糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化逆转可能性
的研究
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：方开云娄晶磊肖瑛石明隽桂华珍郭兵张国忠【摘要】目的动态观察α平滑肌肌动蛋白（αSMA）和E钙黏素（E cadherin）在糖尿病（DM）大鼠肾组织中的表达，探讨糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏纤维化逆转的可能性。方法选择SD大鼠随机分为正常对照组、DM组和胰岛素治疗组，链脲佐菌素（STZ）诱发大鼠DM。正常对照组和DM组按病程分为2、4、8、12、16、20和24 w组，胰岛素治疗组从第13周起用胰岛素控制血糖至正常水平，分为16、20和24 w组。检测各组血糖、24 h尿蛋白、血肌酐（Scr）和肾脏指数（RI）；PAS染色光镜观察肾脏病理改变；免疫组化检测肾皮质αSMA和纤连蛋白（FN）的表达；Western印迹检测肾皮质αSMA和E cadherin蛋白表达量；RT PCR检测肾皮质αSMA 和FN mRNA水平。结果 DM组大鼠血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI均较正常对照组明显升高（P＜0.05,P＜0.01），胰岛素治疗组上述指标均较DM组显著降低（P＜0.05,P＜0.01）。正常大鼠αSMA只在血管壁表达，DM组2 w开始有少量间质细胞胞浆内有阳性染色，随病程
进展间质细胞阳性染色增多；8 w时肾小球系膜细胞胞浆内见阳性表达；从16 w开始在DM大鼠肾小管上皮细胞可见αSMA蛋白阳性表达，胰岛素治疗组未见表达；DM组肾皮质αSMA和FN蛋白与mRNA 表达水平较正常对照组显著增多（P＜0.01），胰岛素治疗组则显著低于DM组（P＜0.01）；DM组E cadherin蛋白的表达水平较正常对照组显著降低（P＜0.01），而胰岛素治疗组显著高于DM组（P＜0.01）。结论控制血糖可使DN大鼠肾脏一定程度的纤维化逆转，其机制可能与肾脏固有细胞表型转变被抑制或反转有关。
【关键词】α平滑肌肌动蛋白；E钙黏素；糖尿病肾病；大鼠【Abstract】 Objective To dynamic observe the expressions of αsmooth muscle actin (a SMA) and E cadherin to investigate the possibility of renal fibrosis reverse in diabetic nephropathy rats. Methods Streptozotocin induced diabetic rats were randomly divided into 2，4，8，12，16，20，24 w and 16，20，24 w treatment groups.The treatment groups were treated with insulin to control blood glucose to normal level beginning from the 13 th week. Normal control groups were selected in age matching points respectively. Blood glucose, 24 h urine protein, serum creatinine (Scr), renal index（RI）of rats were measured. PAS staining was used to observe the renal pathological changes. Immunohistochemical staining, Western blotting and RT PCR were employed to determine the
expressions of αSMA, E cadherin and fibronectin (FN). Results Compared with control group and insulin treated rats, blood glucose, 24 h urinary protein excretion, Scr, and RI were increased remarkably in diabetic rats (P＜0.05, P＜0.01). In diabetic rats, interstitial, mesangial cells and tubule stainings of αSMA were seen at the 2, 8 and 16 th week respectively. The αSMA and FN protein and mRNA were significantly up regulated in diabetic rats, while down regulated in the insulin treated diabetic rats (P＜0.01). The expression of E cadherin protein in the cortex was contrary to the expression of αSMA. Conclusions Renal fibrosis at early stage in diabetic nephropathy rats can be reversed when blood glucose was controlled and the mechanism may involve in blocking or reversing the phenotypic transition of renal resident cells.
【Key words】αSMA; E cadherin; Diabetic nephropathy; Rat 糖尿病肾病（DN）是导致终末期肾衰竭的主要病因，肾小管间质纤维化是DN重要的病理改变。过去认为肾脏纤维化是不可逆转的，近年研究表明，部分肾脏纤维化可以逆转〔1，2〕,但DN肾脏纤维化是否可以逆转及其机制尚需进一步证实。肾脏纤维化的基本病理改变是细胞外基质（ECM）的过度沉积，进而取代了肾脏固有细胞，破坏肾脏正常结构。α平滑肌肌动蛋白(αSMA)是成纤维细胞活化和
肌成纤维细胞(MFB)的标志性蛋白，因此我们通过动态观察αSMA、E钙黏素(E cadherin)和纤连蛋白(FN)在糖尿病（DM）发展过程及胰岛素治疗后大鼠肾皮质中的表达，初步探讨DN肾脏纤维化逆转的可能性及其机制。
1 材料与方法
1.1 动物 SD大鼠，清洁级，雄性,体重180～200 g，由上海西普尔比凯实验动物有限公司提供〔许可证号：Scxy（沪）20030002〕。
1.2 主要试剂链脲佐菌素（STZ，Sigma），兔抗大鼠E cadherin、FN多克隆抗体、小鼠抗大鼠αSMA和βactin单克隆抗体、羊抗兔或小鼠IgG HRP（Santa Cruz）、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、ECM试剂盒（武汉博士德）；EZ Spin Column RNA Purification Kit （BBI），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas），Taq酶（TaKaRa），αSMA、FN和βactin引物合成（上海生工）。
1.3 实验方法
1.3.1 动物模型及分组大鼠随机分成正常对照组、DM组和胰岛素治疗组。正常对照组和DM组又分为2、4、8、12、16、20和24 w组（n=6），DM组予以尾静脉注射STZ 55 mg/kg，72 h后测血糖，血糖≥16.7 mmol/L者入选。正常对照组注射同体积的STZ溶媒。胰岛素治疗组从第13周开始皮下注射精蛋白锌胰岛素，实行个体化剂量，以血糖控制在4～7 mmol/L,尿糖阴性为准分为16、20和24 w组(n=6)。所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水。于处死前 1 d用代谢笼收集
24 h尿测尿蛋白；股动脉取血测血糖、血肌酐(Scr)；处死大鼠，取双肾，分别于4%多聚甲醛固定及-80℃保存。
1.3.2 生化指标测定氧化酶法测血清葡萄糖,考马斯亮蓝法测尿蛋白,苦味酸法测Scr,均按试剂盒说明书操作（四川迈克科技有限责任公司）。
1.3.3 肾组织病理检查多聚甲醛固定之肾组织制成 3 μm厚的石蜡切片，行PAS染色，光镜观察肾组织形态结构变化。以肾重（mg）与体重（g）比值作为肾脏指数（RI）。
1.3.4 免疫组化石蜡切片脱蜡水化，经微波热修复抗原及5%BSA封闭后，分别加入αSMA（1∶200）和FN抗体（1∶100），4℃孵育过夜。加入生物素化二抗，室温下孵育30 min；滴加SABC试剂；DAB 显色。PBS代替一抗，作阴性对照。双盲观察染色切片，每张切片随机取10个不重复高倍(400倍)视野,计数细胞的阳性染色，取均值表示αSMA的表达。FN的表达程度则参考郭兵等〔3〕方法计数，以10个高倍视野的阳性点数取均值。
1.3.5 Western印迹取-80℃保存的肾皮质100 mg，加裂解液匀浆，离心取上清测定蛋白含量，每泳道加160 μg蛋白质，经SDS PAGE 垂直凝胶电泳后，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST 洗膜后分别加αSMA抗体（1∶400）和E cadherin（1∶200）4℃孵育过夜；加相应二抗室温孵育2 h，ECL试剂曝光显影。用抗体剥脱液剥脱抗体后，按同样的方法与βactin抗体（1∶300）孵育。凝胶成像系统(ChmioDox,Bio Rad)和Quantity One软件进行图像分
析。以βactin蛋白条带作内参照，结果用靶蛋白/βactin比值表示。
1.3.6 RT PCR 按EZ Spin Column RNA Purification Kit说明提取总RNA，核酸蛋白分析仪检测含量，RNA的吸光度（A）260 nm/280 nm比值均在1.9～
2.0，逆转录合成cDNA。PCR的引物序列、退火温度及扩增片段长度见表1。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描分析。结果用靶基因/βactin比值表示。表1 PCR引物序列及扩增条件
引物序列片段长度(bp)退火温度（℃）循环数αSMA上游5′CTCTGGTGTGTGACAATGGTCC3′2565840下游5′CGAAGCTCGTTATAGAAGGAGTG3′FN上游5′GCAAGCCTGAACCTGAAGAGACC3′4466240下游5′CCTGGTGTCCTGATCATTGCATC3′βactin上游5′GAAATCGTGCGTGACATTAAG3′49057.340下游5′CTAGAAGCATTTGCGGTGGA3′
1.4 统计学分析数据以x±s表示，采用SPSS11.5软件，组间比较采用方差齐性检验，作单因素方差分析。
2 结果
2.1 生化指标测定结果如表2所示DM组各时点的血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI较正常对照组明显升高（P＜0.05,P＜0.01），胰岛素治疗组上述各指标比相应时点DM组明显下降（P＜0.01），与对照组相比差异无显著性(P＞0.05)。
2.2 肾组织病理变化 PAS染色（图1）见正常大鼠肾小球及肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整,间质中未见炎症细胞浸润。DM组大鼠4 w后可见肾小球系膜区扩张，肾小管上皮细胞变性,部分肾小管腔内有细胞和管型,管腔扩张,上皮细胞萎缩,间质有较多细胞浸润,肾小管基底膜不规则增厚,肾小管间质PAS阳性染色物明显增多。胰岛素治疗组大鼠肾脏病变均有不同程度改善,肾小球系膜区和肾小管间质PAS染色阳性物质明显减少,肾小管上皮细胞病变明显改善。
2.3 免疫组化结果见表3。图2示正常大鼠αSMA只在血管壁表达。DM组2 w开始有少量间质细胞胞浆内有阳性染色，随病程进展间质细胞阳性染色增多；8 w时肾小球系膜细胞胞浆内见阳性表达；
16 w时部分糖尿病大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见阳性表达。胰岛素治疗组均未见间质细胞、肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞表达αSMA。图3示正常对照组大鼠肾小管基底膜及肾小球FN呈线性表达,肾间质无阳性表达，糖尿病组大鼠肾小球及肾小管间质FN表达从2 w开始逐渐增多，12 w后持续在较高水平，主要表达在肾小管周围肾间质和肾小球系膜区，胰岛素治疗组大鼠肾组织内FN表达明显减少。
2.4 Western印迹结果见表4和图4。正常对照组大鼠肾皮质有αSMA表达，DM组大鼠2 w其表达开始增加，并随病程的延长而逐渐增多（P＜0.05），12 w时达高峰，以后一直处于较高水平。胰岛素治疗组的表达则明显下降（P＜0.05）,24 w时几乎恢复到正常对照
组水平。DM组大鼠E cadherin 蛋白表达显著低于正常对照组（P ＜0.05），胰岛素治疗组的表达则明显较DM组增加（P＜0.05）。
2.5 αSMA和FN mRNA表达水平见表5和图5。正常对照组可检测到两者mRNA，各时点DM组两者的mRNA水平较正常对照组显著增加（P＜0.05），且随病程延长呈递增趋势，16 w后维持在较高水平。胰岛素治疗组的mRNA比同时点DM组明显下降（P＜0.05），与正常对照组比较差异无显著性。表2 各组大鼠血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI 与正常对照组比较：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与同时点DM组比较：3） P＜0.01；下表同表3 各组大鼠肾皮质αSMA和FN免疫组化阳性表达程度表4 各组大鼠肾皮质αSMA和E cadherin蛋白表达相对水平（靶蛋白/βactin灰度比值）与正常对照组比较：1） P＜0.05；与同时点DM组比较：2） P＜0.05，下表同表5 各组大鼠肾皮质αSMA和FN mRNA表达相对水平
3 讨论
在正常组织中，ECM的产生和降解处于一个平衡状态，这种平衡主要由ECM的降解酶类，如基质金属蛋白酶(MMPs)、组织型纤溶酶原激活物等调节。传统理论认为，基质降解酶可以减轻肾脏纤维化，延缓肾功能恶化。然而近年研究结果却相反，如MMP2在体外可诱发肾小管上皮细胞转化(EMT)〔4〕，过度表达MMP2的转基因鼠，发生小管肥大、小球硬化和小管间质纤维化〔5〕。以往也认为纤维蛋白溶解酶可以通过降解基质蛋白而保护肾脏，可是在纤溶酶原基因敲出小鼠中，将小鼠进行输尿管结扎后并未发现纤维化加重；同时，还在小
鼠体内发现胶原沉积减少〔6〕。因此相关实验提示，基质降解酶是否有利于肾脏纤维化的逆转仍然存在争议。
肾脏固有细胞包括成纤维细胞、系膜细胞、上皮细胞等，这些细胞在各种损伤因素的刺激下，发生MFB转变，最终成为分泌基质蛋白的效应细胞〔7，8〕，效应细胞不仅能合成分泌ECM，还能分泌蛋白酶抑制子、细胞因子、炎症介质，以旁分泌的方式募集邻近细胞，放大致纤维化的效应。因此，已经发生表型改变的细胞能否回到其正常表型是肾脏纤维化逆转的关键。
本实验从2 w开始DM组大鼠αSMA表达即显著增加，免疫组化染色显示，DM大鼠2 w时肾间质细胞胞浆内有阳性染色，8 w可见部分肾小球系膜细胞胞浆阳性染色，16 w时部分DM大鼠肾小管上皮细胞胞浆内可见阳性表达，并随病程延长细胞阳性染色增多，提示在DM 大鼠肾组织中有成纤维细胞活化和系膜细胞、肾小管上皮细胞向MFB 细胞表型转变。同时我们还观察到随着DM的发展，肾小球系膜区和肾小管间质区FN增多，与MFB增加相一致，提示DM大鼠肾脏ECM成分FN沉积增多可能来源于MFB。
在胰岛素治疗组，FN和αSMA蛋白和mRNA表达显著减少，通过免疫组化我们观察到αSMA只表达于血管，说明MFB减少，提示胰岛素控制血糖后可能通过抑制或逆转肾脏固有细胞的表型转化，从而减少了FN等ECM的生成，减轻肾脏病理改变。
Yang〔9〕、Zesiberg〔10〕等的研究提示肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白(BMP)7可以诱导发生EMT的细胞再转变为上皮细胞
（MET），提出至少在早期移出或阻断致病因子，EMT是可以逆转的。本实验中DM大鼠肾小管上皮细胞胞浆内出现αSMA的阳性表达在16 w，而胰岛素治疗组从13 w开始治疗，提示胰岛素控制血糖可能在早期阻断或逆转了高糖刺激下肾小管上皮细胞的EMT。
E cadherin是上皮细胞产生的也是上皮细胞的标志性蛋白，起着维持细胞连接和极性的重要作用。本组DM大鼠的E cadherin较正常对照组显著减少，而胰岛素治疗组则较同时点DM显著增加，提示了增多的E cadherin有可能来源于肾小管上皮细胞增多，而增多的上皮细胞有可能是MFB通过MET或EMT被阻止而使肾小管上皮细胞维持原有表型的机制转变而来。
虽然DN肾脏纤维化的机制尚未阐明，其纤维化的逆转亦取决于许多因素，胰岛素治疗也并不能完全防止DM病人进展为终末期肾衰竭，但本结果提示DN经胰岛素治疗后，一定程度的肾脏纤维化可被逆转，而这种逆转可能与肾脏固有细胞表型转化有关。
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大鼠肾纤维化模型 肾积水(hydronephrosis)是指尿液从肾盂排出受阻，蓄积后肾内压力增高，肾盂肾盏扩张，肾实质萎缩，导致肾功能减退。梗阻性肾病其主要的病理生理改变是肾积水、肾盂及肾小管压力升高、肾间质水肿、炎性细胞浸润、肾间质内成纤维细胞增生、肾间质胶原蛋白聚集、肾间质增宽、肾小管萎缩，最终导致肾间质纤维化和肾单位减少，引起肾功能衰竭。 单侧输尿管梗阻是比较成熟的肾间质纤维化模型，结扎2周就可有成纤维细胞的增生和间质细胞外基质的生成。但是由于输尿管的结扎使患侧肾盂中的尿液不能外排，加上对侧肾脏的代偿作用，所以一般情况模型组血肌酐、尿素氮、NAG以及24h尿蛋白仅明显高于正常组，但还处于正常范围之内，同时对侧肾一般也无明显改变，而患侧肾脏组织中大量炎症细胞浸润、肾小管和间质的结构严重破坏以及肾间质纤维化，最后肾间质呈现广泛的纤维化，而肾小球几乎没有病变。因此单侧输尿管梗阻模型在研究肾间质纤维化方面使研究的靶点明确，有利于其病变机理及抗间质纤维化治疗的研究。 1.实验动物 SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为180g~200g 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 7d，14d，21d，28d 4.建模方法 1术前一晚禁食,自由饮水。 2称量大鼠，腹腔注射水合氯醛（15%）350mg/kg麻醉，剃毛固定后用碘酒及酒精擦拭手术区域。3在上腹中线偏左约3-4mm剪开腹壁，手术组分离出左肾输尿管。 4在靠近肾下极处结扎并分离输尿管，然后双结扎，在2个结扎中间剪断输尿管，逐层缝合肌层及腹壁，酒精清洁缝合处。待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。 5置于加热垫至其苏醒。假手术组不结扎输尿管，其余步骤相同。 6术后三天连续注射青霉素20万单位/天防止感染。 5.模型的评价 5.1 蛋白尿含量、尿NAG活性测定模型组术后2周、4周的24h尿蛋白含量以及尿酶NAG活性比正常组和假手术组明显上升。
APJ拮抗剂Apelinl3 ( F13A)对肝纤维化大鼠肝脏 Beclin 1. LC3和p62表达的影响 刘明;曾斌;肖婷筑王珊;姚梦娜 【期刊名称】《医学信息》 【年(卷)，期】2015(000)025 【摘要】目的观察血管紧张素受体ATI相关的受体蛋白(APJ)拮抗剂Apelinl3(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62表达的影响。方法30只雄性SD大鼠随机分为对照组、肝纤维化模型组和Apelinl3(F13A)(100pg/kg)处理组。采用四氯化碳(CCI4)诱导大鼠肝纤维化模型。Apelinl3(F13A)通过腹腔注射给药。取肝左叶同一部位,苏木精-伊红(HE) 染色观察肝脏的病理形态学变化。Western blot检测肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62的表达。结果对照组大鼠肝脏的肝小叶结构完整，肝索排列整齐,结构完整,肝细胞排列整齐，没有发现明显的胶原纤维增生，纤维化程度分级为0级；肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏严重,肝细胞排列紊乱,汇管区发现明显的坏死细胞和炎性细胞，可见大量胶原纤维增生,形成纤维纵隔，纤维化程度分级为多为3-4级；与模型组比较,Apelinl3(F13A)组大鼠肝脏组织肝细胞变性和坏死明显减少，纤维化程度明显减轻,纤维化程度分级多为1-2级。与对照组t出交，肝纤维化大鼠Beclin 1和LC3的表达显著增加，而p62的表达显著降低(均＜0.05)。与肝纤维化模型组大鼠比较，Apelinl3(F13A)降低了Beclin 1和LC3的表达,而增加了p62的表达(均＜ 0.05)。结论APJ拮抗剂Apelinl3(F13A)抑制了CCI4诱导的大鼠肝纤维化，其机制可能与Apelinl3(F13A)抑制细胞自噬有关。
新纤维化 为了更好的配合临床、服务患者，检验科对肾脏纤维化的检测进行了重新调整，新的项目如下。 -MG、尿NAG、尿GGT/尿Cr, 早上弃去晨尿，喝500ml水，60min 1.肾小管三项，包括尿β 2 后留尿，尽快送检。收费45元，当日出结果。 一、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cysstatin C，Cys C)又称胱抑素C，是一种低分子非糖基碱性蛋白。作为检测肾功能的一种新的内源性标志物，近年受到临床上的重视。它与目前临床上常用的反映肾小球滤过功能的指标，如菊粉清除率，同位素标记物清除率，内生肌酐清除率(Ccr)，血尿素氮(BUN)和血清肌酐(CR)等相比，具有独特的优点，稳定、可靠、方便。2004年美国FDA批准将它作为检测肾功能的指标之一。 Cys C作为一种测定肾小球滤过功能的理想的内源性标志物，有其独特的优点： (1) 人体内所有有核细胞均可持续合成，并分泌至细胞外液，如血液、脑脊液、精液中。这是因为编码Cys C的基因属“管家基因”，此基因能在几乎所有的有核细胞中持续、恒定的转录与表达，无组织特异性，故产生稳定。 (2)Cys C分子量小、带正电荷，能够自由通过肾小球滤过膜，在近曲小管几乎被完全重吸收，重吸收后被完全分解代谢，不再重新回到血液循环。 (3)特别是肾脏是清除循环中Cys C的唯一器官，并且肾小管也不分泌Cys C，因而血清Cys C浓度主要由肾小球的滤过功能决定，并且不受性别、年龄、炎症反应、肿瘤、肌肉活动、肌肉量、饮食摄人等因素的影响。因此是反映GFR比较理想的指标之一 (4)Cys C灵敏度高，与肾小球滤过功能相关性良好。许多临床观察证实，当肾功能轻度受损，CR变化不明显时，血清Cys C已增高。Laterza等详细总结24项对比观察结果，l5项研究证明检测肾小球滤过损伤，Cys C优于CR和Ccr。 Cystatin C的临床应用： 1.CysC是肾小球滤过率变化的敏感指标：CysC是应用前景较好的内源性测定GFR物质，大量研究证明Cys C与GFR的线性关系优于所有其他内源性的小分子蛋白质。特别是对早期或肾功能轻度损害的肾脏疾病，Cys C诊断肾小球滤过功能的的变化，其特异性和敏感度均显著优于肌酐。 2.肾移植时Cys C的改变：对于肾移植病人，移植后的肾脏可能会因为急性排斥反应而损伤，甚至导致移植失败。因此敏感而准确监测到GFR的变化，及早的诊断与治疗是非常重要的。Cys C作为一种理想的肾小球滤过率检验的内源性标志物，在肾移植后肾功能监测中的作用倍受关注。 3.急性肾功能损伤的诊断：目前，急性肾功能损伤(AKI)的实验室检查指标是沿用了近百年的肌酐，其诊断的灵敏度不理想。最近的研究表明，Cys C较肌酐可以早1.5天检测到AKI 肾功能的改变，成为急性肾功能损伤的一项重要早期指标。 4.肾脏纤维化的诊断：半胱氨酸蛋白酶是细胞外基质（ECM）的降解酶之一， Cys C通过抑制半胱氨酸蛋白酶的活性来抑制ECM的降解，从而参于了肾脏纤维化，成为诊断肾脏纤维化、判断纤维化程度的一个重要指标。 5.在监测儿童肾功能中的优势 血清肌酐的的浓度受肌肉容量的影响，很难准确反映儿童肾功的善。血清Cys C的浓度不受性别和肌肉容量的影响，也不受大多数药物和炎症、运动的影响，儿童在一岁后就达到成人水平，在监测儿童肾功能中有其独特优势。
生理学报 Acta Physiologica Sinica , December 25, 2007, 59 (6): 796-804 https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, 796 研究论文 Received 2007-05-16 Accepted 2007-06-08 This work was supported by the National Natural Science Fundation of China (No. 30470627). * Corresponding author. Tel: +86-21-54237716; Fax: +86-21-64171179; E-mail: lulimin@https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, 肾素(原)受体在大鼠肾小球系膜细胞和肾脏的表达 贺 明1，黄娅林2，张 琳3，姚 泰1，陆利民1,* 复旦大学上海医学院1生理学与病理生理学系；2医学神经生物学国家重点实验室，上海 200032; 3上海交通大学医学院生理学系，上海 200025 摘 要：近年发现的肾素(原)受体(renin/prorenin receptor, RnR)已被证明具有生物学功能，在心、肾及多种细胞表达。本文旨在观察RnR 在体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cells, MCs)和肾脏中是否表达，及其表达的细胞部位，并用RnR 的多肽阻断剂肾素原“柄区肽” (handle region peptide, HRP)与RnR 结合后观察受体复合物进入细胞的过程与定位。结果显示，RnR 主要存在于大鼠肾脏皮质肾小球系膜区和体外培养的MCs 的细胞核周围胞浆和细胞膜。将FITC 标记的HRP (FITC-HRP)加入细胞培养液后30 s 到30 min 期间，可观察到FITC-HRP 由培养液转移到胞浆内并进入细胞核。用免疫荧光和激光共聚焦技术观察到，HRP 与RnR 的共定位主要位于细胞膜和细胞核周围胞浆；在30 min 时，一部分HRP 已进入细胞核，而RnR 没有进入细胞核内，仍主要位于细胞核周围胞浆。上述结果提示，RnR 与其配基结合后进入细胞内并发挥生物学效应。 关键词：肾素(原)受体；肾素原“柄区肽”；系膜细胞；肾素-血管紧张素系统中图分类号：R 334+.1 Expression of renin/prorenin receptor in rat kidney and cultured mesangial cells HE Ming 1, HUANG Ya-Lin 2, ZHANG Lin 3, YAO Tai 1, LU Li-Min 1,* 1 Department of Physiology and Pathophysiology; 2 National Key Laboratory of Medical Neurobiology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3 Department of Physiology, Medical College of Shanghai Jiaotong University, Shang-hai 200025, China Abstract: The renin/prorenin receptor (RnR) has recently been cloned and demonstrated to exist in different cells in the cardiovascular and renal systems, playing an important role in physiological and pathophysiological situations. In the present study, we used immunofluorescence method to identify whether and where the RnR expressed in cultured rat renal mesangial cells (MCs) and rat kidney.By using the prorenin handle region peptide (HRP) as a decoy peptide of the RnR, we observed the distribution of the HRP-RnR complex in the MCs. Our results showed that the RnR was localized in the perinuclear zone and plasma membrane of the MCs. At the organ level, the RnR was observed in the mesangium of cortical glomeruli in rat kidney. The FITC-labeled HRP (FITC-HRP) translocated from cell culture medium into the cytoplasm within 30 s. Colocalization of the HRP and RnR was observed mainly on the cell membrane and in the perinuclear zone of cytoplasm by using immunofluorescence and confocal microscopy. At 30 min the FITC-HRP was mainly observed in the nucleus while the RnR remained in the perinuclear zone of cytoplasm. Taken together, our results confirm the expression of RnR in the renal MCs. It is suggested that internalization of the RnR after binding with its ligand is at least one of the pathways through which the RnR exerts its biological actions. Key words: renin/prorenin receptor; handle region peptide of prorenin prosegment; mesangial cells; renin-angiotensin system
收稿日期:2011-05-18 基金项目:国家自然科学基金(30760230) 作者简介:邵佳亮(1980-),男,硕士,住院医师,主要从事肝纤维化的研究。 通信作者:胡国信,副教授,E -mail:hug uo x in8228@sina.co m 。 四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型改良的研究 邵佳亮,万赞燕,胡国信 (南昌大学第一附属医院感染科,南昌330006) 摘要:目的 构建肝纤维化大鼠模型,并对经典四氯化碳(CCl 4)复制模型方法进行适当改进。方法 取Sprague -Daw ley(SD)大鼠40只,雌雄各半,按随机数字表法分为A 组10只、B 组14只和C 组16只。B 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液2mL kg -1,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养(改良方法);A 组为正常对照组,给予等量花生油腹腔注射,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养;C 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液5mL kg -1,2次 周-1,同时给予添加10%猪油及2%胆固醇的饲料喂养(经典方法)。实验第8周末处死各组剩余大鼠:采用酶联免疫吸附法检测血清肝功能(A L T 、AST 、A L B 、T P 、A/G)水平;H E 及M asson 染色观察大鼠肝组织病理学变化。结果 实验第8周B 、C 组均可见明显肝功能损害表现。B 组可见部分标本肝脏假小叶形成,达到早期肝硬化,肝细胞少量脂肪变性,死亡率28.6%。C 组均已形成明显肝硬化,弥漫性肝细胞脂肪变性,死亡率43.7%。结论 低剂量CCl 4诱导并给予普通饲料喂养可成功建立大鼠肝纤维化模型,并明显降低大鼠死亡率,提高了模型质量及实验效率。 关键词:四氯化碳;肝纤维化模型;改良;动物,实验;大鼠 中图分类号:R-332 文献标志码:A 文章编号:1000-2294(2011)07-0040-03 Improved Rat Model of Liver Fibrosis induced by CCl 4 SHAO Jia -liang,WAN Zan -yan,HU Guo -xin (Dep ar tment of I nf ectious Diseases ,the First A f f iliated H osp ital of N anchang Univ ersity , N anchang 330006,China) ABSTRACT:Objective To establish a rat m odel of liver fibrosis,and to improv e the classical CCl 4induction method.Methods Forty SD r ats (20female and 20male)w ere r ando mly divided into three gro ups.Gro up B (n =14)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of 40%CCl 4solution (a mix ture of CCl 4and peanut oil)tw ice a w eek and the feeding of no rmal complete diet.Gro up A (n =10)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of peanut oil tw ice a w eek and the feeding of nor mal com plete diet.Gro up C (n =16)w as given intr aper ito neal injec -tion of 5mL kg -1of 40%CCl 4solution tw ice a w eek and the feeding of diet containing 10%lar d and 2%cholesterol.Rats w ere killed at the end of 8w eeks,and the levels o f ser um ALT ,AST ,Alb,T P and A/G w ere determined by ELISA.The patho logical changes in liver tissue w ere ob -served by H E and M asso n staining.Results Liv er function w as damag ed apparently by CCl 4in -jectio n.Some specimens in g roup B pro duced false flo cculus and achieved the ear ly stage of liver fibro sis,w ith fatty deg ener ation in a few liver cells.A ll specimens in gr oup C had cirrhosis w ith diffuse hepatic steato sis.The m ortality w as 28.6%and 43.7%in gro up B and g roup C,respec -tively.Conclusion Liv er fibrosis can be induced by injection o f low do ses of CCl 4and feeding of norm al co mplete diet in rats.In addition,the improved m ethod can reduce the mortality and im -40南昌大学学报(医学版)2011年第51卷第7期 Jou rnal of Nanch ang University(M edical Science)2011,Vol.51No.7
Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.doczj.com/doc/6313603479.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.
大鼠肾脏冰冻切片的体会 发表时间：2016-03-01T14:17:27.000Z 来源：《中国综合临床》2015年9月供稿作者：张丽娥[导读] 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 张丽娥 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００ 【中图分类号】R５８７．２【文献标识码】B 【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８５７－０１ ０．引言由于肾脏组织质地柔软,含水量高,或在取材过程中肾组织与水分接触, 突遇低温,易形成冰晶,快速冷冻切片的制作难度大,我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片,总结经验如下. １材料使用德国产Leica—CM１９５０型冰冻切片机,Leica一次性刀片,冷冻组织包埋剂(O．C．T．),AF固定液,改良Gill苏木素染色液,２％碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精,中性树胶. ２方法２．１取材及包埋２．１．１取新鲜大鼠肾脏标本常规取材,标本要新鲜,无需固定,严禁浸入甲醛, 酒精,生理盐水等液,尤其是不可以用酒精固定,酒精固定后组织将无法冷冻.２．１．２将样本托放入冰冻切片机的冻台上预冷,加少许O．C．T．,在OCT 未完全冻结前快速的将组织放于样本托上,在组织周围适量的补充O．C．T,待包埋剂约１/３未冻结时压上冷冻锤,打开加强冷冻,使组织快速冷冻.２．１． ３冰冻切片机温度设定在－１６oC—－１８oC为宜.冷冻时间一般为１min~２min.冷冻时间过长,组织易变硬变脆,细胞结构会发生改变,难于切片.２．１．４包埋组织时应将组织周边多留出O．C．T．用于牵引展开切片,O．C．T．中的小气泡应尽量去除,以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果. ２．２切片组织切片厚度设定为５um－６um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗,以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎,在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片. ２．３固定切片后立即放入AF固定液固定３０s—１min,不可待切片干后再固定,这样会造成细胞核染色质不清晰,呈现毛玻璃样改变,细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象. ２．４染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色３０s—５０s,经１％盐酸分化,２％碳酸氢钠水溶液返蓝,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 制好的切片核浆对比分明,红蓝适度,颜色鲜艳,达到理想染色效果. ３讨论与分析:３．１冰晶是由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构,在组织冷冻过程中,组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生,最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O．C．T．凝固６０％~７０％时,再将冻锤轻压在组织上, 这样既能防止冰晶的产生,又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中２s－３s,待组织冻至８０％时即可取出制片,否则过冻会引起组织发脆,冻头与组织分离[２]. ３．２将包埋剂放入－１０OC或－４OC冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代,因OCT 的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出,减少冰晶形成. ３．３冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比,取材时组织块尽可能薄,０．２cm 为宜,扁平状冷冻速度快,切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多,切片不能求快,而要确保切片质量,力争一次完成一张高质量的切片[１]. ３．４可预先做好OCT冻头,将冻头上的OCT 修平,有利于将组织放平,再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温,避免组织复温,减少冰晶形成. ３．５肾脏冰冻制片时易产生不规则裂痕,与切片时温度和切片速度有关,操作时应注意操作窗不要开太大,免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱褶,滴加OCT时要上下俩端多,俩侧少,同时要注意OCT不要有小气泡. ３．６冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作,仪器要定期维护,除霜,清洁消毒. 总之,冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一,也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验[３]在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 参考文献[１] 陈乐真,徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴１版北京:科学技术文献出版社,２００５:２(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[２] 范慧,陈立华,刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析．诊断病理学杂志,２００８,１３８(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[３] 吴艳霞．冰冻切片的制作方法分析．吉林医学,２００９,３０(６):４９３．
四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化 机理研究 【摘要】目的观察四氯化碳腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型时相关细胞因子 的变化，初步探讨四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。方法以四氯化碳腹腔注射的方法[四氯化碳 mL (用花生油1∶6稀释)/次，每周3次，共14周]制作大鼠肝纤维化模型，设立正常、溶剂对照组，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原含量;ELISA法检测转化生因子ββ1)、肿瘤坏死因子α);化学法检测血清氧化亚 氮(NO)。肝行HE和Masson胶原染色，光镜下观察病改变，并按SSS计分系统进行评分。免疫组化染色观察肝组织血小板源生长因子的变化，专业像分析进行图像分析。结果与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清ALT、AST、HA、LN、、NO、β1 、α明显升高
()，大鼠肝组织肝纤维化评分明显升高()，肝组织表达明显增多()。结论促进相关细胞因子的表达可能是四氯化碳腹 腔注射致大鼠肝纤维化的机理之一。 【关键词】四氯化碳;肝纤维化;细胞因子 Abstract:Objective To investigate the variation of correlated cytokine when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride,and to the relevant molecular mechanism. Methods Rat models of hepatic fibrosis were made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride at mL(diluted 1∶6 with peanut oil),three times a week,a total of 14 weeks. The normal and dissolvent groups were prepared as controls. Serum β1 and α were detected by ELISA method. Serum levels of NO were detected by
肾纤维化动物模型特点与研究进展 肾纤维化动物模型特点与研究进展本文关键词：纤维化，研究进展，模型，动物 肾纤维化动物模型特点与研究进展本文简介：摘要：肾纤维化为慢性肾病发展至终末期肾衰所必经的相同病理路径，病理改变分为肾间质纤维化和肾小球硬化。肾纤维化的理想动物模型对慢性肾病发病机制的研究及其治疗药物的研发等存在现实意义。目前，肾纤维化动物模型制作包括药物或毒物诱导、手术模型以及基因敲除等多种模型，不同动物模型肾功能、肾组织病理等方面各具特 肾纤维化动物模型特点与研究进展本文内容： 摘要：肾纤维化为慢性肾病发展至终末期肾衰所必经的相同病理路径，病理改变分为肾间质纤维化和肾小球硬化。肾纤维化的理想动物模型对慢性肾病发病机制的研究及其治疗药物的研发等存在现实意义。目前，肾纤维化动物模型制作包括药物或毒物诱导、手术模型以及基因敲除等多种模型，不同动物模型肾功能、肾组织病理等方面各具特点，尚无法完全模拟人类慢性肾疾病，这提示慢性肾疾病发病的复杂性，对于其病理机制认识与防治具有重要意义。 关键词：肾纤维化；肾间质纤维化；肾小球硬化；动物模型； 肾纤维化是肾单位损坏，间质中成纤维细胞的大量增生及肌成纤
维细胞的形成、细胞外基质生成过度并沉积发生的肾小球硬化（glomerulosclerosis, GS）、肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）, 并最终丧失肾功能。确诊肾纤维化的金指标为肾组织的病理学检查，包括观察肾小管、间质和肾小球基底膜的病理形态。肾纤维化的大体病理观察主要是：肾脏明显硬化、减小，表面不平整、颗粒样变；镜下观：肾间质炎性细胞弥漫性浸润、间质纤维组织增殖、纤维化形成；肾小球大部分发生硬化、透明样改变，毛细血管破坏，系膜基质增生；由于肾小球血流受阻，而造成肾小管发生萎缩，病变轻处，残余肾代偿性增大；生化检测主要表现在血清尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）、血清肌酐（serum creatinine, SCr）、24 h尿蛋白定量异常[1]. 诱导肾纤维化的方法主要有药物或毒物（氯化汞、环孢素A、肾毒性药物、氨基糖苷类药物等）、手术（输尿管单侧结扎、5/6肾切除模型、肾缺血-再灌注等）、单侧肾切除复合AngⅡ等复合因素以及转基因模型等等，本文对常见模型综述如下。 1 药物或毒物诱导模型 重金属如汞；抗肿瘤药物如阿霉素；氨基糖苷类抗生素如链脲霉素；含有马兜铃酸的中草药；血管紧张素Ⅱ；器官移植术后的免疫抑
中国组织工程研究与临床康复第15卷第18期 2011–04–30出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research April 30, 2011 Vol.15, No.18 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 3347 Department of Urology, Affiliated Hospital, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China Mai Hai-xing★, Master, Department of Urology, Affiliated Hospital, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China maimark24@ https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, Correspondence to: Chen Li-jun, Doctor, Professor, Master’s supervisor, Department of Urology, Affiliated Hospital, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China chenlijun829@ https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, Received: 2010-10-26 Accepted: 2010-12-02 解放军军事医学科学院附属医院泌尿外科，北京市100071 麦海星★，男，1981年生，广东省阳江市人，汉族，2008年解放军第四军医大学毕业，硕士，主要从事肾脏移植的研究。 maimark24@ https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, 通讯作者：陈立军，博士，教授，硕士生导师，解放军军事医学科学院附属医院泌尿外科，北京市100071 chenlijun829@ https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, 中图分类号:R617 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)18-03347-04 收稿日期：2010-10-26 修回日期：2010-12-02 (20101026009/W ? W) 大鼠原位肾脏移植模型的建立★ 麦海星，曲楠，赵立，黄晨，王亚林，李学超，李建涛，陈立军 Rat models of orthotopic kidney transplantation Mai Hai-xing, Qu Nan, Zhao Li, Huan Chen, Wang Ya-lin, Li Xue-chao, Li Jian-tao, Chen Li-jun Abstract BACKGROUND:There are many ways to prepare kidney transplantation models in rats; however, there are still many problems about operation time, transplantation effect and so on. OBJECTIVE: To study the microsurgical technique of establishing a reliable rat model of orthotopic kidney transplantation. METHODS: Kidney transplantation was performed from SD to Wistar strain (allogeneic),the donor’s artery and renal vein were put on the self-make rubber septum and underwent the end to end anastomosis surgeon with the receptor’s arteriae renalis and renal vein. After that, the donor’s bladder valva was inosculated with the receptor’s bladder. All the rats were divided into two groups: control group and Cyclosporin A (CsA) group, each group included 30 rats. The control group received 1 mL D-hanks each day after transplantation; the CsA group received subcutaneous injection of CsA for 15 mg/kg. The serum creatinine levels were observed at days 3, 5 and 10 after transplantation, pathological changes were also observed at 10 days after transplantation. RESULTS AND CONCLUSION: Rat orthotopic kidney transplantation was performed in 60 rats, and the successful rate was 85%. The serum creatinine level in the CsA group was lower than that in the control group (P < 0.05), but the survival time in the CsA group was longer than that in the control group (P < 0.05). Allografts of the control group exhibited typical severe acute rejection. It is indicated that this rat model of kidney transplantation is a reliable model with good reproducibility and high achievement ratio. Mai HX, Qu N, Zhao L, Huan C, Wang YL, Li XC, Li JT, Chen LJ.Rat models of orthotopic kidney transplantation. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(18): 3347-3350. [https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, https://www.doczj.com/doc/6313603479.html,] 摘要 背景：目前已有多种大鼠肾移植模型建模方式,但在移植时间、移植效果等方面都存在各种问题。 目的：探讨建立稳定、可靠的大鼠原位肾脏移植模型的方法。 方法：以SD大鼠为供体Wistar大鼠为受体行原位肾移植术。供体肾动脉、肾静脉在自制橡胶垫片上分别与受体的肾动脉、肾静脉端端吻合，供体输尿管膀胱瓣与受体膀胱吻合。将实验动物随机分为2组，对照组移植后每日腹腔内输注1 mL D-hanks 液；环孢素A组移植后每日皮下注射环孢素A 15 mg/kg。记录大鼠生存时间并于移植后第3，5，10天测定血肌酐值，移植后第10天，光镜下观察移植肾病理改变。 结果与结论：大鼠原位肾脏移植成功率为85%。移植后第5，10天环孢素A组血清肌酐值显著低于对照组(P < 0.05)。环孢素A组大鼠肾移植后存活天数明显长于对照组(P < 0.05)，移植肾病理可见排斥明显减轻。提示该模型稳定性强、重复性好，具有较高的成功率。 关键词：模型，动物；肾；移植；显微外科；大鼠 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.18.028 麦海星，曲楠，赵立，黄晨，王亚林，李学超，李建涛，陈立军.大鼠原位肾脏移植模型的建立[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(18):3347-3350. [http://www.crte https://www.doczj.com/doc/6313603479.html, https://www.doczj.com/doc/6313603479.html,] 0 引言 大鼠是目前器官移植实验中最常用的实验动物[1-5]。由于大鼠的肾血管短，手术视野小，端端吻合难度较大，因而以往实验大多采用端侧吻合，但这须阻断大鼠体循环，导致其下半身在吻合期间处于缺血状态。当开放血管夹后，将发生严重的缺血-再灌注损伤[6-9]。有的方法采用带有与供肾动脉和肾静脉相连的主动脉和下腔静脉片，分别与受者肾动脉、肾静脉端端吻合，膀胱与膀胱吻合，但术中往往发现主动脉与肾动脉管径相差甚远，吻合后容易漏血。另一种方法利用供、受体动、静脉袖口式套叠，此方法提高了受体的存活率并缩短了手术时间，但因所用的套管管径有限，在翻转血管壁形成袖口时，使血管腔变狭小，影响移植肾脏血流的恢复，腹腔静脉与肾静脉作端端吻合时，因静脉壁薄弱常引起静脉壁撕裂而导致手术失败。 不阻断大鼠体循环的肾血管端端吻合原位肾移植技术的建立，避免了上述的缺点，采用端端吻合法减少了供肾的缺血-再灌注损伤，术后动物的存活率较采用端侧吻合者有明显提高[10-12]。 实验采用供体肾动脉、肾静脉分别与受体的肾动脉、肾静脉端端吻合，供体输尿管膀胱瓣与受体膀胱吻合的方法。施行大鼠肾移植。