观察和操作;产卵多,繁殖周期短。通过序列比对和进化树分析发现斑马鱼ptges3a 与小鼠、人的ptges3具有高度同源性。整胚原 位杂交技术是研究斑马鱼发育相关基因的功能和表达 模式的一种重要手段。本研究通过整胚原位杂交方法分析了ptges3a mRNA 在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达情况,为深入研究这一基因的功能提供基础依据。1 材料与方法1.1 材料 斑马鱼Tubingen 野生型,总RNA 提取试剂盒RNA queous 4PCR K it(Amb i on 公司),PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成,琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、大肠杆菌DH 5 感受态细胞、普通质粒小提取试剂盒(T i angen 公司),T 4DNA 连接酶、p GM T easy 载体、D IG RNA L abe li ng M i x (R oche 公司),SP 6RNA Po l ym erase(P ro m ega 公司),限制性内切酶Ap a 、Ex T aq 聚合酶(T a K aRA 公司),A nti D i gox i g en i n A P 、染色剂:NBT 和BC I P (R oche 公司)。 1.2 方法 1.2.1 人、小鼠和斑马鱼的ptges3基因进化树分析 从生物技术信息网页(http ://www .ncb.i nl m .n i h .gov /guide /)获取 389 第33卷第4期 2011年2月28日 第 三 军 医 大 学 学 报ACTA ACADEM I AE M EDIC I NAE M ILI TARIS TERTI AE V o.l 33,No .4 Feb .28 2011
环境对斑马鱼胚胎发育的干扰 XXX,YYY,ZZZ 一、实验目的及原理： 1、通过斑马鱼早期发育过程的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识。 2、通过设置环境因子（锌离子）来研究其对斑马鱼胚胎发育的影响程度。 3、通过对比对照组和实验组，进一步巩固对硬骨鱼胚胎发育模式的认识。 4、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力。 5、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解。 二、实验材料与方法： 1、实验材料： 所需胚胎：发育良好的、健康的斑马鱼胚胎（原肠胚早期）36枚。 试剂：硫酸锌（分析纯）， 器材：培养容器12孔板，恒温培养箱，显微镜，解剖镜，载玻片，塑料滴管，手表，移液枪100uL、1000uL，量筒100mL*2。
2、实验方法： （1）在本实验中，使用硫酸锌作为实验用环境因子，共设三个梯度，分别为：0，0.1mg/L，1mg/L。每个梯度设4个平行组，每个平行组3个胚胎，共需36个胚胎。 （2）实验处理起始时间：原肠胚早期： 实验处理终止时间：孵化期。 （3）实验操作： A.挑选胚胎： 由于斑马鱼卵受精及发育的不均匀性，要对斑马鱼卵进行挑选。挑选时要挑透明、无白色斑点、卵膜完整的。之后的实验中还要不断将败育卵挑出。 用滴管（塑料滴管口部要剪短且一定要圆滑，并且直径要大于卵径）将选择好的卵依次吸出，然后放入12孔板中进行孵化。 【注意剔除异物眼观有白色小斑点、畸形异常卵。】
B.实验体系： 12孔板培养胚胎，每孔放入3个胚胎，共使用12个孔，36个胚胎。12个孔分别标上A1~A4,B1~B4,C1~C4。A1~A4组作为对照组的三个平行组，B1~B4作为0.1mg/L组的三个平行组，C1~C4作为1mg/L组的三个平行组。 C.实验期间的培养管理： 1．孵化用水： 孵化水温一般要25~28℃，在这个温度范围内，温度越低，孵化所需时间相应越长。水温25℃时，受精卵经48~72h孵出仔鱼，水温28℃时，经36h孵出仔鱼。水温太高或太低，会造成受精卵死亡。[2] 【实验中设定的培养温度为25℃，由于恒温培养箱的示数与实际温度有较大差异，而且在实验后期（80h）提高培养箱温度以加速孵化，所以本次实验实际中的温度并不恒定，暂以25℃为准。】 2.孵卵卫生： （1）定期观察，每12h换一次水，水温要相近，而且每次换水量在原水量的1/3-1/2,以尽量使胚胎缩短适应期，使发育流畅。定期将死卵挑出，以确保不影响其他卵的正常发育。 3、观察记录： （1）前3h实时观察、拍照并记录，之后每天早上(7:00-9:00)、中午(12:30-14:30)、晚上(18:00-21:00)三段时间对斑马鱼胚胎发育不同时期以及畸变进行观察、拍照并记录。 （2）实验指标:实验前，根据文献查询[3]，Zn2+可能导致的畸变有：
实验四斑马鱼胚胎的显微注射 08生物技术刘佳 一、实验目的 1、练习针刺细胞（未受精卵、去卵核、早期胚胎细胞或体外培养细胞）； 2、练习微吸管制备； 3、掌握细胞显微移植技术（细胞核、外源基因）； 4、了解显微注射的应用及注意事项。 二、实验器材及材料 斑马鱼胚胎、酚红、显微镜；显微操作仪；拉针仪 三、实验原理及步骤 显微注射（microinjection）技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。 注射过程：1、注射针内装液：使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入待注射样品酚红一滴。2、注射针安装和定位：（1）将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上；（2）把载有待注射样本的培养皿放在显微镜载物台上，用低倍物镜对准细胞调焦；（3）移动针头并在显微镜下调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的中心上方；（4）使用工作用放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。 3、显微注射：（1）使针尖对准细胞的待注射部位（细胞与针尖在同一焦面上），旋转推进旋钮，针刺入细胞内（卵膜、细胞膜、核膜）；（2）旋转加样旋钮，将样本加入，并离开细胞。 四、实验结果观察 注射前注射中注射后 五、注意事项
在实验过程中，断针时针头应断成尖锐状，即对胚胎有保护作用也容易进入胚胎。断后的针应放在铺有海面或泡沫的平皿里，防止针滑动而被碰断。在整个过程中，注射针尖应远离人员和实验室中的仪器。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。在反向充填液体时，适当地在显微镜下观察注射针尖，以决定在加压时是否注射针阻塞或偏斜。阻塞通常可通过将针尖轻轻敲击一个固定物而得以缓解。针尖偏斜的注射针是适合于显微注射的，但其使用应做细微调整或补偿注射中加压所造成的额外偏斜。注射速度过快能扰乱细胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计的细胞体积的10%，并且注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射效果最好。
斑马鱼胚胎Western Blots 去卵膜&去卵黄 1、每100粒胚胎置入1mg/ml链霉蛋白酶溶液中，时常（24h胚胎5-10min，3天胚胎10-20min）摇晃，分批次除去胚胎的卵膜。用吸管将卵膜轻轻弄破。卵膜会漂浮起来，将其倒出。用冷的Ringer's 溶液漂洗3次（可以参照“如何除去斑马鱼胚胎卵膜”）。 2、将胚胎转移到有EDTA和PMSF的冷Ringer's溶液中。用尖部拉成约卵黄直径大小的玻璃吸管将卵黄捣碎除去。 3、将除去卵膜、卵黄的胚胎转移到新鲜的冷Ringer's溶液中，洗涤2次。 4、将胚胎转移到离心管中，尽量除去液体，然后放入液氮中冰冻并储存在-70℃。溶液配制: 链霉蛋白酶： 5mg/ml链霉蛋白酶用胚胎培养基稀释成1mg/ml PMSF：储存液：100mM 苯甲基磺酰氟溶入异丙醇中。使用时每10mlRinger's溶液中立即加入30μl储存液（终浓度0.3mM PMSF） EDTA： 储存液：10mM EDTA，pH7.0。每10mlRinger'溶液中加入1ml（终浓度1mM EDTA）准备电泳样品 1、将除去卵膜、卵黄的斑马鱼胚胎从低温冰箱中拿出解冻。 2、离心1-2min。 3、除去残留液体。 4、加入150-200μlSDS样品缓冲液（例如：3天的胚胎加入50-100μl，24h胚胎加入100-150μl，就能够装满一个1.5cm上样槽或四个0.4cm的上样槽，每一个槽可以装样品25-30μl）。 5、用微型杵将样品搅拌均匀。 6、重复步骤5直到样品不再黏稠。 7、沸水浴5min。 8、离心1-2min。 9、将上清转移到新的离心管中。弃去沉淀，或者再次加入样品缓冲液，搅拌均匀后回收上清。 10、-70℃冻存或者立即上样电泳。 溶液配制： SDS样品缓冲液：0.63 ml 1M Tris-HCl, pH 6.8；1.0 ml 甘油； 0.5 ml ¸-mercaptoethanol；1.75 ml 20% SDS；6.12 ml H2O； (总共10 ml)分装后于-20℃冻存。 细胞骨架/细胞外基质预处理： 在步骤3和4之间加入一步抽提。 1、将去卵膜，去卵黄的胚胎放入抽提缓冲液中搅拌均匀。 2、4℃放置过夜。 3、5000g离心20min。 4、去上清。 溶液配制： 蛋白抽提缓冲液：10 mM Tris, pH 7.4；2% Triton-X 100 ；1 mM PMSF；1 mM aprotinin；1 mM leupeptin ；1 mM trypsin inhibitor
斑马鱼胚胎显微注射实验步骤： 显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。斑马鱼个体小，养殖成本低，能大规模繁殖，胚胎透明，体外发育，肉眼可见，因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。 1、主要试剂的配制 （1）胚胎培养液的配制 称取0.8g NaCl、0.04g KCl、0.00358g Na2HPO4、0.006g KH2PO4、0.144g CaCl2、0.246g MgSO4?7H2O、0.35g NaHCO3、0.06g 青霉素、0.1g 链霉素加入含有800mL 灭菌水的1L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用灭菌水定容至1L。（2）显微注射指示剂的配制 称取0.1克酚红溶于5ml灭菌的蒸馏水中，配制成2％的母液。先用1mm滤膜过滤后，再用0.22mm的滤膜再次过滤，然后储存在-20℃冰箱里备用。 2、显微注射操作 （1）注射针头的拉制：装上一根直径为1mm的毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定参数为：Heat-600, Pull-55, Velocity-80, Time-10。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。 （2）琼脂糖注射槽的制作：称取0.4g琼脂糖，溶于30ml胚胎培养液中，在微波炉中加热溶解后，先倒入约10ml琼脂糖溶液到6cm的玻璃培养皿中，然后将注射槽模型轻轻放置于胶面上，再倒入约20ml。琼脂糖凝固后，取出注射