海南大学
实验教学自编教材微生物检测技术实验
农学院生物技术系编
实验一细菌学鉴定中常用的生化反应实验
一、目的要求
了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。
二、基本原理
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物。生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
IMVIC是吲哚（indol test）、甲基红（methyl red test）、伏－普（V oges-Prokauer test）和柠檬酸盐（citrate test）四个试验的缩写，i是在英文中为了发音方便而加上去的。这四个试验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），多用于水的细菌学检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中若超过一定数量，则表示受粪便污染。产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。
硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。
吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
色氨酸水解反应：
吲哚与对二甲基苯甲醛反应：
大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。
甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸、但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。
伏－普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性未端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏－普反应阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。有时为了使反应更为明显，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。
其化学反应过程如下：
产气肠杆菌为阳性反应，大肠杆菌为阴性反应。
柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH 升高，当加人1％溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0～7.0时为绿色，pH 大于7.6时呈蓝色。
硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物．
以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下：
大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。
三、器材
1、菌种：大肠杆菌，产气肠杆菌。
2、培养基：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。
蛋白胨水培养基:蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.6,121℃灭菌20min。
葡萄糖蛋白胨水培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，水1000mL，调pH 7.2，分装，121℃灭菌20min。
柠檬酸盐培养基：NH4H2PO4 1g，K2HPO4 1g，NaCl 5g，MgSO4 0.2g，柠檬酸钠2g，琼脂15-20g，水1000mL，1%溴香草酚蓝乙醇液10mL，将上述试剂加热溶化后，调pH 6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤，分装，121℃，20min灭菌后制成斜面。注意不要过碱，以黄绿色为准。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH 7.0-7.2,121℃灭菌20min。
醋酸铅培养基：pH 7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100mL，硫代硫酸钠0.25g，10%的醋酸铅水溶液1mL。将牛肉膏蛋白胨琼脂加热溶化，待冷至60℃时加入硫代硫酸钠0.25g，并调pH7.2，分装于三角瓶中，115℃灭菌15min，取出后冷至60℃，加入10%的醋酸铅水溶液1mL，混匀导入试管。
在配制柠檬酸盐斜面培养基时，其pH不要偏高，以浅绿色为宜。吲哚试验中用的蛋白胨水培养基中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨，如用胰蛋白水解素得到的蛋白胨较好。
3、溶液或试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％α－萘酚，乙醚，吲哚试剂等。
四、操作步骤
1、接种与培养
（1）用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验），置37℃培养48 h。
（2）将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基（吲哚试验），2支葡萄糖
蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏－普试验），2支柠檬酸盐斜面培养基和2支醋酸铅培养基中，置37℃培养2 d。
2、结果观察
（1）硫化氢试验：培养48 h后观察黑色硫化铅的产生。
（2）吲哚试验：于培养2d后的蛋白胨水培养基内加3～4滴乙醚，摇动数次，静置l～3min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加人2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。
配制蛋白胨水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋自酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。
（3）甲基红试验：培养2d后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳胜，变黄色者为阴性。
注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。
（4）伏－普试验：培养2 d后，将另1支葡萄糖蛋白陈水培养物内加人5～10滴40％KOH，然后加入等量的5％α－萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15～30min，以加快反应速度。若培养物呈红色者，为伏－普反应阳性。
（5）柠檬酸盐试验：培养48 h后观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。
五、实验报告
1、结果
将实验结果填人下表。“＋”表示阳性反应，“一”表示阳性反应。
2、思考题
（1）讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
（2）解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
（3）为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？
（4）说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用。可以用哪种化合物代替醋酸铅？
实验二水中细菌总数的测定
一、目的要求
1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
二、基本原理
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
三、器材
1、培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH 7.0-7.2,121℃灭菌20min。
2、仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、操作步骤
1、水样的采取
（1）自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
（2）池水、河水或湖水：应取距水面10～15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2、细菌总数测定
（1）自来水
①用灭菌吸管吸取lmL水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。
②分别倾注约15 mL已溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15 mL，作空白对照。
④培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24 h，进行菌落计数。
两个平板的平均菌落数即为lmL水样的细菌总数。
（2）池水、河水或湖水等
①稀释水样：取3个灭菌空试管，分别加人9 mL灭菌水。取lmL水样注入第一管9 mL灭菌水内、摇匀，再自第一管取lmL至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加人空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
③各倾注15mL已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24 h。
3、菌落计数方法
（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见
表2－1，例1）。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数（见表2－1，例2及例3）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表2－1，例4）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表2－1，例5）。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表2－1，例6）。
表2－1 计算菌落总数方法举例
五、实验报告
1、结果
（1）自来水
（2）池水、河水或湖水等
2、思考题
（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？
（2）你所测的水源水的污秽程度如何？
（3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度、培养时间等）来测定水样总数呢？为什么？
实验三多管发酵法测定水中大肠菌群
一、目的要求
1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。
2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、基本原理
多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
l、初（步）发酵试验
发酵管内装有乳糖蛋白陈液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色．溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。
水样接种于发酵管内，37℃下培养，24 h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下地可能延迟48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48 h后仍不产气的为阴性结果。
2、平板分离
平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo’s medium）或伊红美蓝琼脂（eosin methylene blue agar，EMB agar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、
带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24 h内产酸产气和48 h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。
3、复发酵试验
以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24 h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、器材
1、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。
乳糖蛋白胨培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1.6的溴甲酚紫乙醇液1mL，水1000mL，将蛋白胨，牛肉膏，乳糖及NaCl加热溶于1000mL 水中，调pH7.2至7.4，加入溴甲酚紫乙醇液1mL，混匀，分装，115℃灭菌20min。伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g，NaCl 5g，K2HPO4 2.0g，2%伊红水溶液20-30mL，0.65%美蓝水溶液10-15mL，琼脂20g，水补足1000mL，pH7.4,121℃灭菌20min。
2、仪器或其他用具：载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、操作步骤
1、水样的采取同实验二。
2、自来水检查
（1）初（步）发酵试验：在2个含有50 mL三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加人100mL水样。在10支含有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10mL水样（如图3－1）。混匀后，37℃培养24 h，24 h未产气的继续培养至48 h。
（2）平板分离：经24 h培养后，将产酸产气及48 h产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18～24 h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。
①深紫黑色、有金属光泽。
②紫黑色、不带或略带金属光泽。
③淡紫红色、中心颜色较深。
（3）复发酵试验：经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落l～3个，37℃培养24 h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表3－2，即得大肠菌群数。
图3－1 多管发酵法测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释
3、池水、河水或湖水等的检查
（1）将水样稀释成10-1与10-2。
（2）分别吸取lmL 10-2、10-1的稀释水样和lmL原水样，各注入装有10mL 普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10mL和100mL原水样，分别注入装有5mL 和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。
（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
（4）将100、10、1、0.1（10-1）mL水样的发酵结果查表3－2，将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）mL水样的发酵管结果查表3－3，即得每升水样中的大肠菌群数。
表3－1 大肠菌群检数表
接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）
表3－2 大肠菌群检数表
接种水样总量111.1mL（100mL、10mL、1mL、0.1mL各1份）
“＋”大肠菌群发酵阳性；“－”大肠菌群发酵阴性
表3－3 大肠菌群检数表
接种水样总量11.11mL（10mL、1mL、0.1mL、0.01mL各1份）
五、实验报告
1、结果
（1）自来水100mL水样的阳性管数是多少？10mL水样的阳性管数是多少查表3－1得每升水样中大肠菌群数是多少？
（2）池水、河水或湖水阳性结果记“＋；阴性结果记“一”。
查表3－2得每升水样中大肠菌群数是多少？
查表3－3得每升水样中大肠菌群数是多少？
2、思考题
（1）大肠菌群的定义是什么？
（2）假如水中有大量的致病菌——霍乱弧菌，用多管发酵技术检查大肠菌群，能否得到阴性结果？为什么？
（3）EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？
（4）经检查，水样是否合乎饮用标准？
实验四细菌抗酸性染色法
一、目的要求
掌握抗酸性染色的方法。
二、基本原理
抗酸染色法是鉴别分枝杆菌属细菌重要的染色法。分枝杆菌属的细菌脂类化合物含量高．其中含有长链的分枝菌酸。分枝菌酸易与石炭酸复红结合，又不易被酸性酒精脱色，因此分枝杆菌被染成红色。因为菌体着色困难，所以要用微火加热的方法，有助于菌体着色。但是一旦着色又不易洗脱。不含分枝菌酸的细菌着色后易被洗脱，再经复染而成蓝色。
三、器材
1、菌种：草分枝杆菌（Mycobacterium phlei），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）斜面菌种。
2、试剂：齐氏石炭酸复红液、3％盐酸酒精液、吕氏美兰染液。
3、其它：显微镜、含4mL生理盐水试管、载玻片等。
四、操作步骤
1、取分枝杆菌和金黄葡萄球菌斜面菌种和生理盐水试管，分别制菌悬液。
2、按常规涂片，风干。
3、初染：在两种菌的涂片上分别加上石炭酸复红染液，微火加热使冒蒸汽，但不蒸干，不沸腾，继续滴加染液，10分钟后倾去染液。
4、酸性酒精脱色，使流下的酒精无红色为止，水洗。
5、复染：用吕氏美蓝复染2分钟，水洗，风干。
6、镜检。草分枝杆菌菌体红色，金黄色葡萄球菌菌体蓝色。
五、实验报告
1、结果
根据染色结果绘制出示意图。
2、思考题
本实验所用的染色方法与细菌的芽孢染色法有何异同？能否用芽孢染色的方法进行抗酸性染色？
2014微生物实验复习题 一、名词解释： 菌苔：如果把大量分散的纯种细胞密集地接种在固体培养基的较大表面上，结果长出的大量“菌落”已相互连成一片，这就是“菌苔”。 菌落：将单个细菌（或其他微生物）细胞或一小堆同种细胞接种到固体培养基表面（有时为内层），当它占有一定的发展空间处于适宜的培养条件下，该细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆，此即菌落。 芽孢：是一些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，壁厚、透性低、不易着色。 荚膜：是一些细菌细胞外的一层胶状粘液物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽，与染料亲和力低。 细菌：细菌是单细胞原核微生物，基本形态为球状、杆状、螺旋状。 天然培养基：是指一类利用动、植物或微生物体包括用其提取物制成的培养基，这是一类营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的培养基。例如：牛肉膏蛋白胨、麦芽汁培养基。 合成培养基：组合培养基又称合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。例如：高氏一号培养基。 半组合培养基：又称半合成培养基，指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如：马铃薯蔗糖培养基。 液体培养基：一类呈液体状态的培养基，在实验室和生产实践中用途广泛，尤其适用于大规模地培养微生物。 固体培养基：一类外观呈固体状态的培养基。根据固态的性质又可分为：固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基和滤膜。 半固体培养基：是指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态培养基。例如：“稀琼脂”。
二、理论书内容： 1、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌各菌落的比较。 菌落特征微生物类别 单细胞微生物菌丝状微生物 细菌酵母菌放线菌霉菌 主要特征菌 落 含水状态很湿或较湿较湿干燥或较干燥干燥 外观形态 小而凸起或大而平 坦 大而凸起小而紧密 大而疏松或大而 致密 细 胞 相互关系 单个分散或有一定 排列方式 单个分散或假丝状丝状交织丝状交织形态特征 小而均匀，个别有 芽孢 大而分化细而分化粗而分化 参考特征 菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明 菌落与培养基结 合程度 不结合不结合牢固结合较牢固结合菌落颜色多样 单调，一般呈乳脂 或矿烛色，少数红 色或黑色 十分多样十分多样 菌落正反面 颜色的差异 相同相同一般不同一般不同菌落边缘一般看不到细胞 可见球状，卵圆状 或假丝状细胞 有时可见丝状细胞可见粗丝状细胞 细胞生长速度一般很快较快慢一般较快气味一般有臭味多带酒香味常有泥腥味往往有霉味
《微生物检验技术》期末考试试题(A 卷) 一、名词解释(每小题3分，共15分) 1、菌落 2、正常菌群 3、消毒 4、噬菌体 5、最小抑菌浓度（MIC ） 二、填空题（每空1分，共25分） 1．细菌的特殊结构 有 、 、 、 。 2.细菌生长繁殖的条件是 、 、 和气体。 3．病原菌的致病作用与 、 及 有密切关系。 4.诊断血清是用 免疫家兔等动物后取其 而制成的。一般置于 保存，使用时应避免 ， 降低效价。
5．K—B法中抑菌圈直径的大小与药物的最低抑菌浓度呈关系，即抑菌圈愈大，MIC值、细菌对药物的敏感程度。 6．、和可作为甲型溶血性链球菌与肺炎链球菌的鉴别试验。 7．淋病奈瑟菌主要以方式传播，引起。 8.细菌对待测药物的敏感程度可分为、、 三级。 三、选择题(每小题1.5分，共30分)： 1、属于非细胞型微生物的是（） A、真菌 B、细菌 C、放线菌 D、病毒 E、螺旋体 2、革兰染色所用染液的顺序是（） A、稀释复红—碘液—95％乙醇—结晶紫 B、稀释复红—95％乙醇—碘液—结晶紫 C、结晶紫—碘液—95％乙醇—稀释复红 D、结晶紫—95％乙醇—碘液—稀释复红 E、稀释复红—结晶紫—碘液—95％乙醇 3、靛基质试验又称（） A、甲基红试验 B、尿素分解试验 C、硫化氢生成试验 D、吲哚试验 E、糖发酵试验 4、对人体无害的细菌代谢物是（）
A、热原质 B维生素 C、外毒素 D、内毒素 E、侵袭性酶 5、正常人体不存在细菌的部位是（） A、体表 B、口腔 C、大肠 D、尿道口 E、血液 6、实验室对接种针（环）、试管口的灭菌方法是（） A干烤法 B、流通蒸汽法 C、烧灼 D、焚烧 E、煮沸法 7、卡介苗是由何种变异而产生的（） A、形态变异 B、结构变异 C、毒力变异 D、耐药变异 E、酶活性变异 8、病原菌侵入血流并在其中大量繁殖，产生毒性代谢产物，引起严 重的全身症状，称为（） A、毒血症 B、菌血症 C、败血症 D、脓毒血症 E、 病毒血症 9、哪种动物不是微生物学检验中常用的实验动物（） A、小白鼠 B、豚鼠 C、裸鼠 D、家兔 E、马 10、下列哪项不是金黄色葡萄球菌的特点（） A、凝固酶试验阳性 B、产生溶血素 C、分解 甘露醇 D、产生耐热核酸酶 E、胆汁溶菌试验阳性 11、在普通琼脂平板上生长的化脓性细菌是（） A、金黄色葡萄球菌 B、乙型链球菌 C、肺炎
微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。 （1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。 （2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。 （3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或
环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生 物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。 （4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。 （5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下： 微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
微生物实验室要求 微生物检验实验室操作技术要求 第一节实验室管理制度 一、实验室管理制度 1 ．实验室应制定仪器配备管理、使用制度，药品管理、使用制度，玻璃器皿管理，使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。 2 ．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验 室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 3 ．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、 检修 , 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。 4 ．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告； 药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。 5 ．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开 实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。 6 ．科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报告， 造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。 二、仪器配备、管理使用制度 1 ．食品微生物实验室应具备下列仪器：培养箱、高压锅、普通冰箱、低温冰箱、厌氧培养设备、显微镜、离心机、超净台、振荡器、普通天平、千分之一天平、烤箱、冷冻干燥设备、匀质器、恒温水浴箱、菌落计数器、生化培养箱，电位 pH 计、高速离心机。 2 ．实验室所使用的仪器、容器应符合标准要求，保证准确可靠，凡计量器具须经 计量部门检定合格方能使用。 3 ．实验室仪器安放合理，贵重仪器有专人保管，建立仪器档案，并备有操作方法，保养、维修、说明书及使用登记本，做到经常维护、保养和检查，精密仪器不得随意移动，若有损坏需要修理时，不得私自拆动、应写出报告、通知管理人员，经科室负责人同意填报修理申请、送仪器维修部门。
一．名词解释 1．微生物的纯培养物：由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。 2．菌落：单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见的、有一定形态的子细胞生长群体。 3. 灭菌：是指物体中包括芽孢在内的所有微生物都被杀死或消除。 4. 消毒：杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的措施，消毒可起到防止感 染或传播的作用。 5.无菌技术：在分离、转接及培养纯种微生物时，防止其被环境中微生物污染或 其自身污染环境的技术。 6. 鉴别培养基：在培养基中加入能与特定微生物的代谢产物发生特征性化学反 应的化学物质，用于鉴别不同类型微生物。 7. 选择培养基：根据不同微生物的营养需求或对某种化学物质敏感性不同，在 培养基中加入相应营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长， 将所需微生物从复杂的微生物群体中选择分离出来。 8. 基础培养基：含有一般微生物生长所需基本营养物质的培养基。 9. 合成培养基：由化学成分完全了解的物质配制而成的培养基，也称为化学限 定培养基。 10. 平板划线法：用接种环在培养平板表面划线接种微生物，使微生物细胞数量 随着划线次数的增加而减少，并逐步分开。保温培养后，在固体培养 基表面得到生长分离的微生物菌落。 11. 稀释倒平板法：将待分离的材料稀释后与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培 养基混合，摇匀后制成可能含菌的培养平板，保温培养后分离得到的 微生物菌落生长在固体培养基表面和里面。 12．平板菌落计数法：将适当稀释的样品涂布于琼脂培养基表面，培养后活细胞能形成菌落，通过计算菌落数能知道样品中的活菌数，该方法称为平 板计数或菌落计数。 二．填空题（每空1分，共20分） 1. 用培养平板进行微生物纯培养分离的方法包括：、、。
实验二实验器具的灭菌 一、实验目的 1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。 2.了解其他灭菌方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 三、器材 1、高压蒸汽灭菌锅 2、牛皮纸 3、棉绳 4、仪器和其他用具 四、操作步骤 1、包扎 将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。 2、加热烧开 待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。 3、升压 完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。 4、减压，取出器具 到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。 五、思考题 （1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制 —、目的要求 1、明确培养基的配制原理 2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨10.0g NaCI 5.0g 水1000mI pH 7.4～7.6 三、器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。 2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 （蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。） 2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。 4、分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
兽医微生物学实验复习题 1、兽医微生物实验室注意事项是什么？ 答：①防止病原微生物的散布；②防火；③节约；④标记；⑤记录；⑥安全；⑦清洁与秩序 2、观察细菌常用什么显微镜？它主要有哪几部分组成？ 答：光学显微镜光学部分:目镜、物镜、反光镜、聚光器；机械部分：镜座、镜臂、镜筒、粗调节器、细调节器。 3、油镜用毕后，为什么必须把油镜擦净？ 答：油镜的原理是通过香柏油的光路折射能更加清晰的观察微生物，油具有粘附性，且不溶于水，所以，在观察完后，香柏油会粘附在镜头上，不擦去的话，风干后镜头就变得模糊不清，甚至报废了，又因为是油所以简单的用擦镜纸擦拭是擦不干净的，二甲苯属于有机溶剂， 4、用过多的二甲苯或酒精乙醚混合液擦拭镜油有什么危害？ 答：过多的二甲苯或酒精乙醚混合液容易脱胶，使油镜脱落。 5、使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种？ 答：可用与玻璃的折光系数相近的油类，有7种，如柏木油。 6、观察细菌时显微镜的操作步骤是什么？主意事项是什么？ 答：将显微镜物镜镜头转为油镜对好光线（开高集光器，开大光圈，调好反光镜）使亮度最强在载物台上放上载玻片，并在玻片上放一滴香柏油将标本移至载物台正中转动粗准焦螺旋，使油镜浸入油滴中左眼由目镜注视镜内，慢慢地转动细准焦螺旋，直至物像清晰为止 注意事项：1.调节粗准焦螺旋的时候要慢 2.观察完后要用二甲苯擦拭油镜 7、微生物绘图要求有哪些？ 答：①绘出一个视野，圆形。 ②细菌大小比例合理，必须标明名称。 ③标名显微镜的放大倍数，标明菌名。 ④绘图一律用铅笔。 8、制备细菌染色标本片时应注意哪些事项？ 答：①干燥好的抹片固定时，使抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手为度进行固定。 9、涂片固定的意义何在？固定时应注意什么问题？有哪些固定方法？答：意义：涂片固定可将涂片上的细菌杀死，使之固定而不会到处漂移，并且死菌比活菌更容易着色，为后面染色做准备。 注意：若用火焰固定时，抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖动过数次，略作加热，但不能太热。固定方法：火焰固定和化学固定。 10、细菌染色的原理是什么？ 答：细菌的等电点较低，约在pH 2～5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。 11、试述细菌革兰氏染色法的步骤及结果。革兰氏染色的原理是什么？ 答：原理：G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈蓝紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
《微生物检验技术》课程标准 课程代码： 建议课时数：150 适用专业：医学检验技术 一、课程的性质 《微生物检验技术》课程作为校企合作、工学结合的一门课程，在医学检验课程体系中占有重要地位，是医学检验专业的一门重要的专业核心课程，同时也是国家医学检验职业资格考试的五大内容之一。《微生物检验技术》课程是医学检验的重要部分，培养学生掌握常规微生物检验技术的基本知识和基本技能，使他们具有微生物检验技术的实际操作能力，为后续课程和岗位职业能力打下良好的基础。 1．课程设置的依据 打破以知识传授为主要特征的传统学科课程模式，转变为以任务引领型课程为主体的课程模式，让学生通过完成医学临床标本微生物学检测等相关知识结构，并发展职业能力。本课程是以微生物检验顺序为线索进行设计的。以工作任务为中心整合理论与实践，实现理论与实践的一体化。教学过程中，通过院校合作，校内实训基地建设等多种途径，采取临床医院与学校教学交替等形式，充分开发学习资源，给学生提供丰富的实践机会。教学效果评价采取过程评价与结果评价相结合的方式，通过理论与实践相结合，重点评价学生的职业能力。 2．课程内容确定的依据 课程内容的确定紧紧围绕工作任务完成的需要来进行，同时又充分考虑了职业教育对理论知识学习的需要，并融合了获取相关职业资格证书对知识、技能和态度的要求。 主要依据：①以微生物检验技术的工作过程为主线安排教学内容，体现真实微生物检验的工作流程，注重教学内容衔接性。②以微生物检验技术典型的工作任务为载体设计教学内容。引入临床案例，内容来源于真实的工作项目，引入微生物检验操作规范、技术标准和职业资格标准。体现知识学习的应用性，能力培养的递进性和素质培养的职业性。③课程内容可适当拓展，删减一些已经过时的陈旧的知识内容，将微量化、快速化检测技术及半自动化、自动化仪器使用和新技术纳入《微生物检验技术》课程内容中。注重学生可持续发展能力的培养，为学生的终身学习着想。突出课程教学的先进性和实用性。④以职业素养、职业道德、职业能力培养为目标设计考核评价体系，融入医院、企业文化、提倡职业精神。 3．课时安排说明 本课程安排在第二学年第3、4学期，建议学时数为150学时，理论教学68学时，实践教学82学时。
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
《生物学实验Ⅰ——微生物》 （2008级基地班） 任课教师：熊芳 教学时数： 15学时 实验周数： 4周 生物学实验教学中心 微生物实验目录（15学时） 微生物实验基础知识介绍 实验一：培养基的配制与灭菌（4学时） 实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时） 实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时） 实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时） 第一次实验： 微生物学实验基础知识 一、实验目的 1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故； 2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识； 3.掌握实验报告的正确书写。 二、实验内容 1.实验室规则； 2.实验室安全守则； 3.实验室中意外事故处理； 4.常用器皿及用具； 5.显微镜及有关知识；
6.实验预习、实验记录和实验报告。 实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌 配置培养基的基本流程如下： 原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌 培养基的配制原则 一、营养成分 1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。 氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。 能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。 二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液 三、渗透压
微生物实验复习 1.微生物实验室的注意事项是什么? 答:防止病原微生物的散布，防火，节约，标记，记录，安全，清洁与秩序。 2.观察常用什么显微镜?它主要有哪几部分组成? 答:观察细菌常用普通光学显微镜(油镜)。它主要有光学部分和机械部分组成，光学部分由目镜、物镜、反光镜和聚光器组成:机械部分由镜座、镜筒、镜臂、转换器，镜台、粗细调节器。 3.使用油镜时用什么作为物镜与玻片间的介质，有几种? 答:加拿大树胶、二甲苯、石蜡、松柏油、甘油、水、香油 4.观察细菌时显微镜的操作步骤是什么?注意事项是什么? 答:操作步骤:放置好显微镜;调节好光源;低倍镜观察，高倍镜观察，油镜观察;清洁显微镜;还原显微镜。 注意事项: 5.制备细菌染色标本片时应注意哪些事项? 答:1)接种环要充分灭菌，避免带入新的细菌 2)加蒸馏水时，应用接种环取少量蒸馏水于载玻片上，否则自然干燥的时间会 过长。 3)钓菌时，试管口要在酒精灯附近，避免新的细菌进入菌种内 4)火焰固定时，热干燥的时间不宜过长，以不烫手为度 5)水洗时，先用蒸馏水冲洗平放的玻片，再冲斜放着的玻片 6)制片完成后，要待玻片完全干燥后才能油镜进行镜检 6.图片固定的意义何在?固定时应注意什么问题? 答:意义:a。除去抹片的水分，涂抹材料能很好的贴附在玻片，上，以免水洗时易被冲掉b.使抹片易于着色或更好的着色，因为变性的蛋白质比非变性的蛋白质着色力更强c.可杀死抹片中的微生物 固定时注意事项:1)火焰固定时只略作加热进行固定，但不能太热，以不烫手为度，同时加热时间和加热温度也应控制好，以保持细胞形态结构的完整性。2)化学固定时，若作姬姆萨染色就不用火焰固定，而用甲醇固定。 7.细菌染色的原理是什么? 答:细菌的等电点较低，约在pH2-5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷，易于带正电荷的碱性染料如龙胆紫及碱性复红等结合，使细菌被染成紫色或红色。 8.试述细菌革兰氏染色法的步骤及结果。 答:1)加草酸铵结晶紫染色液1-2min，水洗;2)加革兰氏稀碘液1-3min,水洗;3)加95%酒精脱色0.5min，水洗;4)10倍稀释石碳酸复红液复染10-30s，水洗5)结果：蓝紫色:革兰氏阳性菌；红色:革兰氏阴性菌 9.试述培养基制备的原则和要求。 答:原则: 要求:1)培养基必须含有细菌生长所需要的营养物质;2)培养基的材料和装培养基的容器应没有抑制细菌生长的物质;3)培养基的酸碱度应符合细菌生长的要求;4)所制培养基应该透明;5)培养基必须彻底灭菌，不得含有任何活的细菌。 10.试述普通肉汤培养基的制备方法及期途。 答:成分:牛肉膏3-5g;蛋白胨10g;氯化钠5g;水1000mL; 用途:1)用作细菌的液体培养;2)检查细菌的发育状况，以及形成的沉淀物、菌膜、
微生物检验技术课程综合化改革探讨 摘要：文章从培养实用型检验专业人才出发，分析三年制高职医学检验技术专业的课程设置和教学现状，从理论和实验两方面采取一系列措施进行教学改革，强调微生物检验技术课程综合化改革的必要性并对改革路径进行探讨。 关键词：微生物检验技术；教学现状；教学改革 微生物检验技术是医学检验技术专业学生必修的专业课程，也是一门应用性、实践性极强的学科。医学检验技术教学团队作为省高校教学团队，积极提高该课程的教学质量，立足课程基本要求，大胆改革，使学生具备扎实的理论知识和实践技能，能够直接上岗，增强就业竞争力。 1课程设置和教学现状分析 按照高职医学检验课程改革方案，医学检验技术专业五门专业课在第三学期”并行”开设，导致学生学习任务过重，课程内容之间也难以衔接，教学效果欠佳；理论课教学内容偏多，教与学的难度加大，而实验课仍然是传统的教学模式，即教师示范，然后学生模仿，且主要以验证性实验为主，难以发挥学生的主观能动性，导致学生对实验课也只是疲于应付，不利于学生创新能力的培养。 2理论教学改革
2.1优化教学内容《微生物检验技术》这本教材综合了微生物学、免疫学和流行病学等学科的内容，主要是研究感染性疾病的诊断方法，为临床医生合理用药提供依据。因此，这门课程的教学质量直接影响学生在临床工作中的工作能力[1]。为此，我们对教学内容进行了改革，将教学内容分为三大块：第一大块，首先介绍微生物的基本概念、在微生物检验过程中会使用到的一些基本技术和检验方法，使学生对微生物的相关理论知识有个大致的了解，为学生后续学习奠定基础；第二大块，主要介绍临床上常见的病原微生物的生物学特性、微生物学检验方法及临床意义，并将第一块中讲到的检验技术和检验方法运用到病原微生物的检验中来，让学生对整个学习内容有个纵向的了解；第三大块，模拟临床工作实际，介绍各种临床标本的微生物学检验，使学生学会收集标本和处理标本，并能够对检验结果进行分析，从而提高学生分析问题和解决问题的能力。与此同时，根据临床微生物的发展，对教学内容及时调整，微生物检验涉及到的微生物有三大类八大种，而对于三年制高职医学检验技术专业学生来说，如果每一种都精讲，势必造成学时严重不足，而且没有针对性，重难点不突出，学生学习起来很费力，这时教师可根据临床开展需要，对于临床分离率比较高的微生物，例如，化脓性球菌、肠杆菌科细菌、非发酵菌科细菌、流感病毒、乙型肝炎病毒、SARS 病毒等内容，要精讲；而
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
实验室技术操作规范 一、无菌操作要求 食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。 二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。 三、消毒灭菌要求 微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 1．灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。
微生物学实验复习提纲 1.研究微生物学的基本技术有哪些（显微镜技术、无菌技术、纯种分离技术和纯种培养技术） 2.细菌培养基的配制过程？ 答：配制培养液→调节PH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面 3.制造接种环、接种针的金属常用铂或镍,原因是软硬适度，能经受火焰反复灼烧，又易冷却. 4.灭菌吸管的包装的注意事项：（1）吸管必须干燥;(2)在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段约1.5cm 长的棉花（不能用脱脂棉）。作用是避免外界及口中杂菌吸入管内，并防止菌液等吸入口中。 5.空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌。则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。 6.接种环在用前必须烧灼灭菌，用后也应立即烧灼。 7.酵母的死细胞和活细胞可通过哪些方式鉴别？ 答：1.、用美蓝液对酵母菌染色后，活细胞为无色，死细胞为蓝色2、平板菌落计数法 8.细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物的菌落各有何特点？ 答：细菌：湿润、光滑、透明、粘稠、易挑起、质地均匀、菌落各部位的颜色一致等。 放线菌：质地致密、丝绒状或有皱折、干燥，不透明，上覆盖有不同颜色的干粉（孢子），菌落正反面的颜色常不一致，基内菌丝与培养基结合较紧，难以挑起。 酵母菌：菌落与细菌的相仿，比细菌菌落大而且厚，菌落表面湿润、粘稠、易被挑起，其颜色多为乳白色，少数为红色。同时会散发出悦人的酒香味。 霉菌：菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致等。 9.培养基按化学成分、物理状态、用途划分可分为哪几种类型？ 答：化学成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基物理状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基用途：基础培养基、鉴别培养基、选择培养基 10.实验常用的凝固剂是哪一种？固体培养基、半固体培养基及液体培养基加凝固剂琼脂的量为多少？琼脂在什么温度下溶化？什么温度下凝固？ 答：常用凝固剂是琼脂，分别为1—2%，0.5% 96°C下融化，40°C凝固 11.配制培养基时应遵循哪些原则？配制培养基的一般方法和步骤是什么？配制培养基时不可用铜锅或铁锅，原因是什么？调pH一般用什么试剂调？配制pH低的琼脂培养基时，应怎样配制？ 答：原则：目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约方法：生态模拟、参阅文献、精心设计、试验比较 用磷酸缓冲液和碳酸钙做调节剂 12.培养基分装时，液体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？固体分装高度以试管的多少为宜，三角瓶的多少为宜？半固体分装高度以试管的多少为宜？ 答：液体：试管高度的1\4,三角瓶的试管高度的1\2,固体：试管高度的1\5，三角瓶的1\2，半固体：试管高度的1\3 13.培养基灭菌时外用牛皮纸包扎的目的是什么？ 答：防止灭菌时冷凝水润湿棉塞 14.摆斜面的正确方法是什么？ 答：试管口搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 15.棉塞的作用是什么？正确的棉塞要求是什么？棉塞的长度多少在管口外，多少在管内为
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对