学报
Journal of China Phar maceutical University 2008,39(5):442-446
果糖二磷酸锶对糖皮质激素诱导的
大鼠骨质疏松症的治疗作用
张 琪1,23,马 博1,白文霞2,成砚萍1,应汉杰1
(南京工业大学 1制药与生命科学学院,南京210009;2江苏省药物研究所,南京210009)
摘 要 目的:研究果糖二磷酸锶盐(Sr2F DP)对糖皮质激素诱导的大鼠继发性骨质疏松症的治疗作用。方法:应用肌肉注射地塞米松方法,建立大鼠继发性骨质疏松模型。口服不同剂量的Sr2F DP治疗8周,观察骨密度、骨生物力学、骨形态计量及骨代谢相关血清生化指标,综合评价Sr2F DP对糖皮质激素诱发的骨质疏松症的治疗效果。结果:肌肉注射地塞米松大鼠的骨密度、骨生物力学较正常组显著性下降,表明诱导大鼠骨质疏松模型成立。不同剂量Sr2F DP治疗均能显著增加模型大鼠的股骨与腰椎的骨密度、股骨干重与灰重,提高股骨和腰椎的骨强度,提高腰椎的骨小梁面积百分比及矿化沉积率,同时Sr2F DP对糖皮质激素引起的血清碱性磷酸酶及血抗酒石酸酸性磷酸酶5b活性的升高均有拮抗作用。结论: Sr2F DP能够促进骨形成,抑制骨吸收,对糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松症有明显的治疗作用。
关键词 果糖二磷酸锶(Sr2F DP);糖皮质激素;骨质疏松;地塞米松
中图分类号 R977111;R681 文献标识码 A 文章编号 1000-5048(2008)05-0442-05
Therapeuti c effect of stron ti u m fructose1,62d i phospha te(Sr2FD P)on glucocorti co i d2i n duced osteoporosis i n ra ts
ZHANG Q i1,23,MA Bo1,BA IW en2xia2,CHE NG Yan2p ing1,YI N G Han2jie1
1School of L ife Science&Phar m aceutical Engineering;
2J iangsu Provincial Institute of M aterial M edica,N anjing U niversity of Technology,N anjing210009,China
Ab s trac t A i m:To study the therapeutic effect of str ontiu m fruct ose1,62di phos phate(Sr2F DP)on osteopor osis induced by glucocorticoid in rats1M e tho d s:O steopor osis rat model was devel oped successfully by intra muscular injecti on of dexamethas one f or8weeks.Then treat m ent with oral dosing of Sr2F DP(110mg/kg,220mg/kg and 440mg/kg)was app lied in the next8weeks1measure ment of bones and m ineral content,bone m ineral density (BMD),bi o mechanical p r operties of fe mur and lu mbar vertebra,trabecular hist omor phol ogy,bi oche m ical assays of seru m were recorded after the ter m inati on of therapy1R e su lts:Compare with model gr oup,treat m ent using Sr2 F DP of m iddle and high doses markedly increased BMD,B i omechanical p r operties,trabecular areas,and m ineral appositi onal rates1Mean while,it significantly decreased the levels of serum A lkaline phos phatase(ALP)and tar2 trate2resistant acid phos phatase5b(TRACP5b)1Co nc l u s i o n:Sr2F DP,which enhances bone f or mati on and sl ow bone res or p ti on,could p revent osteopor osis in rats induced by glucocorticoid1
Key wo rd s str ontiu m fruct ose1,62di phos phate(Sr2F DP);glucocorticoid;osteopor osis;dexa methas one
This study was supported by the Sixth Talent Peak Pr oject of J iangsu Pr ovince(No.072C2018)
骨质疏松(osteopor osis)是以骨量减少和骨组织微结构退化为特征的,以致骨的脆性增高以及骨折危险增加的一种全身骨骼疾病[1]。尽管其发病因素较多,但已得到确认的是骨重构过程失衡的结果。骨质疏松不仅容易产生骨折及使骨折难于修复,同时也带来疼痛、骨骼变形等问题。
244
3收稿日期 2008204208 3通讯作者 Tel:138******** E2mail:zqapp le@https://www.doczj.com/doc/6814116773.html, 基金项目 江苏省“六大人才高峰”资助项目(No.072C2018)
第5期张 琪等:果糖二磷酸锶对糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松症的治疗作用
微量元素锶对骨有着特有的亲和力,据报道,锶兼有抑制骨吸收和促进骨形成的双重效应,能降低骨折发病率,克服了以往药物作用单一的弊端[2]。自从Servier公司开发研制的抗骨质疏松新药雷尼酸锶在国外上市后,锶盐的研究成为当今防治骨质疏松症热点话题[3-4]。果糖二磷酸锶盐(Sr2F DP)是由南京工业大学自主研发的新型化合物[5],它以果糖二磷酸作为含锶化合物的母体。糖皮质激素是临床常用药物,但是长期应用糖皮质激素会造成继发性骨质疏松症(glucocorticoid2in2 duced osteopor osis,GI O),其仅次于绝经后及老年性骨质疏松症而居第3位[6]。故本实验采用大鼠肌肉注射地塞米松的方法模拟继发性骨质疏松模型,给予Sr2F DP治疗后,通过测定大鼠的骨密度(BMD)、骨生物力学,观察其骨组织形态和骨代谢过程标志性酶类的改变,综合评价其防治效果,为新药Sr2F DP进一步研究提供理论依据。
1 材 料
111 药品与试剂
果糖二磷酸锶盐(南京工业大学生化中心提供,纯度大于99127%,临用前用生理盐水配制成100mg/mL的溶液);四环素、钙黄绿素(美国Sig2 ma公司);地塞米松磷酸钠注射液(南京金陵制药厂);雷尼酸锶(Pr otel os,上海康昊生物科技有限公司);TRACP5b酶免试剂盒(德国I D S公司)。
112 仪 器
DPX2L型双能X线骨密度仪(美国LUNAR公司);I N ST RON25543型电子万能材料试验机(美国英斯特朗公司);T U21901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);日立7170自动生化仪(日本日立公司);I m age2Pr o Plus 形态计量软件(美国Media Cybernetics公司);Elx 800型酶标仪(美国宝特仪器有限公司);1600型硬组织切片机(德国Leitz公司);E600型荧光显微镜(日本尼康公司)。
113 动 物
清洁级S D雄性大鼠,4月龄,体重(220±20) g,购自南京医科大学动物中心,实验动物生产许可证号为SCXK(苏)200720008。
2 方 法
211 地塞米松诱导骨质疏松模型的建立
80只S D大鼠按体重随机分为:正常对照组
(20只)和模型组(60只)。正常对照组和模型组分别臀肌注生理盐水和地塞米松(1mg/kg),每周2次,期间间隔3d,连续8周;8周后停用,并从该两组中各取10只大鼠,颈动脉放血处死大鼠,取股骨,腰椎作骨密度(BMD)和骨生物力学性质测定,确认地塞米松诱发大鼠骨质疏松模型建立成功后进行实验分组。
212 动物分组与给药
实验共6组:正常对照组、模型组、Sr2F DP低、中、高剂量组(110,220,440mg/kg)和雷尼酸锶组(180mg/kg),每组10只。正常对照组和模型组每天经口给予生理盐水;Sr2F DP低、中、高剂量组与雷尼酸锶组分别灌胃给予Sr2F DP和雷尼酸锶,以上各组每日给药1次,共8周。除正常对照组外,其余各组给予地塞米松每次剂量为1mg/kg,每周1次[7]。各组大鼠分笼饲养,自由摄取标准大鼠饲料(钙1101%,磷0178%),自由饮用蒸馏水,室温(18±2)℃。每周测1次体重,根据体重调节药物剂量。213 观察指标及测定方法
治疗结束前14d和4d腹腔注射四环素和钙黄绿素(30mg/kg)制作骨组织形态计量标本,分析矿化沉积率。治疗结束后颈动脉采血取血标本,放血处死后剖取骨和其他标本作下列各项指标测定。21311 BMD的测定 取股骨(左)与第1～5腰椎。骨密度用双能X线骨密度仪作大鼠股骨扫描,结果以g/c m2表示。
21312 骨干重、灰重与钙磷 取股骨(左)标本剔除肌肉,远端用7号注射针头钻孔后用生理盐水冲去骨髓,在环流热空气高热箱120℃1h烘干后,用固体物理密度仪测试体积(c m3),用三氯甲烷2甲醇混合液(2∶1)中脱脂72h,120℃,6h烘干后在万分之一天平上称取干重;接着置马福炉内600℃下灰化6h,称取灰重,结果均以g/c m3表示;将骨灰用三氯醋酸溶解稀释,用自动生化仪测试钙、磷,结果以每100克骨灰(Cag/100g,pg/100g)表示。
21313 骨生物力学 取新鲜股骨(右)与第3腰椎,标本剔除肌肉后分别在电子万能材料试验机的三点弯曲装置与(跨度18mm;速率1010mm/m in;温度23℃;湿度60%～70%)压缩装置上测试三点弯曲与压缩最大载荷,结果以牛顿力(N)表示。21314 骨组织形态计量学检测 取第4腰椎,脱钙后于1/2处横切断取材、石蜡包埋、HE染色、40倍光镜下观察和摄影,应用形态计量软件分析、计
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学报 Journal of China Phar m aceutical U niversity 第39卷
算椎体骨小梁与椎体总面积比值,结果以百分比表
示;测量骨小梁厚度与间距,结果以μm 表示。21315 矿化沉积率 取胫骨(右)近端1/2,不脱钙包埋、硬组织切片机切片、荧光显微镜下观察四环素与钙黄绿素荧光、I PP 形态计量软件计量矿化沉积率,结果以μm /d 表示。21316 ALP 、钙、磷、T RACP 5b 大鼠血标本分离血清后,测试ALP 、钙、磷,结果分别以每升国际单位和摩尔浓度表示;血TRACP 5b 用酶免法测试,结果以U /L 表示。214 统计学处理
实验数据应用SPSS 1310软件建立数据文件,
所有数据均以x ±s 形式表示,采用t 检验进行统计学分析。3 结 果
311 大鼠骨质疏松模型的判定
实验以BMD 和骨生物力学作为判断骨质疏松模型指标,结果显示经肌肉注射地塞米松8周后,与正常对照组相比,模型组的股骨,腰椎的BMD 明显降低(P <01001,P <0101),同时股骨,腰椎的骨生物力学亦明显降低(P <0101,P <0105),见表1。结果表明骨质疏松模型复制成功。
Table 1 BMD and bi omechanical p r operties of fe mur and lumbar vertebra in glucocorticoid 2induced rats (x ±s,n =10)Gr oup Fe mur BMD /
(g/c m 2)Lumbar vertebra
MBD /(g/c m 2)Three point bending
femur/N Comp ressi on lumbar
vertebra /N Contr ol 01235±010*******±010********±8184373116±13142Model
01212±01009
###
01197±01010
##
162146±10129
#
345134±18131##
#
P <0105,##P <0101,###P <01001vs contr ol gr oup
312 治疗结束后各组大鼠股骨、腰椎BMD 的变化经过8周治疗后,模型组的股骨、腰椎的BMD
明显低于正常对照组(P <01001);与地塞米松组相比,Sr 2F DP 低剂量组的股骨、腰椎的BMD 均显著提高(P <0105),Sr 2F DP 中、高剂量组股骨、腰椎的BMD 极显著提高(P <01001),与雷尼酸锶组相比,Sr 2F DP 中、高剂量的股骨和腰椎的BMD 无显著性差异(见表2)。结果表明,Sr 2F DP 可以明显抑制由地塞米松诱导的大鼠骨密度的降低。
Table 2 Effect of str ontium fruct ose 1,62di phos phate (Sr 2F DP )on BMD a of osteopor otic rats induced by glucocorticoid (x ±s,n =10)Gr oup Dose /
(mg/kg )Fe mur BMD /(g/c m 2)Lumbar Vertebra BMD /
(g/c m 2)Contr ol 01238±010*******±01008Model 01207±01005###
01193±01009###
Sr 2F DP
11001213±010********±01008322001221±0100833301210±010********
01224±01006
333
01211±01008
333
Pr otel os
180
01226±0100633301210±01008333
a
Bone m ineral density .
###
P <01001vs contr ol gr oup;3P <
0105,333
P <01001vs model gr oup
313 治疗结束后各组大鼠股骨,腰椎骨生物力学
的变化
与正常组相比,模型组经8周继续观察后股骨三点弯曲载荷和腰椎压缩载荷明显低于正常对照组(P <0105),其中腰椎压缩载荷极显著降低(P <
0101);与模型组相比,Sr 2F DP 各剂量组均能提高
股骨和腰椎的骨强度,其中Sr 2F DP 中,高剂量组差
异显著(P <0105);与雷尼酸锶组相比,Sr 2F DP 中,高剂量组股骨和腰椎的骨生物力学均无显著性差异(见表3)。结果表明,Sr 2F DP 可以明显抑制由地塞米松诱导的大鼠股骨和椎骨的骨生物力学降低。
Table 3 Effect of Sr 2F DP on B i omechanical p r operties of fe mur and lumbar vertebra in osteopor otic rats (x ±s,n =10)Gr oup Dose /
(mg/kg )Three point bending
Fe mur/N Comp ressi on Lumbar
vertebra /N Contr ol 177181±12175375151±14194Model 161132±15106#346152±24113##Sr 2F DP
110169165±12194#352153±18185220174157±111933371184±161723440
176156±91223373145±191613Pr otel os
180
177180±91823
374116±131823
3
#
P <0105,##P <0101vs contr ol gr oup;3
P <0105,3
3
P <0101vs
model gr oup
314 治疗结束后各组大鼠骨成分的变化
经过8周治疗后,模型组大鼠股骨干重、灰重、钙与磷均较正常组明显降低(P <0105,P <0105,P <0105,P <0101),Sr 2F DP 治疗各组与模型组比较,Sr 2F DP 中,高剂量组的骨钙增加具有显著性差异(P <0101)。股骨的干重与灰重较模型组有增加的趋势而无显著统计学意义(见表4)。
4
44
第5期张 琪等:果糖二磷酸锶对糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松症的治疗作用Table4 Physical p r operties of bones and m ineral content(x±s,n=10)
Gr oup
Dose/
(mg/kg)
D ry weight/
(g/c m3)
A sh weight/
(g/cm3)
Bone calcium
Cag/100g
Bone phos phate
Pg/100g
Contr ol1136±01060194±010738150±019224121±0186 Model1128±0107#0185±0108#36159±1197#19139±0146### Sr2F DP1101128±01070189±010737190±111819114±0164 2201130±01070190±010738110±1100320168±0122
4401132±01050190±010738142±0178319124±0172 Pr otel os1801132±01070190±010438136±0184320129±0191 #P<0105,##P<0101,###P<01001vs contr ol gr oup;3P<0105vs model gr oup
315 治疗结束后各组大鼠骨组织形态计量学检测参数比较
经过8周治疗后,与正常组相比,模型组大鼠骨小梁面积百分数与骨小梁厚度均明显降低(P< 01001,P<0105),骨小梁间距显著加宽(P< 0101);与模型组相比,Sr2F DP中,高剂量组骨小梁面积百分数明显增加(P<0105),骨小梁间距明显变窄(P<0105),Sr2F DP高剂量组骨小梁厚度显著增加(P<0105),且Sr2F DP中,高剂量组与雷尼酸锶组相比无显著性差异。治疗结束后,与正常组相比,模型组矿化沉积率(MAR)明显下降(P< 0105);与模型组相比,Sr2F DP中,高剂量组的MAR明显提高(P<0105),且与雷尼酸锶组相比无显著差异(见表5)。结果表明:Sr2F DP在一定的剂量范围内对地塞米松所引起的大鼠骨小梁面积与宽度降低及骨小梁间距变宽,有明显的抑制作用;且大鼠骨组织形态计量学动态参数提示长期服用地塞米松可使骨的形成率降低,Sr2F DP在一定程度上具有促进骨形成的作用。
Table5 Effects of Sr2F DP on trabcular area percentage(Tb1A r),trabcular thickness(Tb1Th),trabecular separati on(Tb1Sp)and m ineral apposi2 ti onal rate(MAR)of osteop2or otic rats(x±s,n=10)
Gr oup Dose/(mg/kg)Tb1A r/%Tb1Th/μm Tb1Sp/μm MAR/(μm/d) Contr ol40159±219848146±313669151±11142102±0112 Model32171±3104###44128±4110#90171±1219##1173±0114#
Sr2F DP11034166±412845193±414489103±13121178±0109 22036123±4126346130±416679111±101731191±01183
44036142±3198348151±4179379131±81631190±01213
Pr otel os18037134±4192348118±3194379141±91631194±01213
#P<0105,##P<01001,###P<01001vs contr ol gr oup;3P<0105vs model gr oup
316 治疗结束后各组大鼠血清生化指标的变化经过治疗后,与正常组相比,模型组的血钙明显降低(P<0105),血磷明显增加(P<0105);Sr2F DP 各剂量组及雷尼酸锶组,与模型组相比无统计学意义。与正常组相比,模型组中血清ALP及血清T RACP5b均显著升高(P<01001,P<0105);与模型组相比,Sr2F DP中,高剂量组可明显降低血清ALP(P<0105)和血清T RACP5b(P<0105),且与雷尼酸锶组相比无显著性(见表6)。结果表明: Sr2F DP促进骨形成,同时还具有抑制骨吸收的作用。
Table6 Effect of Sr2F DP on bi ochem ical parameters of osteopor otic rats(x±s,n=10)
Gr oup Dose/(mg/kg)Ca/(mmol/L)P/(mmol/L)ALP/(U/L)TRACP5b/(U/L)
Contr ol2133±01283119±0131143171±201311185±0105 Model1197±0115#3132±0127#226100±17132###1199±0115#
Sr2F DP1101189±01193128±0132222131±251471196±0112 2201197±01113131±0127196139±1911331187±01093
4402101±01253132±0129187121±2411031188±01073
Pr otel os1801196±01093125±0129180153±3311431187±01093
#P<0105,###P<01001vs contr ol gr oup;3P<0105vs model gr oup
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第39卷
4 讨 论
糖皮质激素是临床常用药物之一,长期使用可
引起骨质疏松。骨密度和骨生物力学是诊断骨质疏松、估计骨质疏松的程度、评价骨质疏松疗效的必要手段,故本实验以骨密度、骨生物力学作为评
价模型制备成功的标准[8]
。采用肌肉注射地塞米松(1mg/kg )复制骨质疏松模型,结果显示:长期使用地塞米松可引起骨质的明显丢失、骨密度和骨生物力学性能下降,提示地塞米松长期大剂量应用可造成大鼠负重骨的骨质明显丢失,引起类似人类的骨质疏松。模型建立后应用Sr 2F DP 进行治疗,经过8周可见Sr 2F DP 对地塞米松诱发的大鼠骨质疏松有明显的治疗效果。表现为:Sr 2F DP 治疗后可以增加GI O 大鼠骨密度,腰椎骨小梁分布明显优于模型组,腰椎骨小梁面积呈增加的趋势,不同程度恢复骨小梁三维结构,骨生物力学性能改善,其治疗效果与雷尼酸锶相当。
ALP 是一种磷酸单酯酶,50%血清ALP 来源于骨,骨骼中的ALP 是由成骨细胞分泌,故ALP 可以作为反映骨形成的特异性指标。活力的血清中TRACP 5b 均来源于破骨细胞,此酶在昼夜的活性水平变化不明显,且不受进食的影响,故TRACP 5b
作为反映骨吸收的指标[9]
。矿化沉积率是反应骨动态变化的参数,有助于了解骨表面矿化的量和速率,并解释静态参数变化的可能原因。本实验显示Sr 2F DP 对糖皮质激素引起的ALP 及TRACP 5b 活性的升高有拮抗作用,同时还可以提高矿化沉积率,提示其不仅可以促进骨形成,同时还具有抑制骨吸收的作用。
纵观目前骨质疏松治疗药物,均存在着药物作用单一的弊端,而双重作用都具备的药物在国内鲜
有报道[10]
。许多动物实验表明,锶有促进骨骼生长、增加类骨质形成和调节钙代谢的作用,能阻止卵巢切除、雌激素缺乏等原因所引起的骨丢失,还
能促进骨形成[11]
。Sr 2F DP 是F DP 作为母体,它与其他的锶盐相比:一方面可以提高锶盐的溶解度,其次母体本身不良反应小,且母体能够提供一定的
能量,最后由于F DP 中富含P0432
,能避免锶造成的
骨中P043-含量的下降[12]
。通过本实验证明Sr 2F DP 具有刺激形成、抑制骨吸收的双重作用,能降
低骨折风险,增加骨强度与骨密度,克服了以往药物作用单一的弊端,且耐受性好,不良反应小。相信,Sr 2F DP 作为一种双重作用机制的药物在骨质疏松症的治疗领域有着广阔的前景。
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