酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点 【摘要】酶是高效生物催化剂，在工业、医学、科研等领域有着非常广泛的应用，尤其在工业生产中创造出巨大的经济效益。但由于酶是蛋白质，稳定性差且在生物体内具有较大的免疫原性，因而严重制约了其应用。对酶分子进行化学修饰是提高其稳定性的方法并且能够降低在生物体内的免疫原性，能够扩大其应用范围，极大地改善酶本质的不足。简要介绍酶的化学修饰基本原理及修饰酶的性质特点。 1 酶的化学修饰的基本原理 酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构的改变和对其侧链基团的改变。前者是分子生物学层次上的修饰，即在己知酶的结构与功能盖系的基础上，有目的地改变酶的某个活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状，又称理性分子设计，理性分子设计主要应用于改造酶的底物特异性．催化特性以及热稳定性,Shaffer等通过将天冬氨酸转氨酶的Val39、 Lys41、Thr47、Ash69、Thrl09和Ash297突变为酪氨酸转氨酶所对应的Lcu、Tyr、Ile、Leu、Set和Ser，修饰酶对Phe的活性增加3个数量级，而对Asp的活件没有影响，然而，由于酶的结构、功能和作用机制没自完全了解，而且仅仅把氨基酸序列的同源性作为氨基酸取代的标准，加上氨基酸取代后有可能导致没构想的改变，所以，并非所有理性分子设计都能取得预期效果，这就严重制约了理性分子设计的应用。 1. 1功能基团的修饰 酶分子可离解的基团如氨基(NH2)、羧基(～COOH)、羟基（OH)、巯基(sH)、咪锉基等都可用来修饰。脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面的氨基酸的电荷，酰化反应，可改变侧链羟基性质。这些修饰反应，可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。 1.2用表面活性剂对酶进行化学修饰 除糖基修饰外，也有人用表面活性剂对酶进行化学修饰。表面活性剂的亲水部分与酶连在一起，而亲油部分伸向有机溶剂，从而提高了酶在有机溶剂中的溶
酶分子的化学修饰方法 1.酶的表面修饰 2.酶分子的内部修饰 3.与辅因子相关的修饰 4.金属酶的金属取代 1.1酶的表面修饰 1.1.1化学固定化 例如:①固定在电荷载体上，由于介质中的质子靠近载体，并与载体上的电荷发生作用，使酶的最适pH向碱性(阴离子载体)或向酸性(阳离子载体)方向偏移。这样，在生产工艺中需几个酶协同作用时，由于固定化可使不同酶的最适pH彼此靠近。②将糖化酶固定在阴离子载体上，其最适pH由4.5升到6.5，与D-木糖异构酶的最适PH(7.5)靠近，这样，可简化高果糖浆生产工艺。如果载体与底物带相同电荷，固定化后反应系统Km值增加；带相反电荷，Km值降低。当酶与载体连接点达到一定数目时，可增加酶分子构象稳定性，防止其构象伸展而失活。 1.1.2 酶的小分子修饰作用 例如:③将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰成亲水性更强的NH2COOH并达到一定程度时，酶的热稳定性在60℃时，提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活. 1.1.3酶的大分子修饰 例如:④聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链裂解，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。 1.1.4 分子间交联
例如:⑤戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低，也使其反应器体积减少。将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联而形成的杂化酶，可作为部分代谢途径的模型，则有可能在体内将它们输送到同一部位而提高药效。 1.2酶分子的内部修饰 1.2.1非催化活性基团的修饰 例如: ①将胰凝乳蛋白酶的Met192氧化成亚砜，则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的束缚口袋有关．也说明底物的非反应部分束缚在酶的催化作用中有重要作用。 1.2.2酶蛋白主链修饰 例如: ②用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。该活化酶仍为四聚体，亚单位分子量变化不大。这说明天然酶并非总是处于最佳的催化构象状态。 1.2.3催化活性基团的修饰 例如: ③枯草杆菌蛋白酶活性部位的Ser残基转化为Cys残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水解高度活化的底物，如硝基苯脂。 1.2.4肽链伸展后的修饰 例如: ④为了有效地修饰酶分子内部的区域，Mozhea等提出先用脲、盐酸胍处理酶．使其肽链充分伸展。为修饰酶分于内部疏水基团提供可能性，然后，让修饰后伸展肽链在适当条件下．重新折叠成具有某种催化活性的构象。⑤Saraswothi等描述了一种新奇的原则上可能普遍适应改变底物专一性的方法。即先让酶变性，然后加入相应于所希望酶活力的竞争件抑制剂，待获得所希望酶
第三章酶 一、名词解释 1.Km 2.限速酶 3.酶的化学修饰 4.结合酶 5.Allosteric regulation 6.别构调节 7.Activators 8.辅基 9.反竞争性抑制作用 10.酶的特异性 二、填空 1.在酶浓度不变的情况下，底物浓度对酶促反应速度的作图呈____________双曲线，双倒数作图呈线。 2. Km值等于酶促反应速度为最大速度时的________________浓度。 3.关键酶所催化的反应具有下述特点：催化反应的速度，因此又称限速酶；催化反应，因此它的活性决定于整个代谢途径的方向；这类酶常受多种效应剂的调节。 4. 可逆性抑制作用中，抑制剂与酶的活性中心相结合，抑制剂与酶的活性中心外的必需基团相结合。 5. 酶的化学修饰主要有磷酸化与脱磷酸，，________________，腺苷化与脱腺苷及SH与-S-S-互变等，其中磷酸化与脱磷酸化在代谢调节中最为多见。 6. 同工酶指催化的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质的一组酶。 7. 竞争性抑制剂使酶对底物的表观Km ，而Vmax 。 8. 酶的特异性包括特异性，特异性与特异性。 三、问答
1.简述酶的“诱导契合假说”。 2.酶与一般催化剂相比有何异同？ 3.什么是同工酶？请举例说明。 4.金属离子作为酶的辅助因子有哪些作用？ 5.说明温度对酶促反应速度的影响及其实用价值。 参考答案 一、名词解释 1. 即米氏常数。Km米氏常数是单底物反应中酶与底物可逆地生成中间产物和中间产物转化为产物这三个反应的速度常数的综合。Km=k2+k3/k1 米氏常数等于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 2.指整条代谢通路中，催化反应速度最慢的酶，它不但可以影响整条代谢途径的总速度，还可改变代谢方向，是代谢途径的关键酶，常受到变构调节和/或化学修饰调节。 3.某些酶分子上的一些基团，受其他酶的催化发生共价化学变化，从而导致酶活性的变化。 4.酶分子中除含有氨基酸残基组成的多肽链外，还含有非蛋白部分。这类结合蛋白质的酶称为结合酶。其蛋白部分称为酶蛋白，非蛋白部分称为辅助因子，有的辅助因子是小分子有机化合物，有的是金属离子。酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物称为全酶，只有全酶才有催化活性。 5. 即变构调节，某些物质能以非共价键形式与酶活性中心以外特定部位结合，使酶蛋白分子构象发生改变，从而改变酶的活性。 6.体内有的代谢物可以与某些酶分子活性中心外的某一部位可逆地结合，使酶发生变构并改变其催化活性。此结合部位称为别构部位或调节部位。对酶催化活性的这种调节方式称为别构调节。受别构调节的酶称为别构酶。导致别构效应的代谢物称为别构效应剂。有时底物本身就是别构效应剂。在多数情况下，代谢途径中的第一个酶或处于几条代谢途径交汇点的酶多为别构酶。当后续代谢产物堆积时，它们作为效应剂抑制上游的别构酶；别构酶也可因产物的匮乏而激活。 7. 即激活剂。使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂。激活剂大多为金属离子，少数为阴离子。也有许多有机化合物激活剂。大多数金
第四章酶分子改造 教学目的：使学生了解酶分子改造的意义和酶分子改造的常用方法。 教学重点、难点：酶分子改造的常用方法，酶蛋白侧链基团修饰和氨基酸置换修饰。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节酶分子修饰概述 一、概述 酶的广泛应用 应用大规模应用酶和酶工艺的尚不够多 酶自身缺点是最根本的原因 不稳定，不适合大量生产需要 工业应用中，常偏离酶最适pH 临床上，外源蛋白质，具有抗原性 改变酶特性的两种主要方法 化学修饰 基因工程技术（蛋白质工程） 二、概念 指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的过程 创造出天然酶不具备的某些优良性状 提高酶活力 增加酶稳定性 消除或降低酶的抗原性，扩大应用范围，提高经济效益 三、酶分子修饰常用方法 部分水解酶蛋白的非活性主链 利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰 酶辅因子的置换等 基因工程、蛋白质工程（氨基酸置换） 第二节金属离子置换修饰 一、概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法，简称离子置换法二、原理 金属离子往往是组成酶活性中心的部分，对酶的催化功能起重要作用 金属离子的除去、加入与金属离子的置换 活力改变、稳定性等改变 只适用于本来就含有金属离子的酶？ 三、常用金属离子 Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Mn 2+、Co 2+、Cu 2+、Fe 2+ 四、操作 酶纯化 EDTA鳌合
透析、超滤、分子筛除鳌合物 加入不同金属离子确定实验结果 五、例 锌型蛋白→钙型蛋白，活力提高20%-30% 杂离子型a-淀粉酶→钙离子型，活力提高并增加稳定性，结晶型活力比一般杂离子型结晶高3倍以上 Fe-SOD→Mn-SOD，对H2O2稳定性增强，对NaN3敏感性显著降低 Zn-酰基化氨基酸水解酶→Co型，最适pH从8.5降低到7.0，Km增大 第三节大分子结合修饰 一、概念 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。是目前应用最广泛的方法。 二、方法 1、修饰剂选择 根据酶分子结构和修饰剂特性选择 右旋糖酐、PEG、肝素、葡聚糖、环糊精、CMC、蔗糖聚合物（Ficoll）、聚氨基酸等 2、修饰剂活化 大分子修饰剂使用前一般要活化，才能与酶分子中相应基团共价结合 考虑酶和大分子修饰剂的空间位阻效应 不同的酶结合的修饰剂种类和数量不同，造成酶功能的改变也不一样，需试验确定最佳的修饰剂的种类和浓度，并注意操作条件 例 PEG：甲基化屏蔽一个羟基得到单甲氧基聚乙二醇（MPEG） 不同类型的PEG衍生物： 聚乙二醇均三嗪衍生物 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 聚乙二醇胺类衍生物 聚乙二醇马来酸酐衍生物 右旋糖苷-（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷 3、修饰 活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH 值等条件下反应，使两者以共价键结合 4、分离 通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶 三、大分子修饰作用 提高酶活力（空间构象改变，利于底物结合） 1分子核糖核酸酶+ 6.5分子右旋糖苷—酶活提高2.25倍 1分子胰凝乳蛋白酶+ 11分子右旋糖苷—酶活提高原来的5.1倍 1分子胰凝乳蛋白酶+ 11分子右旋糖苷—酶活提高5.1倍 增加酶的稳定性 降低或消除酶蛋白抗原性 精氨酸酶（抗癌）经PEG结合修饰后，其抗原性显著降低或消除
酶分子化学修饰研究 摘要：酶是高效的生物催化剂, 在工业和临床医药上有着广泛的应用。但由于酶是蛋白质, 稳定性差, 受外界条件的影响大, 因而严重制约了其应用。而通过化学手段在分子水平上对酶进行改造，可有效地改善酶的性质，为酶广泛的应用提供更广泛的前景。综述酶分子的化学修饰方法和酶化学修饰领域的主要应用，以及其最新进展。 关键词：酶；化学修饰；应用 Study on chemical modification of enzyme Abstract:Enzymes are efficient biocatalysts and is widely used in industry and clinical medicine.But because the enzymes that are proteins has poor stability and was affected by external conditions, which restricts its application. The method of chemical modification that modified enzyme at the molecular level can effectively improve the properties of the enzyme and provide a broader prospect for application of enzyme widely. The main application of enzyme in chemical modification and chemical modification of enzyme in the field, and the latest progress. Key words: Enzyme; chemical modification; application 酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、催化效率高和反应条件温和等显著特点[1]。在所有生物生命活动的物质代谢中, 各种生物化学反应都是在酶的催化作用下高效有序地进行。作为生物催化剂，酶虽然有许多优点，但是与化学催化剂相比较，又有很多缺点。比如对反应条件具有严格的要求, 一般要求温和的反应条件，如适宜的温度和pH值等，这就大大限制了酶在工业、农业生产中的应用[2]。如医用酶就有稳定性差、分子量过大、成本高、来源有限、有异体反应等缺点，这也使得酶的应用受到很大限制。这促使科研工作者须不断地开展新的研究，发现新的酶或者利用新方法来改变或提高酶的原有性质，以满足各种反应条件对酶的需求，克服天然酶的缺陷。酶的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，即利用化学手段将大分子或某些功能基团连接到酶分子上，改变酶的理化性质，最终达到改变酶的催化性质的目的[1, 3]。 尽管基因改造已经大体上替代了化学修饰酶的方法，但化学修饰依然是一种提高蛋白质稳定性的有效方法。虽然基因操作技术有了巨大的成功，酶的化学修
酶工程作业题 第四章酶的提取与分离纯化 一、名解 1、等电点沉淀 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀。 2、盐析沉淀 是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特点，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。 二、问答 1、在酶的提取与分离纯化过程中细胞破碎的方法有哪些？ 有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶促破碎法等。 2、生物热敏性材料的干燥方法有哪些？ 喷雾干燥、冷冻干燥 第五章酶分子修饰 一、名解 1、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。 2、分子内交联修饰：含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。 3、酶的有限水解修饰：在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。 4、酶的定点突变技术：定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的操作技术。 5、侧链基团修饰：采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。 二、问答 1、对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？
（1）被修饰酶的性质，包括酶的稳定性，酶活性中心的状况，侧链及基团的性质及反应性 （2）修饰反应的条件，包括酸碱度与离子强度，修饰反应时间和温度，反应体系中酶与修饰剂的比例等。 2、以单甲氧基聚乙二醇(MPEG)对天冬酰胺酶修饰为例阐述大分子结合修饰的方法与步骤 答：MPEG可以采用多种试剂进行活化，制成可以在不同条件下对酶分子上不同基团进行修饰的聚乙二醇衍生物。 聚乙二醇均三嗪衍生物的形成及其对天冬酰胺酶的修饰：单甲氧基聚乙二醇与均三嗪在不同的反应条件下反应，制得活化的聚乙二醇均三嗪衍生物MPEG1和MPEG2。通过这些衍生物分子上的活泼的氯原子，可以对天冬酰胺酶等酶分子上的氨基进行修饰。（详解见PPT） 3、什么是酶的定点突变技术，方法与步骤怎样？ 答:定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的操作技术。 (1)新的酶分子结构的设计,根据已知的酶RNA或酶蛋白的化学结构和空间 结构及其特性，设计出欲获得的新的酶RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定欲置换的核苷酸或氨基酸及其位置。 (2)突变基因碱基序列的确定(核酸类酶、蛋白类酶)对于核酸类酶，根据欲获得的 酶RNA的核苷酸排列次序，依照互补原则，确定其对应的突变基因上的碱基序列，确定需要置换的碱基及位置。 对于蛋白类酶，首先根据欲获得的酶蛋白的氨基酸排列次序，对照遗传密码，确定其对应的mRNA上的核苷酸序列，再依据碱基互补原则，确定此mRNA 所对应的突变基因上的碱基序列，并确定需要置换的碱基及其位置。 (3)突变基因的获得：根据欲获得的基因和碱基序列及其需要置换的位置，首先 合成有1~2个碱基被置换了的寡核苷酸，再用此寡核苷酸为引物，通过定点突变技术获得所需的大量突变基因。 利用定点突变技术进行酶分子修饰，突变基因中所需置换的碱基数目一般只有1~2个，就能达到修饰目的。 (4)新酶的获得将获得的突变基因进行体外重组,插入到适宜的基因载体中,然后通过转
生物化学-酶化学习题与答案 酶化学 一、填空题 1、全酶由________________与________________组成,在催化反应时,二者所起的作用不同,其中________________决定酶的专 一性与高效率,________________起传递电子、原子或化学基团 的作用。 2、酶就是由________________产生的,具有催化能力的________________。 3、酶的活性中心包括________________与________________两个功能部位,其中________________直接与底物结合,决定酶的 专一性,________________就是发生化学变化的部位,决定催化 反应的性质。 4、常用的化学修饰剂DFP可以修饰________________残基,TPCK 常用于修饰________________残基。 5、酶促动力学的双倒数作图(Lineweaver-Burk作图法),得到的直线在横轴上的截距为________________,纵轴上的截距为________________。 6、磺胺类药物可以抑制________________酶,从而抑制细菌生长 繁殖。 7、谷氨酰胺合成酶的活性可以被________________共价修饰调节;糖原合成酶、糖原磷酸化酶等则可以被________________共
价修饰调节。 二、就是非题 1、[]对于可逆反应而言,酶既可以改变正反应速度,也可以改变逆反应速度。 2、[]酶活性中心一般由在一级结构中相邻的若干氨基酸残基组成。 3、［]酶活力的测定实际上就就是酶的定量测定。 4、［]Km就是酶的特征常数,只与酶的性质有关,与酶浓度无关。 5、［]当[S]>>Km时,v趋向于Vmax,此时只有通过增加[E]来增加v。 6、[]酶的最适温度与酶的作用时间有关,作用时间长,则最适温度高,作用时间短,则最适温度低。 7、［]增加不可逆抑制剂的浓度,可以实现酶活性的完全抑制。 8、［]正协同效应使酶促反应速度增加。 9、［]竞争性可逆抑制剂一定与酶的底物结合在酶的同一部位。 10、［]酶反应的最适pH只取决于酶蛋白本身的结构。 三、选择题 1、［]利用恒态法推导米氏方程时,引入了除哪个外的三个假设？ A、在反应的初速度阶段,E+P→ES可以忽略 B、假设［S］>>［E］,则［S］-［ES］≈［S］ C、假设E+S→ES反应处于平衡状态
酶的化学修饰方法 通过对酶蛋白分子的主链进行“切割”、“剪切”以及在侧链上进行化学修饰来达到改造酶 分子的目的。这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶化学修饰。 PEG化修饰 聚乙二醇或甲基聚乙二醇有一系列不同分子量分布的产品(常用的分子量分布在5000 ~ 10000之间) , 无毒副作用, 无免疫原性, 具有良好的生物相容性。1977 年 Abuchowski等[1] 率先用 PEG修饰牛血蛋白BSA, 发现 PEG化的BSA保持了蛋白质的原有活性, 在体内的半衰期 大大延长, 且无免疫原性。其后人们利用PEG化技术先后对大量的蛋白和酶制剂进行了修饰。PEG必须经活化才能用于脂肪酶的化学修饰。活化的方法如图1所示. 图1 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)是一种pH中性, 无毒, 水溶性较高的亲水聚合物, 其重复单元为氧乙烯基, 端基为两个羟基, 呈线性或支化链状结构[2]. PEG聚合物是迄今为止 已知聚合物中蛋白和细胞吸收水平最低的聚合物[3]。 姚文兵等[4] 用三光气和羟基琥珀酰亚胺对mPEG5000进行活化, 再对人干扰素α-2b进行了 修饰研究, 反应方程式如Eq. 1所示. Goodson等[5]通过重组技术把Cys残基引入白介素(rIL-2)的非活性单糖基化位点, 采用 马来酰亚胺活化的PEG (PEG-maleimide)对其进行修饰, 反应方程式如Eq. 2所示. [1]Abuchowski A, Van Es T, Palczuk C N, e t al . Ef f e ct of covalent at tach ment of polyethylene glycol on immun ogenicity and circulating life of bovine liver catalase [ J ] . J . Biol .Chem. , 1977 , 252: 3578- 3581. [2]Bailon, P.; Berthold, W.Pharm. Sci.Technol. Today 1998, 1, 352. [3]Hooftman, G.; Herman, S.; Schacht, E. J. Bioact. Compat. Polym. 1996, 11, 135. [4]Yao, W. B.; Lin, B. R.; Shen, Z. L.; Wu, W. T. Chin. J. Biochem. Pharm. 2001, 22, 289 (in Chinese). (姚文兵, 林碧蓉, 沈子龙, 吴梧桐, 中国生化药物杂志, 2001, 22, 289.) [5]Goodson, R. J.; Katre, N. V. Bio/technology 1990, 8, 343.