单克隆抗体原理
抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体。B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂; 而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性
单克隆抗体制备过程
杂交瘤细胞的制备
1)．提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
2)．应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性
3)．对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，并进行克隆化培养，得到稳定的杂交瘤细胞，再进行大规模培养获得单克隆抗体。
单克隆抗体的提纯
工业发酵主要类别,乙醇发酵、食品发酵、微生物发酵
发酵工程的一般过程可分为三个步骤：第一，准备阶段；第二，发酵阶
段；第三，产品的分离提取阶段。
为什么说基因工程发酵工程和酶工程之间存在着交叉渗透现象？
1. 比如想获得某种可以治疗疾病的蛋白酶——这种酶的制备、纯化等过程就属于酶工程。
2. 这种蛋白酶是某生物的某基因的产物，把这个基因克隆构建到载体上——这就属于基因工程。
3. 把基因整合到细胞里面表达，得到这种酶——这就属于细胞工程。
4. 把细胞放到发酵罐中大规模生产——这就属于发酵工程。
利用固定化生物催化剂的优点有很多：
①酶成份可以重复利用；
②适合于连续操作；
③产品中不会掺杂入酶；
④可以更加精确地控制催化过程；
⑤酶的稳定性得到改善或提高；
⑥可发展成多酶反应系统；
⑦减少了下水排放的问题；
⑧在工业和医药业上有大的潜力等。
论述蛋白质工程与基因工程的关系
基因工程的发展有四代：第一代蛋白多肽基因的高效表达，也称经典基因工程；第二代蛋白编码基因的定向诱变，也称蛋白质工程；第三代代谢信息途径的修饰重构，也称途径工程；第四代基因组或染色体的转移，也称基因组工程。可见，蛋白质工程是基因工程的一部分，是基因工程发展的第二代。
简述特异性免疫答应和非特异性免疫答应的基本过程和特点
1）无特异性，作用广泛；
（2）先天具备；
（3）初次与抗原接触即能发挥效应，但无记忆性；
（4）可稳定遗传；
（5）同一物种的正常个体间差异不大。
非特异性免疫是机体的第一道免疫防线，也是特异性免疫的基础。适应性免疫应答包括细胞免疫与体液免疫，其特征是：
（1）特异性，即T、B淋巴细胞仅能针对相应抗原表位发生免疫应答；
（2）获得性，是指个体出生后受特定抗原刺激而获得的免疫；
（3）记忆性，即再次遇到相同抗原刺激时，仍存在于体内的记忆细胞产生免疫效应，出现迅速而增强的应答；
（4）可传递性，特异性免疫应答产物（抗体、致敏T细胞）可直接输注使受者获得相应的特异免疫力（该过程称为被动免疫）。
（5）自限性，可通过免疫调节，使免疫应答控制在适度水平或自限终止。
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则 本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体 （一）杂交瘤细胞 1．亲本细胞 （1）骨髓瘤细胞 SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。 （2）免疫亲代细胞 经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。 应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。 2．细胞融合与克隆化 采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。 3．杂交瘤细胞检定 （1）抗体分泌稳定性 连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。 （2）细胞核学特征
检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。 4．鼠源病毒检查 按附录要求检测鼠源病毒。 5．支原体检查 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 6．无菌试验 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 （二）单克隆抗体的检定 1．免疫球蛋白类及亚类 用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。 2．亲和力 用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。 3．特异性 测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。 4．交叉反应 按附录要求。 免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应，用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定。来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
单克隆抗体研制最详细步骤 作者：时间：2008-05-15 15:54:24 来源: 生物谷浏览评论 1、单抗的标记 目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断（盒）的形式提供，其中核心为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。 （1）酶标记 A、辣根过氧化物酶（HRP）标记 辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： a. 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 b. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 c. 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。 d. 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。 e. 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。 f. 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。 g. 酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量（mg/ml）=OD403×0.4 IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62 克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。 h. HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。 程序二： 1. 将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。 2. 再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。 3. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。 4. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。 5. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。 6. 用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。
单克隆抗体制备的技术原理 单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞及其后代所产生的抗体，具有单一、特异与纯化的特性。该抗体在医学临床诊断及治疗上具有极其重要的作用。因此它的问世在现代免疫学上具有划时代的意义。 大家知道，当外源性物质在人体或动物血液中出现时，机体中有一些淋巴细胞便会做出反应，产生一些特殊的免疫球蛋白，叫做抗体。而那些外源性物质则称为抗原。抗体与抗原能发生特异结合，从而清除异物，达到保护肌体的作用。抗原不同，它所诱发的抗体也不一样。如细菌或病毒表面存在着几种抗原，因此它们就会对应地诱发出几种不同的抗体。过去人们为了获得抗体，就根据上述原理，反复注射某种抗原到动物（如兔、羊、马等）体内，然后从其血清中分离出所需的抗体。长期以来，用这种经典方法得到的抗体，往往存在着两个严重的缺点：第一，这些抗体不是均质的，而是一种抗体的混合物，特异性差，效价低；第二，抗体的产生是有限量的，因为分泌抗体的成熟淋巴细胞寿命很短，一般只能存活几天，无法大量生产。 为了克服上述缺点，许多免疫学家曾进行了长期的研究与探索，这一难题终于在1975年被国外两名免疫学家考勒和米尔斯坦解决了。他们利用自己创立的杂交瘤技术，使产生抗体的淋巴细胞能在体外长期存活，并源源不断地分泌抗体。这就是有高特异性和非常均质的单克隆抗体。 单克隆抗体的技术原理并不十分复杂。它是把能产生单一抗体的淋巴细胞与有增殖能力的骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，又称杂交瘤。由于这些杂种细胞继承了双亲细胞的遗传物质，因此它们不仅能表现出淋巴细胞分泌单一抗体的能力，而且还能表现出骨髓瘤细胞在体外大量繁殖的本领。就这样，取长补短，使杂交瘤变成了一座制造单克隆抗体的理想“工厂”。 目前制备单克隆抗体的具体方法，主要有以下三步（图2－9）。 第一步：将抗原注射到小鼠体内进行免疫，取出受免脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合。 第二步：用选择培养基，选出杂交瘤细胞，逐一克隆或扩增，从中挑出能产生抗体的杂交瘤细胞。 第三步：将杂交瘤细胞接种在培养瓶中扩大培养或注射到动物的体液中作为腹水癌生长，然后再分离纯化单克隆抗体。
人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点 前言 生物制品评价和研究中心（CBER）正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点（PTC）”。该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助，包括研究性新药（IND）和产品许可证申请时应提交的资料。 此文件取代了1987年的文件，并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验，这些会议包括： 1．FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。 2．由国际生物标准化学会（IABS）发起并于1990年11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。 3．由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起，于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。 4．由FDA和NIH联合发起，于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。 单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规（21 CFR部分200～299和600～680）。与CBER制定的其他考虑要点一样，单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时，则应根据具体情况进行评估。本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论，发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。 某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作，或由CDRH与CBER联合复审，各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。 主档案 在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料，而应在临床开发阶段，由适当的中心以对话方式指导下，使资料不断完善。在某些情况下，在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时，资料应归于单一主档案
收稿日期:2001208214;修回日期:2002202210 作者简介:范我(1941～),女(汉族),浙江人,研究员,放射性药物专业 第15卷第3期 2002年8月 同 位 素 Jou rnal of Iso topes V o l .15 N o .3A ug .2002 用于肿瘤治疗的90Y 标记单克隆抗体和受体 范 我 (苏州大学核医学院,江苏苏州 215007) 摘要:简述了90Y 标记M c A b 和肽2受体的标记方法、动物实验、临床应用以及剂量估算等方面的研究概况。关键词:90Y ;单克隆抗体和受体;肿瘤治疗 中图分类号:R 730155;O 6141322 文献标识码:A 文章编号:100027512(2002)0320168207 用于治疗的放射性核素利用射线对细胞的 杀伤作用达到治疗目的。一般发射Β-或Α射线, 且有较高的能量、半衰期适中,进入体内后在短时间内即可达到预定的辐射剂量,以保证治疗效果。目前用得最多的核素是131I ,容易得到,价格低廉。其优点是易于标记蛋白质、多肽类生物大 分子物质。近年来又有多种Β-发射体核素用于治疗,如153Sm 、186R e ,89 Sr 等。但是对用于标记单克隆抗体(M c A b )和受体的放射性核素,又有一 些特殊的要求。单抗和受体与一般化合物相比,分子大而与放射性核素结合位点少,因此宜用高比活度或无载体核素进行标记,以提高标记比活度。在几种无载体核素中,尤以188R e 和90Y 受到青睐,它们通常分别由188W 2188R e 和90Sr 290Y 发生器得到,可随时应用,方便、经济。因此除188R e 之外,近年来对90Y 的标记及应用研究也逐渐增多。 90 Y 是纯Β-发射体核素,Β-射线能量高, E m ax =2.3M eV ,在组织内最大射程可达12 mm ,R 95(Β粒子把95%的能量传给靶组织的距 离)可达5.94mm ,有利于对肿瘤组织的均匀照射,其平均杀伤细胞的范围为131I 的10～20倍;半衰期为64h ,对标记物到达肿瘤并发挥射线的杀伤作用均较合适;其不发射Χ射线的特点使 射线对周围正常组织无害,给药后对患者也不需要特别防护,甚至可接受门诊治疗。相比之下, 131 I 与M c A b 的结合不够稳定,进入机体内容易 脱碘,对非靶器官造成辐射损伤;131I 的核性质也 不甚理想:它除了发射Β-射线外还发射高能Χ 射线,非但无助于治疗,而且引起对周围组织的 辐射损伤及环境污染;另外,131I 发射的Β-射线 能量弱,在机体内的穿透深度不超过3mm ,R 95仅为0.992mm ,不利于手术后杀灭浸润到周边组织中的残留恶性细胞。与放射性铼相比,90Y 既具有与186R e 同样理想的高Β-射线能量和适 中的半衰期,又与188R e 同为适于标记生物大分子的无载体核素,用于核素治疗有良好的应用前 景。此外,还有多种稀土核素如177L u 、169E r 、166D y 等也有理想的核性质,除了半衰期适中外,发射 Β-射线的能量分别为0.5、 0.3和0.4M eV ,与111In 的俄歇电子、90Y 的高能Β-射线一起,构 成了低、中、高三个能量段,适用于不同大小、不同类型的肿瘤治疗。这些核素与90Y 具有相似的化学性质,标记方法可互相借鉴,也使人们对90Y 标记的放射性药物产生了更大的兴趣。 使用90Y 的缺点是母体90Sr 的半衰期长达28.5年,而90Sr 是亲骨类的高毒性核素,它在人 体骨中吸收受到严格的限制,因此对90Sr 290Y 的
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
单克隆抗体Gazyva(obinutuzumab)注射液使用说明书 2013年第一版 Gazyva(obinutuzumab)注射液使用说明书2013年第一版 新生物制品 批准日期：2013年11月1日；公司：Genentech 药物是第一个具有突破性的治疗指定获得FDA批准 Gazyva是具有突破性的治疗指定获得FDA批准第一个药物。这个指定被承办单位请求和在递交给FDA支持上市批准的生物制品许可申请后很快被授权。在承办单位请求时如果初步临床证据表明药物可能对有严重或危及生命疾病患者可能提供超过可得到治疗重大改善时，FDA可以指定某个药物是突破性治疗。 优先审评，孤儿产品指定 FDA的药物评价和研究中心血液学和肿瘤学产品室主任Richard Pazdur，M.D.说：“今天的批准代表对有CLL患者一个重要的新添加治疗”“这个批准反映对突破性治疗指定程序的承诺，允许我们与公司合作加快发展，审查和提供重要的新药物。”。 https://www.doczj.com/doc/6c18150486.html,/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf 处方资料重点 这些重点不包括安全和有效使用GAZYVA所需所有资料。请参阅GAZYVA完整处方资料。 GAZYVA(obinutuzumab)注射剂，为静脉输注 美国初次批准：2013
适应证和用途 GAZYVA(obinutuzumab)是一种针对CD20溶细胞抗体和适用于与苯丁酸氮芥[chlorambucil]联用，为有既往未治疗过慢性淋巴性白血病患者的治疗。(1，14) 剂量和给药方法 （1）用糖皮质激素，对乙酰氨基酚[acetaminophen]和抗组织胺预先给药。(2.2) （2）为静脉输注稀释和给药。不要静脉推注或丸注。(2.1) （3）对6个疗程推荐剂量(28天疗程)： 1）在疗程1第1天100 mg 2）在疗程1第2天900 mg 3）在疗程1第8和15天1000 mg 4）在疗程2-6第1天1000 mg (2.1) 剂型和规格 1000 mg/40mL (25 mg/mL)单次使用小瓶. (3) 禁忌证 无。 警告和注意事项 （1）输注反应：患者用糖皮质激素，对乙酰氨基酚和抗组织胺预先给药。输注期间严密监视. 对反应中断或终止输注。(2.2，5.3) （2）肿瘤溶解综合征：预料肿瘤溶解综合征;用抗高尿酸血症药物预先给药和充分水化尤其是对有高肿瘤负荷和/或高循环淋巴细胞计数患者。纠正电解质异常，提供支持性医护和监视肾功能和液体平衡。(5.4) （3）中性粒细胞减少：对感染监视。(5.6) （4）血小板减少：监视血细胞计数和出血。出血的处理可能需要血液制品支持。(5.7) （5）免疫接种：不要给活病毒疫苗GAZYVA给予前或期间。(5.8) 不良事件 最常见不良事件(发生率≥10%)是：输注反应，中性粒细胞减少，血小板减少，贫血，发热，咳嗽，和肌肉骨骼疾病。(6) 完整处方资料
授课人：曾屏珊 班级：高二（3）班 时间：20XX年5月3日（星期四）上午第2节 【教学目标】 1．知识目标： 举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用。 (1) 能简述动物细胞融合的概念。 (2) 能简述动物细胞融合的基本过程。 (3) 能列出动物细胞融合与植物细胞融合的异同。 (4) 能列举细胞融合技术的优点及实际应用。 (5) 能描述单克隆抗体的含义。 (6) 能简述单克隆抗体的制备过程。 (7) 能列举单克隆抗体的优点及实际应用。 2．能力目标： 偿试设计单克隆抗体的制备过程。 3.情感态度价值观 体验科学研究过程是科学、技术、社会三者之间的关系。 【教学重点】单克隆抗体的制备和应用 【教学难点】单克隆抗体的制备过程 【课时安排】1课时 【学情分析】 学生已经学习了植物体细胞杂交的知识，动物细胞融合与植物原生质体融合的原理及方法基本相同，对这部分知识学生学起来应该较轻松。单克隆抗体的制备过程是本节的重点和难点，学生在学习过程中会产生疑问：“为什么要进行两次筛选”、“怎样进行筛选”、“为什么这种抗体叫单克隆抗体”，所以在教学中应把更多的精力放在“单克隆抗体的制备”上。【教学策略】 以问题和任务驱动教学，组织学生进行自学学习，在问题的解决中、习题的反馈中完成本节教学任务。 【教学程序】
【教学反思】 通过学案引导学生自学，在课堂上根据教学目的创设教学情境，敢于放手，给学生充足 的学习时间，调动学生的主动性，让学生充分地交流；在学生的交流的同时，能适时地引导 学生彼此沟通和相互理解；有效地促进了学生学习方式的转变，锻炼了学生敏捷的思维能力 和准确的语言表达能力，拓展延伸了学生的视野，提高了学生的生物科学素养。 课堂上学生交流的时间没把握好，导致未完成本节课全部内容。以后课堂上应注意这方 面的问题，将课堂还给学生的同时，还要做好引导者的工作。 提出问题：该方案能达到预期效果吗?为什么？
125I标记单克隆抗体技术 同位素标记是一种重要的抗体标记技术，牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外，还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。 (一)原理 氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠，在水溶液中生成次氯酸，为一种温和氧化剂，当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中，可将I２氧化为I＋并结合到氨基酸上。如标记条件温和，标记后的McAb仍具有良好的结合活性，通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。 (二)方法 在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg／100μl， 再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液 再加入10μl(含1mCi)125I ↓ 加入10μl氯胺-T(5mg／ml溶于0.05M 磷酸盐缓冲液)，孵育时间不超过30秒 ↓ 加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg／ml溶于 0.05M磷酸缓冲液) ↓ 加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M 磷酸缓冲液＋4％牛血清白蛋白) ↓ 用PD10柱(Sephadex G25)除去游离125I 用4％BSA PBS洗脱 ↓ 分部收集，0.5ml／管 每管取5μl进行γ计数，计算标记抗体的比活性和标记率
结合于McAb１２５I放射性强度(cpm) 标记率(％)＝─────────────────── 总放射性强度(cpm) 结合于某一管McAb上的放射性强度 比活性(μCi／μgMcAb)＝──────────────── 某一管McAb总量 (三)试剂器材 1.纯化后的McAb 2.0.05M磷酸缓冲液，氯胺桾，偏重亚硫酸钠，KI，BSA 3.125I 4.有通风装置的超净台，γ计数仪 5.PD10柱(Sephadex G25) (四)注意事项 1.严防同位素污染，工作人员必须穿着工作衣，戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用125I和标记物应妥善保管。 2.如标记细胞因子、激素等，应选用更温和的标记方法，使保持更好的生物学活性。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则 2003年03月20日发布 本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体。 一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体 （一）杂交瘤细胞 1．亲本细胞 （1）骨髓瘤细胞 SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系。应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型，具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征，并有明确的来源历史及符合要求的保存条件。 （2）免疫亲代细胞 经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞。 应有明确的免疫原来源、性质及动物种系，免疫原详细的制备过程。 适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法。 2．细胞融合与克隆化 采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化。 3．杂交瘤细胞检定 （1）抗体分泌稳定性 连续克隆化后抗体阳性率达100%，经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏，
细胞系能保持稳定分泌特异性抗体。 （2）细胞核学特征 检查细胞分裂中期染色体，应符合杂交瘤细胞特征。 4．鼠源病毒检查 按附录要求检测鼠源病毒。 5．支原体检查 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 6．无菌试验 按现行《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。 （二）单克隆抗体的检定 1．免疫球蛋白类及亚类 用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定。 2．亲和力 用可靠、准确的方法测定单克隆抗体（以下简称为单抗）的亲和常数或相对亲和力。一般情况下，对于免疫原为可溶性的单抗，测其亲和常数，对于免疫原为颗粒性抗原的单抗，测其相对亲和力。 3．特异性 测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析。
单克隆抗体的制备 摘要:单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。下面主要讲述制备单抗的实验过程。 关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞 现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。 1．国外现代生物技术产业发展的现状 自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。
制备单克隆抗体方法 1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。 这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法，利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 制备过程
1、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。 2、细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。 3、选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。 (1)体内诱生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。 (2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
“单克隆抗体”学习中的几个问题分析 “单克隆抗体”是动物细胞工程的重要内容，动物细胞融合技术的重要应用就是制备单克隆抗体，学生对这项现代生物技术既充满兴趣又深感抽象，教材仅以“单克隆抗体制备过程示意图”和简单的文字描述来介绍，因而要达到课标要求的理解、综合应用水平，还需有一定的背景知识，如：免疫学基础，细胞融合过程及其对性状表达的影响等知识。基于此，本文围绕这些问题进行分析解答，以便于师生教与学。 1.一种抗原能使机体产生几种抗体 免疫学告诉我们抗原是指能引起机体发生特异性免疫反应的任何物质或病原体，包括自身的衰老、损伤细胞和癌变细胞。抗原具有异物性、大分子性和特异性的特点。其特异性与抗原分子表面和分子内部的特定的化学基团——抗原决定簇有关。一般，一个抗原分子具有多个抗原决定簇，如：流感病毒有40多个，白喉类病毒有8个。抗原决定簇是免疫细胞识别抗原的重要依据，也是诱导淋巴细胞分化的刺激因素，又是同相应抗体结合的部位。抗原注射到人和哺乳动物体内，一个B淋巴细胞只能接受一种抗原决定簇的刺激，分化为效应B 淋巴细胞和记忆细胞，并能产生与该抗原决定簇特异性结合的特异抗体。即一种抗原决定簇指引起一种特异抗体，因而一种复杂的抗原进入机体后，可刺激机体不同的B细胞分化产生多种抗体。这些抗体各不相同，只能与相应的抗原决定簇结合，因而都可以和该抗原结合，但结合部位不同，即一种抗原引起机体产生多种特异的抗体，但每一个效应B淋巴细胞只能产生其中一种特异的抗体。这样血清抗体就是由多个不同的B淋巴细胞应答一个抗原的结果，即不同淋巴细胞产生的特异抗体能与该抗原的不同抗原决定簇结合，因此，血清抗体纯度低、灵敏度低、特异性差。单克隆抗体是由同一种B淋巴细胞群体（克隆化）合成并分泌的，这些抗体均一，只识别同一种抗原决定簇，因而特异性强、灵敏度高。 2.为什么在得到杂交瘤细胞后，还要进行抗体检测和筛选 经过选择培养基筛选，得到的杂交瘤细胞不一定能产生所需的特异抗体。原因有三：①经抗原处理过的机体脾脏中提取的细胞不一定都是效应B细胞，因而杂交瘤细胞不一定产生抗体；②即使相应的效应B细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，也由于细胞融合时，有部分染色体的随机丢失，若与抗体合成有关的基因所在的染色体丢失了，不能产生抗体，或者即使融合细胞没有丢失，也会由于杂种细胞中遗传物质的表达受到相互干扰而无法正常表达，因而只有极少数杂交瘤细胞能产生特异的抗体；③由于一种抗原刺激机体可使机体中存在多种浆细胞，所以杂交瘤细胞产生的抗体不一定是所需的抗体，也不是单一的抗体。因此需要利用多孔细胞培养板培养，检测各孔的上清液中细胞分泌的抗体，将阳性孔进行有限稀释法选择，保证毎孔中的细胞为单克隆细胞，这样的细胞群进行大量的体内或体外培养，可得到特异强性灵敏度高的单克隆抗体。 3.单克隆抗体的制备过程为什么只需两个阶段的筛选 单克隆抗体的制备，其实质是将能产生所需特异抗体的效应B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选得到既能产生所需特异抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞，对其进行动物细胞培养，从培养液中分离提纯单克隆抗体即可。因而有学生认为在细胞融合前，先从脾脏提取的制敏细胞中，筛选得到特异的效应B淋巴细胞，要筛选三次。这种想法是存在偏差的，也是没有必要的，基于前面的讨论可知，首先效应细胞在体外不能增殖，因而很难筛选，其次即使能筛选到目标细胞，经融合后，也不一定能产生抗体，根据实验简约原则，不需要这次筛选，所以单克隆抗体制备过程只进行两次筛选：第一次选择得到多种杂交瘤细胞，第二次选择得到既能产生所需特异抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞。