细菌转化，单克隆挑选及摇菌
1.接种50~100ul菌液于5 ml LB试管中，37℃250转/分震荡约3小时，至OD600≈时停止振荡（透过管能看到手指要挑选细菌活力强时）
2、取离心管与菌液放冰浴冷却15min
3.将细菌转移至的离心管中，4℃，4000转/分离心15min（防止菌体破裂），弃上清液
4.以1ml （倍菌液体积）预冷的CaCl2重悬细菌沉淀，冰浴30min，4℃，4000转/分离心15min，弃上清液
5.用250μl（倍菌液体积）预冷的CaCl2重悬细菌沉淀
质粒DNA加入到感受态细菌中，轻轻旋转几次以混匀内容物，冰上放置30分钟
7.将离心管放入42℃的循环水浴中，90秒
8.将离心管置于冰上，10分钟
9.加入200ulsoc 培养基（加入了葡萄糖等物质，比LB培养基更营养，更利于热激后细菌恢复），200转37℃45min，同时将培养平板放入孵箱
10.用一无菌玻璃推板轻轻将转化的细菌均匀地涂于培养基上。（玻璃推板充分火焰消毒，待充分冷却后再进行涂板，可将推板贴在平板盖内侧，再用手隔板盖感觉温度）
11. 37℃培养箱中正置平板，待液体完全干后再倒置平板，培养16小时，将平板取出4℃放置约2小时后观察。挑选单个肉眼能见菌落，
坐上在平板上做上标记（菌落不易太大，否则有杂菌混入，培养箱中培养不超过16个小时）
12、在超净台内，将细菌挑入LB培养基，一个菌落一支管，180~200转/分钟过夜（12~16个小时，以菌体浑浊为佳）。抽取质粒（抽取质粒时每支LB管也应对应相应的EP管）
备注
LB培养基制备
蛋白胨1%（g/ml）
NaCl 1%
酵母粉%
到此配方为LB培养基（液体）
若配制平板则加琼脂粉%
氨苄青霉素的储存浓度是50~100ug/ul，使用时稀释1000倍，
以下步骤在超净台进行，
培养液高压灭菌后，待容器不烫手时加入氨苄，轻摇混匀，倒入平板，每板大约20ml
无菌技术操作原则 概念：无菌技术是指在执行医疗护理操作的过程中，防止一切医微生物侵入机体和保持无菌物 品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 1.无菌技术：指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌 物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 2.无菌物品：经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品 3.无菌区域：经过灭菌处理而未被污染的区域 4.非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌物品或区域。2操作原则 1.环境清洁 进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，减少人员走动，以降低室内空气中的尘埃。防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次，时间20~30分钟即可，也可适当延长消毒时间。 2.无菌操作 衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。必要时穿好无菌衣，带好无菌手套。 3.物品管理 无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4.无菌物品 无菌物品必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，有效期一周为宜，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7天，过期应重新灭菌。无菌物品一经使用或过期，潮湿应重新进行灭菌处理。 5.取无菌物 操作者身距无菌区20cm，取无菌物品时须用无菌持物钳（镊），不可触及无菌物品或跨越无菌区域，手臂应保持在腰部以上。无菌物品取出后，不可过久暴露，若未使用，也不可放回无菌包或无菌容器内。疑有污染，不得使用。未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6.无菌操作 如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 一物一人，一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。
******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素
******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
E X C E L如何只复制筛选 后的条目 The latest revision on November 22, 2020
Excel如何只复制筛选后的条目 选择你要复制的内容，接着按组合键ALT+:(ALT＋冒号：）来选取可见单元格，右键复制，再粘贴就行了。以下供你参考 ----------------------- 本人昨天在用excel2007的时候，发现筛选后粘贴，还是全部的数据，很是郁闷，不象2003，粘贴的是筛选后的数据，在网上搜索了一把，发现了以下几个方法，记录一下，俺用了， copy前，按ALT+；的方法，屏幕提示选择了数据后，再按CTRL＋C，然后到另外的sheet进行CTRL＋V， OK，，，，搞定。。呵呵，最快捷了； －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ Excel 2007 筛选后的复制粘贴 在Excel 2007中，有时需要把筛选后的数据复制粘贴到另一个表中 ，但是粘贴时发现结果并不是筛选出来的数据，而是所有的数据。这个 问题可以用下面三个方法来解决。 方法1：进行两次以上的筛选操作，筛选操作可以是同一列或不同
列。只进行一次筛选操作，表面上选择的是筛选后的数据，其实包括了 未筛选的全部数据。所以我们在筛选后进行复制粘贴时，有时是筛选后 的可见数据，有时是全部数据。 其实是可以判断复制后的数据是筛选后的还是全部的：如果复制后 许多行都有闪动的波纹线，就是筛选后的数据，如果只在所选数据的四 周出现闪动的波纹线，就是全部数据。 方法2：筛选后选择需要复制的区域，选择“开始→查找和选择→ 定位条件→可见单元格”，再进行复制粘贴，就是筛选后的内容了。 方法3：筛选后选择需要复制的区域，同时按下“Alt”和分号键，再复 制粘贴即可。 ------------------------ 在Excel2007中如何才能复制筛选结果 Q：Excel2007中如何才能复制筛选结果 A：Excel2007中有时复制筛选结果，会得到所有未筛选前的数据。解决方法如下： 方法一选定筛选结果区域，Ctr+G定位“可见单元格”，然后再复制粘贴。
无菌技术操作规程 一、无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，必须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗是每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7 天，过期应重新灭菌。 4、工作人员面向无菌区域，用无菌取无菌物品，手臂须保持在腰部水平以上，不可触及无菌物或跨越无菌区，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 5 进行无菌操作时不可面对无菌区讲话、打喷嚏。怀疑无菌物品被污染，不可使用。 6 进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用可，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病人用，以免发生交叉感染
二、准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。 3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒液溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75％酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套好。 5 用物排放有序，符合无菌操作要求。 三、操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2 无菌持物钳使用法： 无菌持物钳须置于无菌容器内，有效期限 4 小时；取、放无菌持物钳时，应将盖打开，钳端闭合，不可在盖孔中取、放；如需取远处物品时，应连同容器一起搬移，就地取出无菌物品。 3、无菌包使用法： 1）、查看无菌包的名称、灭菌日期，查看化学指示胶带粘贴。 2）、将无菌包放在清洁、干燥处，撕开粘贴。 3）、用拇指和食指先揭开左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内
细胞克隆转化筛选系统 1)应用细胞范围至少包含原代细胞、CHO、HEK、Vero、NS0、BHK、CAP-T?、 昆虫细胞以及其他细胞系。 2)转染目标体系至少含DNA、mRNA、siRNA、蛋白质、小分子以及细胞裂解 物等。 3)适用规模至少涵盖基础研究、实验开发、大规模筛选和生产、临床前研究等。 4)★3.4转染成功率：系统对于不同类型的细胞株均有很高成功率，针对CHO 细胞系大于等于90%，需提供文献证明。 5)★3.5细胞存活率：系统对于不同类型细胞株转染7天之后细胞均有很高存 活率，针对CHO细胞系在转染10天之后成活率大于等于90%，需提供文献证明。 6)★3.6转染速度：大于等于5E5cells/s，大于等于2E10cells/30min。 7)★3.7转染通量：5E5到2E10个细胞。 8)★3.8电转方式：可同时进行静态转染和流式转染两种方式。 9)★3.9转染的体积：为50μl到100ml/sample。 10)★3.10流式转染的流速：大于等于8ml\min。 11)3.11系统可扩展性：可以快速和批量转染，当细胞数量在5E5到2E7个时， 可采用小规模转染装置进行静态转染，当细胞数超过1E10个时，可采用大规模转染装置进行流式转染。 12)系统安全性：所应用材料符合化学品安全认证，所有耗材均经过消毒处理。 13)系统通过CE认证 仪器主要配置： 1、Maxcyte STX系统主机：1套 2、配套操作软件：1套 3、配套安装启动包：1套 电脑工作站（最新配置）：1套。CPU：Intel Core I5-7400，四核，三级缓存，6MB；GT7302G DDR3显卡；内存：8GB，速度：DDR4。硬盘：1TB。
无菌技术的原则和注意事项-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
无菌技术操作原则 概念：无菌技术是指在执行医疗护理操作的过程中，防止一切医微生物侵入机体和保持无菌 物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 1.无菌技术：指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体 和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 2.无菌物品：经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品 3.无菌区域：经过灭菌处理而未被污染的区域 4.非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌 物品或区域。 2操作原则 1.环境清洁 进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，减少人员走动，以降低室内空气中的尘埃。防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次，时间20~30分钟即可，也可适当延长消毒时间。 2.无菌操作 衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。必要时穿好无菌衣，带好无菌手套。 3.物品管理 无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4.无菌物品 无菌物品必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，有效期一周为宜，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7天，过期应重新灭菌。无菌物品一经使用或过期，潮湿应重新进行灭菌处理。 5.取无菌物 操作者身距无菌区20cm，取无菌物品时须用无菌持物钳（镊），不可触及无菌物品或跨越无菌区域，手臂应保持在腰部以上。无菌物品取出后，不可过久暴露，若未使用，也不可放回无菌包或无菌容器内。疑有污染，不得使用。 未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6.无菌操作 如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 一物一人，一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。
稳定株构建 FAQ 转自微博思路迪慢病毒包装 1，什么是瞬时转染和稳定转染？ 答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。 2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？ ?答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有： ?1)，外源插入片段的拷贝数。多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。 ?2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。 ?3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。 ?4)，整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。 ?5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株， 或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实 验数据。 3，什么时候需要稳定细胞株？ ?答：以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：
标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 检验员 内容 1简述 1.1本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位（）表示 1.5 细菌内毒素国家标准品（）系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品（）系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水（水）系指内毒素含量小于0.015灭菌注射用水。光度
测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环 境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照 必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250C以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37 土「C保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1C以下。 2.5旋涡混合器 2.6 鲎试剂（应具有国家主管部门的批准文号）及细菌内毒素检查用水（符合规定）。 2.7细菌内毒素国家标准品（），细菌内毒素工作标准品（），除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10 X 75）、三角瓶、小试管（16 X 100）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、 砂轮所用玻璃器皿须经250C干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂75%乙醇、蒸馏水、5师铬酸钾硫酸洗液。 3操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置
护士岗位技能训练和竞赛活动护理技术项目考核要点 目录 一、手卫生 (4) 二、无菌技术 (6) 三、生命体征监测技术 (10) 四、口腔护理技术 (15) 五、鼻饲技术 (16) 六、导尿技术及护理 (17) 七、胃肠减压技术 (19) 八、灌肠技术 (21) 九、氧气吸入技术 (22) 十、换药技术 (23) 十一、雾化吸入疗法 (25) 十二、血糖监测 (26) 十三、口服给药法 (27) 十四、密闭式输液技术 (28) 十五、密闭式静脉输血技术 (29) 十六、静脉留置针技术 (31) 十七、静脉采血技术 (32) 十八、静脉注射法 (33) 十九、经外周插管的中心静脉导管（PICC）护理技术 (35) 二十、动脉血标本的采集技术 (38) 二十一、肌内注射技术 (40) 二十二、皮内注射技术 (41) 二十三、皮下注射技术 (42) 二十四、物理降温法 (43) 二十五、心肺复苏基本生命支持术 (45) 二十六、经鼻/口腔吸痰法 (47) 二十七、经气管插管/气管切开吸痰法 (49) 二十八、心电监测技术 (51) 二十九、血氧饱和度监测技术 (52) 三十、输液泵／微量输注泵的使用技术 (53) 三十一、除颤技术 (55) 三十二、轴线翻身法 (56) 三十三、患者搬运法 (57) 三十四、患者约束法 (61) 三十五、痰标本采集法 (63) 三十六、咽拭子标本采集法 (64) 三十七、洗胃技术 (65) 三十八、"T"管引流护理 (67) 三十九、造口护理技术 (68) 四十、膀胱冲洗的护理 (70) 四十一、脑室引流的护理 (72) 四十二、胸腔闭式引流的护理 (73)
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
无菌技术 目的： 是保持无菌物品不被污染；防止一切微生物侵入或传播；预防医院感染的发生 无菌技术操作原则： 1.环境清洁宽敞并定期消毒，操作前半小时需停止清扫工作，减少走动，避免尘埃飞扬 2.工作人员着装符合无菌操作要求，无菌操作前操作者应衣帽整洁，修剪指甲并洗手，戴口 罩，口罩须盖住口鼻，最好用一次性口罩，一般情况下口罩应每4～8小时更换，一经潮湿细菌易于穿透，应及时更换 3.物品放置有序，标志明显，无菌物品是经过物理或化学方法灭菌后未被污染的物品，无菌 物品必须与非无菌物品分开放置且有明显标志，无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌容器中，无菌包外需标明物品名称，灭菌日期按失效期先后顺序摆放。无菌包有效期为7～14天，取用无菌物品时应使用无菌持物钳，无菌物品一经取出，虽未使用也不得放回无菌容器内。物品已有或已被污染即不可使用，应予更换并重新灭菌。明确无菌区与非无菌区 4.无菌区是经过物理或化学方法灭菌处理而未被污染的区域；非无菌区是未经灭菌处理或经 灭菌处理后被污染的区域。操作者的身体应与无菌区保持一定距离，取放无菌物品时，应面向无菌区，手臂应保持在腰部或操作台面以上，不可跨越无菌区，手不可接触无菌物品，避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏，未经消毒的物品不可触及无菌物品或跨越无菌区域5.一套无菌物品只供一位患者使用，以防交叉感染 无菌持物钳的使用操作中的注意事项： 1.无菌持物钳只能用于夹取无菌物品，不能用于夹取油纱布或换药 2.使用无菌持物钳时，钳端不可高举，手不可触及无菌持物钳的浸泡部分，无菌持物钳使用 后，应立即放回容器内，不得在空气中暴露过久 3.如到远处夹取物品应将持物钳放入容器内，一同搬移 4.无菌持物钳一经污染或已有污染时不得再放回容器内，应重新消毒 5.无菌持物钳和存放容器要定期消毒 无菌容器的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则：打开包布时手只能接触包布四角的外面，不可触及包布内面，不 可跨越无菌面 2.包内物品未用完应按原折痕包好，注明开包日期及时间，限24小时内使用 3.如包布内物品超过有效期，被污染或包布受潮，则需重新灭菌 无菌溶液的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则，不可跨越无菌区 2.不能将无菌物品或非无菌物品伸入瓶内蘸取溶液或直接接触 3.已倒出的溶液虽未使用也不得倒回瓶内 铺无菌盘的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则，非无菌物品及身体应与无菌盘保持适当的距离，身体部位不可跨 越无菌区 2.无菌盘应保持干燥，避免潮湿污染 3.已铺好的无菌盘应尽早使用，有效期不超过4小时 无菌手套的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则 2.注意修剪指甲以防刺破手套，选择合适手掌大小的手套 3.未带手套的手不可触及无菌手套的外面，已戴手套的手不可触及未戴手套的手及手套的内 面。戴手套后如发现手套破损或不慎污染，应立即更换。戴手套后手臂不可下垂，应保持在腰部或操作台面以上视线范围内活动 4.脱手套时应翻转脱下
实验六克隆的筛选和快速鉴定 一、目的 掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。 二、原理 在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。 或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。 三、试剂与仪器 （一）试剂 1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖和0.01%溴酚蓝。 配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml 20% SDS 10ml 250mmol/L EDTA 1.6ml 蔗糖27.2g 1.2%溴酚蓝 1.67ml 加ddH2O至200ml 2．10mg/ml 溴乙啶 3．TBE电泳缓冲液（5×） 4．Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2） 6．dNTP 7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 （二）仪器 1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip 4．培养皿5．PCR扩增仪6．台式离心机 7．紫外分析仪8．恒温水浴 四、操作步骤 （一）快速细胞破碎法测定 1．取1.5ml离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。 2 3．待转化的细菌菌落长到2mm时
体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌。每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。 【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面―次(拖布要专用).紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。―些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。 【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、 PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。
转染克隆的G418筛选和分离 对于需要建立某些基因已经整合到染色体DNA（通过稳定或永久转染）的细胞系来说，理想的是使用选择标记，通常也是必要的。虽然有许多标记可利用，但G418(氨基糖苷类抗生素)为稳定转染试验提供了一种通用方便的选择。G418是一种氨基糖苷类似物，在结构上与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在哺乳动物细胞中表达细菌APH（氨基糖苷类磷酸转移酶）基因将产生G418的解毒作用。 这一程序提供了建立G418选择条件的一般性指导，特殊条件由研究者个人决定。1.建立死亡曲线，确定最佳筛选浓度（参考建立方法见附录）； 2.细胞铺板：转染后24小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控 制细胞密度，不能使细胞太密集，应该少于生长表面的50%，参考为20%-30%）至15cm 培养皿，加入15~20ml培养基（DMEM，含血清）进行培养； 3.用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最 佳筛选浓度的G418进行筛选（对于Hela细胞，一般筛选终浓度为800ug/ml）。具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为800ug/ml（以Hela为例）的培养基15~20ml加入培养皿内即可； 4.换液：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度 （800ug/ml）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死亡大部分（至少30%以上）； 5.撤药维持阶段：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用 培养基含G418的终浓度为200ug/ml（维持浓度），维持生长（若细胞仍有死亡，需要继续降低药的浓度，参考为50-100ug/ml），直至筛选克隆可见为止（大约2~3天）； 6.分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性），减少单个克隆受其他细胞污染 的机会。具体操作是：a.用PBS洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。从培养皿中除去液体，准备24孔板收集克隆；b.从培养皿中用牙签或者棉棒（经过高压）挑取已分离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）；c.在24孔板的一个孔中（事先已加入完全培养基，不含G418）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取下一个克隆； 7.CO2孵箱，温育细胞约两小时； 8.两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着。如果已经附着，用新鲜完全培养基（含 50ug/ml G418）更换24孔板培养基，除去残留的胰蛋白酶，继续培养直到培养物长满； 9.一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是6孔板），用50ug/ml的新鲜完全 培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。
无菌操作原则及注意事 项 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
无菌操作原则及注意事项 无菌操作原则： 1、环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室应每天用紫外线消毒一次。 2、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。 3、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。 4、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。? 无菌操作间 四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 5、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。 6、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。 7、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。 无菌操作技术及注意事项 1、玻璃器皿的消毒和清洁
⑴新购玻璃器皿的处理 新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。 ⑵污染玻璃器皿的处理 ①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%～5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。 ②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。 ③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。 ④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。 2、无菌器材和液体的准备 将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压
转染细胞的稳定筛选 1、药物筛选前的准备 药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。 2、药物筛选注意事项 （1）药筛的时间 加药时间一般为转染后48h。但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h 空白对照 加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。（2）换液 如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。 3、克隆筛选注意事项 若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆后进行验证，验证存在不成功的概率。因此，挑克隆时，应尽量多挑几个克隆，20个左右。 4、稳定克隆筛选步骤 （1）有限稀释法步骤 a)将药筛后的细胞（一般长满六孔板即可,若细胞生长很快药筛时可以在 10cm的dish中进行）用胰酶消化下来 b)对消化后的细胞悬液进行计数（如果细胞数量过大，可先稀释后计数） c)计算后，用枪头吸取约200个细胞（其中有部分为死细胞）到10ml培养 液中充分混匀，剩下的大部分细胞冻存保种 d)然后将以上10ml细胞悬液加到96孔板中，每孔100ul，这样有的孔就可 能只有一个细胞，过程中注意不时用枪头吹打混匀细胞悬液（一个96 孔板得到的克隆可能较少，可以用同样的方法做2-3个96孔板） e)待细胞贴壁后，逐孔在显微镜下观察，没有细胞或者多余一个细胞的孔 划叉，只有一个细胞的孔划勾，以做好标记，如果只有一个细胞的孔数
GMP管理文件 一、引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。 二、目的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。 三、适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。 四、责任者：质检人员。 五、正文： 1、简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于
0.015EU/ml的灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 最大有效稀释倍数（MVD）的确定最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD： MVD＝Cl/λ C为供品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有
细胞转染、药物筛选（试行） 第一天细胞复苏 1、从液氮罐取出一管细胞)，迅速置于37℃水浴锅中溶化。 2、和9ml FBS-DMEM（双抗）一起转移到14-ml的离心管中。 3、离心1000rpm 5min，负压吸去上清。 4、用FBS-DMEM（双抗）重悬细胞，铺到6孔板上（2ml液体）。 12hr后若死细胞很多需换液 1、负压吸去培养基。 2、加入2ml新鲜的FBS-DMEM（双抗）。 第三天细胞传代 1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。 2、室温放置约30秒，吸走胰酶。加入3毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。 3、1：3传代，取2/3平分到2个6孔板的孔内。1孔转染，1孔支原体检测（不含抗性的培养基中连续传3代，最后一次传代后需不换液3天后取细胞做支原体检测）。 4、37度，5%CO2培养。 第五天细胞传代 1、负压吸去培养基，加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。 2、室温放置约30秒，吸走胰酶。加入2毫升FBS-DMEM，吹打至单个细胞状态。 3、细胞计数，传代。使细胞数达到6*105个/毫升，取2毫升/孔加到2个孔内。（与支原体检测孔分开操作） 4、37度，5%CO2培养。 第六天转染 1、观察细胞，若状态良好，且细胞密度达到70-80%可以进行细胞转染。 2、转染前2个小时细胞换上1毫升新鲜的FBS-DMEM（含血清，不含抗生素）。 3、2个小时后取0.1毫升DMEM（不含药物，不含血清）加入1.5毫升EP管中。 4、从-20度中取出DNA（1ug/ul），待全部溶解后将DNA混匀，取4 ug DNA加入到0.1毫升 DMEM中，混匀。 5、将已溶解的PEI（PEI一定要最后加入）吹打混匀，取12ul加入0.1毫升DMEM中，将 PEI、DNA、DMEM三者轻轻吹打混匀。室温放置15分钟。 6、将三者混合物分多点加入到2个小时前换液的细胞，成十字形摇晃培养基。 7、37度，5%CO2培养。 8、6小时后换上新鲜的FBS-DMEM（双抗）继续培养。 (若是双转浓度比例为DNA(1+2):PEI=1:3,即DNA1为2ug ，DNA2为2ug，PEI为12 ul) 第七天细胞传代 1、转染后24小时负压吸去培养基。 2、加入2ml PBS，吸去PBS，加入0.5ml Trypsin。 3、室温放置约30秒，吸走胰酶。加入2毫升FBS-DMEM（可以含抗生素），吹打至单个细胞 状态。 4、1：3传代到3个10cm培养皿。 5、37度，5%CO2培养。
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。