第6课时土壤中分解尿素细菌的分离与计数目标导航 1.研究培养基对微生物的选择作用。2.进行微生物数量的测定。
一、研究思路
1．筛选菌株
(1)实验室中微生物筛选的原理
人为提供有利于________________生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时________或________其他微生物生长。
(2)选择培养基
在微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基
①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是____________，提供氮源的是________，琼脂的作用是凝固剂。
②该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是________________________________才能在该培养基上生长。
③土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成________，将尿素分解的反应式是________________________________________________________。
Taq细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。
2．统计菌落数目的方法
(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②操作
第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。
第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝C
V×M，其中C代表___________________________，V代表________________________________(mL)，M代表____________。
(2)显微镜直接计数法
①原理：此法利用特定的____________或______________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由________个小格组成。
②操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。
③计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。
(3)设置重复和对照
①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。
②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设
置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。
二、实验设计
实验步骤
1．土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。
2．制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。
②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。
③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。
3．样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有________ mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取______mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。
4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。
5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。
6．细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出____________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。
7．统计表格
稀释倍数103104105106107
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
1
2
3
?
菌落种类形状大小
隆起
程度
颜色
……
1
2
3
?
注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，____________表现出________的菌落特征。
三、操作提示
1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。
2．应在________旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。
3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________旁操作。
4．实验时要对________做好标记。注明________________________________________等。
5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。
四、结果分析与评价
内容结论分析
有无杂菌污染的
判断
对照的培养皿中________菌落生长→未被杂菌污染
培养物中菌落数________→被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高→培养物中混入____________
选择培养基的筛
选作用
牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目________选择培养基的数目→选择培养基
具筛选作用，已筛选出一些菌落
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在________的平板→操作成功，能进行菌落的
计数
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应________；如果结果相差太远，说明实验操
作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因
五、课题延伸
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。氨会使培养基的碱性增强，________升高。因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。
知识点一研究思路
1．下表为本课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题。
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂15.0 g
用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)在该培养基源和氮源的分别是____________________。
(2)按物理性质划分该培养基属于________培养基，理由是培养基中含有________________；该类培养基常用于微生物的______________________等。
(3)由于____________________________________________________________________，所以该培养基只能用于能够合成________的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出________的细菌。
(4)在微生物学中，将_______________________________________________________
__________________的培养基，称作选择培养基。
2．广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4植物，单位面积产量很高，
种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗→榨汁(蔗糖)→酵母发酵→蒸馏→成品(燃料酒精)。
(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。
步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意________________和____________，加琼脂后灭菌，制成固体平板。
步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。
步骤4：根据________________________________________________________________，筛选出突变菌。
(2)上述步骤2、3和4的依据分别是___________________________________________
________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。
知识点二实验设计
3．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
4．在本实验操作中对使用的平板和试管要进行标记，以下说法正确的是()
A．对培养皿仅需注明培养基的种类即可
B．一般在使用之后进行标记
C．由于试管用的较多，只需对试管进行标记即可
D．标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆
一、选择题
1．在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出()
A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
B．固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C．固氮细菌、霉菌、放线菌
D．固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
2．请选出下列正确的操作步骤()
①土壤取样②称取10 g土壤，取出加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中③吸取0.1 mL 土壤溶液进行平板涂布④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A．①→②→③→④
B．①→③→②→④
C．①→②→④→③
D．①→④→②→③
3．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是()
A．筛选出能分解尿素的细菌
B．对分离的菌种作进一步鉴定
C．作细菌的营养成分
D．如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素
4．下面对“从土壤中分离分解尿素的细菌过程中灭菌”的理解，不正确的是()