原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究, 但要获得高活率、功能好的肝细胞, 至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞, 包括机械法（如匀浆法）及螯合法。机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合Ca2+ 、Mg2 +的螯合剂（如枸橼酸盐或EDTA）分离肝细胞, 但螯合剂单独使用效果不好, 常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞, 包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重, 因而易造成肝细胞死亡, 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小, 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用, 有利于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。因此, 要获取理想的肝细胞, 酶消化这一重要环节不可缺少。
Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法 , 但所需设备较复杂 , 胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进。作者认为 , 采用胶原酶消化法 , 胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高 , 作用时间难以控制 ; 浓度过低 , 则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌注，去除Ca2+依赖性粘附因子，使桥粒断裂；然后用含Ca2+的胶原酶消化，胶原酶的作用需要Ca2+的活化，在5 mmol∕LCa2+浓度下，用浓度为500 mg∕ L的胶原酶37 C条件下消化15 min最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时，温度需保持在0?
4 C。肝细胞分离时，PH值宜维持在7.4 左右，不低于7.2 , 最高不超
过 7 . 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白，可以维持细胞代谢和液体渗透压，提高肝
细胞成活率。此外，门静脉插管应迅速置入，灌注速度必须保持一致。
培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板，铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较，发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用 Sigm a 公司提供的胶原铺胶，置于37 C恒温箱中过夜后使用。过去选择含8%胎牛血清的W E作培养基，效果不错，但WE价格昂贵，我们试着采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640 培养基，并在其中加入胰岛素，地塞米松等生长因子，肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小，细胞不易生长；密度太大，肝细胞增殖受到抑制，培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为5 ×105 ∕ m l左右时，试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、W型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为自行配制。 Williams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。 BT01-100 蠕动泵（保定格兰蠕动泵有限公司）、 Sorvall 低温离心机（美国 Kendro 公司）, CL-800 全自动生化分化仪（日本岛津）, XD-101 倒置显微镜（南京光学显微镜公司）。HeraeuS CO2孵箱（美国Kendro公司）,KT-902 洁净室（无锡康达净化空调设备厂）。
实验步骤：
一、原代大鼠肝细胞的分离
1. 实验动物 Spragure- Dawley （ SD ）大鼠购自泸州医学院实验动物
中心。雄性，清洁级，体重150?200g, 8?12周龄。分笼饲养，喂饲标准的大鼠饲料，随意饮水，保持室温 20 C?25 C O
2. 主要仪器设备 : 倒置相差显微镜（）；自动平衡微型离心机： LDZ4-0.8 北京医用离心机厂；套管针（）；超净工作台（）；电子分析天平（）；外科手术器械（）
3. 主要试剂及药品：W型胶原酶（）;RPMI164培养基（）；胎牛血
清（）;台盼蓝（）;PerCoIl分离液（）；PBS g冲液（）；青霉素（80 万U）及链霉素（100万U）（）胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松
4. 具体实验步骤： SD 大鼠，氯胺酮 80 mg/kg 腹腔内麻醉．同时腹腔内注射 1 000 U 肝素钠注射液抗凝．固定大鼠仰卧位于超净工作台上（用前紫外灯照射超净台半小时），剪去胸腹部体毛，碘伏胸腹部皮肤消毒后，带无菌手套，铺洞巾，取腹部正中切口，可见鲜红的肝脏，暴露出门静脉和肝下下腔静脉，用弯头钳子钝性分离门静脉和下腔静脉，并在各静脉下放置 1 根 4 零细线，暂不结扎，用套管针
以约15°角在门静脉远端向近端平行刺入（注意针头刺入在距离门静脉 3 个分支处 0.5 cm ，刺入过深势必影响灌注效果）．细线结扎后以封闭门静脉远端，再退出金属针心，并将套管针连接一次输液器一端，另一端接上输液瓶（预热灌流液的输液瓶用保温套保持温度以避免温度下降过快以影响酶的消化活性）．输液瓶高度距离灌流大鼠肝脏120 Cm .打开输液器输钮将预热至 37 C无钙灌流液200mL 经一次性输液管道及连接其末端的套管针流入门静脉，控制流速约 20 mL/min ；另一
套管针头立即插入肝下下腔静脉，细线结扎固定以防针头由下腔静脉内脱出并退出金属针心，让血液和灌流液从下腔静脉流出，用无菌平皿接流出液，保持流出端无菌，同时打开胸腔结扎肝上下腔静脉，数分钟后肝脏逐渐肿胀变淡黄色. 直到下腔静脉流出液颜色接近无钙灌流液.约 5?10 min,改输预热至37 C的0.05% W型胶原酶灌流液100 mL继续灌流，更换流出端的平皿，以回收胶原酶以循环使用，控制约10 mL/min.灌流持续约5?10min, 0.05% W型胶原酶灌流过程中，取一根无菌湿棉签轻轻压迫肝脏表面，以判断肝脏消化的程度,待压迫肝脏后不再回缩.表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙时判断肝脏已被消化充分, 可以终止灌流。离断肝脏血管、韧带及系膜,将肝脏完整取下（注意不要碰破胃肠组织, 避免造成污染）,置于无菌平皿。用眼科镊钝性撕裂肝组织, 4 C RPMI 1640 完全培养基终止 IV 型胶原酶的消化作用,装入无菌 100 mL 三角烧瓶置摇床上，100 r/min ,摇10 min,所得的肝细胞悬液经三层无菌纱布过滤,以除去一些大的细胞团块及被膜组织,再装入 50 mL
离心管，500 r/min ,离心3 min ,弃上清，以4C RPMI1640完全培养基重悬，反复离心 3 次，以除去血细胞、肝非实质细胞以及一些细胞碎片和少量的结缔组织。离心之后得到的肝细胞沉淀以含 4 C RPMI1640完全培养基对细胞沉淀进行重悬，用吸管轻轻反复吹打肝细胞悬液使肝细胞重悬均匀后即制备成肝细胞悬液。
二、原代大鼠肝细胞的纯化取无菌的 50 mL 离心管置管架上，用
弯头吸管沿管壁小心地将肝细胞悬液和 75%Percoll 分离液按 1:1 铺
层，底层为 75%Percoll 分离液．肝细胞悬液铺加于上层，尽量减少震荡， 4 C，800 r/min ， 10 min 离心后，离心管液体分四层，顶层为死细胞，第二层为混合肝细胞，第三层为肝实质细胞，底层为分离液．取第三层肝实质细胞用于重悬制成肝细胞悬液外，另吸取第二层混合肝细胞，加 PBS 液稀释，再次小心依次按 1:1:1 分铺底层 50% Percoll 、中层 25% Percoll 、顶层混合肝细胞悬液，尽量减少震荡，4 C，800 r/min ， 10min 离心，底层沉淀为肝实质细胞，吸除上层液，用完全培养基重悬底层沉淀的肝细胞制成肝细胞悬液．取肝细胞悬液与台盼蓝溶液混匀后 1 min 内滴入血细胞计数板上计数。
三、肝细胞原代培养详细步骤
RPMI164完全培养基（100 mL? L - 1胎牛血清RPMI164培养基培养基、青霉素105 U ? L — 1、链霉素100 mg? L — 1和胰岛素160 U ? L -
1 ）调整肝细胞悬液细胞密度，按每孔 1 × 106 个细胞接种于铺有肝细胞悬液的6孔培养板中，在37 C、50 mL? L — 1 Co常规培养条件下培养。4 h后换液，用RPMI164完全培养基继续培养，以后
每24 h 换液1 次，在倒置显微镜下动态观察细胞的形态 6 孔培养板中，在37 C、50 mL?L — 1 Co常规培养条件下培养。4 h后换液，用RPMI1640完全培养基继续培养，以后每24 h换液1次，在倒置显微镜下动态观察细胞的形态变化。
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。
原代细胞的培养与建系(一) 细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术，才可能更快捷地学习和掌握其他方法，本章重点叙述常用的基本技术。 第一节原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下： 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。 （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 二、各类组织的取材技术
原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1．取材要注意新鲜和保鲜 .2．应严格无菌 .3．防止机械损伤 .4．去除无用组织和避免干燥 .5．应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6．作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4平方厘
米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾（或肺）取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，
原代肝细胞培养 原代肝细胞培养 1．实验材料 灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。 消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。 Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。麻醉剂：10%水合氯醛。 实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。 2. 实验前准备 1) 灌流液 Perfusion Solution NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose 离子）。用前37℃温育。 每只老鼠消耗15ml灌流液。 2）消化液 100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。 消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。 每只老鼠消耗15ml消化液。 3）40%Percoll g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9 调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3- 16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。（等渗溶液） 每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
一.细胞培养的基本原理 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。在组织培养中，细胞自组织块周围移出并生长，细胞在生长过程中总有移动(运动)或其它变动，这样就使被培养的组织难以长期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养中，细胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无严格区别。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，该方法能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。如心肌组织中心肌细胞约占50%，非心肌细胞占50%;而经纯化分离的心肌细胞悬液中，心肌细胞可达95%以上，这样，心肌细胞原代培养实验基本不受其它细胞的干扰。在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程;用定时显微摄影记录可发现一些肉眼观察不到的生命现象;还可利用电镜手段、同位素标记、放免法和免疫组化法等来研究细胞形态结构及细胞内化学物质的分布。此外，还能节约研究费用。如在某些研究中，用100只动物做实验所获得结论与用100张盖玻片或几十个培养瓶而获得结论具有相同的统计学意义，而细胞培养较之大批量的动物饲养花费要小。 但细胞培养方法也存在不足之处：培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 二.细胞培养的基本设备与用品 (1)细胞培养的基本设备 细胞培养的基本设备有：CO2培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸汽消毒器，自动双重纯水蒸馏器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温培养箱，电动吸引器，抽气泵等。 (2)常用的实验用品 1.玻璃器皿 细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶[有12.5毫升，25毫升，100毫升等规格，国外培养瓶常以底面积(平方厘米)表示];培养皿(直径有3.5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等规格);离心管(5毫升，10毫升);注射器(1毫升，5毫升等);用生理盐水瓶代替的贮存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升);青霉素瓶(5毫升);西力辛瓶(10毫升);其它还有尖吸管和移液管，载玻片(厚度0.8～1.2毫米)，盖玻片(厚度0.12毫米)，贮存尖吸筒用的玻璃筒或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸馏水瓶，冷冻管(1.5毫升，2毫升)等。
细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林
实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)
原代肝细胞分离培养与方法 肝细胞的分离和培养是体外组合性生物人工肝研究的基础，但单纯机械分离法对肝细胞损伤较大，分离后的肝细胞体外培养的难度亦较大，方法复杂，成本较高 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 1 非酶分离细胞法 1．1 直接分离法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，剪成小块，通过机械方法(挤压、剪碎、震荡、吹打)得到单个细胞，多与 EDTA螯合法、灌注法相结合，即先用 EDTA溶液进行充分的灌流，再剪成组织小块，然后用各种机械的方法分离得到肝细胞。该方法操作简单、流程短，不需要复杂仪器和昂贵的胶原酶。但实验操作对细胞的损伤大，尤其是造成细胞表面蛋白不可逆的机械性损伤，导致细胞的获得率和存活率较低。 1．2 组织块培养法：用麻醉剂 (乙醚、戊巴比妥纳等 )将动物麻醉或直接断头处死，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，以 0．5 cm的间隔接种于培养器皿中(25 m L的培养瓶中可接种 3O块 )，先加入少量的培养基，静置培养 12～ 24 h后再加入足量的培养基。该操作过程短，污染少，损伤小，细胞成活率很高而成本低。但纯度不高，且形成典型上皮细胞层所需时间较长，在细胞爬出后还需剔除组织块，易造成二次污染。可能是因为成年动物的结缔组织比新生动物的结缔组织致密，肝细胞难以迁出，故此法多用于 1～ 6 d的新生动物或动物胚胎。 2．离体肝脏酶消化分离法 2．1 胰蛋白酶、胶原酶消化法：麻醉或处死动物后，取出肝脏，用缓冲液充分洗涤后，剥离肝被膜，将其剪成 1 mm。的组织小块，充分洗涤后，在 37℃下用胰酶或 (和)胶原酶消化，待消化物成蓬松的絮状物后加入培养基终止消化，吹打均匀后经 200目不锈钢网筛过滤后，离心、重悬即可获得肝细胞。胶原酶只消化细胞间质而对肝细胞机械性损伤较小，也能较完整地保存膜蛋白¨7]，分离效果好。肝细胞产率高、损伤小，且保持特异性功能的时间长。但胶原酶价格比较昂贵，成本高。胰蛋白酶既消化细胞问质又消化细胞本身，操作简单，价格便宜，但胰酶消化的条件极难把握而使该法未被广泛应用 L8．9_。 2．2 胰蛋白酶、胶原酶消化的组织块法：处死小鼠，无菌分离肝脏，置 D-Hanks液中，冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成 1 mm。的组织块，在 37℃下用胰酶或(和)胶原酶消化后，加人培养基终止消化，自然沉降后，取下层组织块，再用培养基洗涤数次即可将肝组织块贴壁于培养瓶中，每个培养瓶放组织块 30~35块，加少许培养基。该法分离效果、纯度较单纯的组织块法好，且细胞从组织块爬出时间相对短。但消化酶的用量和时间不易控制：消化过度，形成的絮状组织块不能分离；消化不充分，酶没有发挥其作用[10~12]。 2．3 在体肝脏酶灌注法 2．3．1 Seglen灌注法：即经典的二步胶原酶灌注法。两步灌注即经门静脉以无钙缓冲液和胶原酶恒流、恒温灌注，这是目前国际上公认的方法。首先用不含 Ca 的离子螯合剂(EDTA等)移走肝组织中的 Ca ，从而打破固定细胞的细胞桥粒样结构；再用胶原酶进行蛋白分解
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
细胞生物学实验报告 实验三细胞原代培养 1引言 1.1 实验目的 1. 理解细胞原代培养原理。 2. 了解细胞原代培养的应用。 3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。 4. 巩固无菌操作技术。 1.2 实验原理 细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等 2.3 实验材料 动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚 2.4 实验步骤 A.鸡胚成纤维细胞的原代培养 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。 5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋 壳。 6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。 7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。 8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。 9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组 织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。 11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源：PriCells 点击次数：335 关键词：上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长，既有上皮样细胞又有纤维样细胞，纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。 在体外培养原代细胞时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步，甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。 一、原代细胞增殖优势纯化方法：
自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长，留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的，不断纯化而建立细胞系。 二、原代细胞常用纯化方法： 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法： 酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，是两者分开，达到纯化的目的；另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。
小鼠肝细胞原代培养+灌注 我把我整理和收集战友的一些资料供你分享： 材料：小鼠 器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器 试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。 操作步骤： 1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。 4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。 6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。 7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。 8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。 肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。 目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下： 1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露， 结扎离断脾动脉、胃左动脉注射肝素100U。缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将其离断，这样就可显露脾静脉与肠 远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。迅速切除肝脏，术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。 2:灌注液的配置： Perfusion Solution 1（g/L）： NaC L 8.000 NaH2PO4?2H2O 0.078 KC L 0.400 Na2HPO4?12H2O 0.151 NaHCO3 0.350 EDT A 0.190 HEPES 2.380 Gluc ose 0.900 磁力搅拌器使固体成分充分溶解，用1M HCL或1M NaOH调定pH 7.2～7.4（使用pH计），0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌，4℃保存，使用时液体温度维持在37℃（应用水浴箱）。 Perfusion Solution 2（g/L）： NaC L 8.000
原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织
已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时 也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去
原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。 Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进。作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌
注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。肝细胞分离时, pH 值宜维持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超过 7 . 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压, 提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。 培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板 ,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用 Sigm a公司提供的胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8%胎牛血清的 W E作培养基 ,效果不错 , 但 WE价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小 ,细胞不易生长 ; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为 5×105 / m l左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为自行配制。Williams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。BT01-100
原代培养肝细胞就是肝细胞移植、生物人工肝得最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量得研究 , 但要获得高活率、功能好得肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法、机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法就是用可结合 Ca2＋、M g２＋得螯合剂(如枸橼酸盐或ＥDＴＡ) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶就是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小, 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝得同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在得蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生得细胞内、外环境及细胞间得各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要得促进作用,有利于肝细胞得培养。这种适应性改变恰恰就是机械分离法所没有得。因此 ,要获取理想得肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。 Seglｅｎ二步灌注法为经典得胶原酶消化法,但所需设备较复杂,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进、作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶得用量、作用时间及作用条件就是分离成功与否得关键。胶原酶得浓度过高 ,作用时间难以控制; 浓度过低 ,
则作用时间过长、细胞活率降低、事先用无Ｃa2 +、M g2+得灌注液进行预灌注, 去除 Cａ2+依赖性粘附因子,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+得胶原酶消化 ,胶原酶得作用需要 Ca2＋得活化 , 在 5 mmoｌ/ＬCa２+浓度下 ,用浓度为 5０0 mg/ L 得胶原酶 37 ℃条件下消化１5 mｉn 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在０～ 4 ℃。肝细胞分离时, ｐH 值宜维持在 7 。 4 左右, 不低于７。 2 ,最高不超过７。 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤、在肝灌注液中加入适量得小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢与液体渗透压, 提高肝细胞成活率、此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。 培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原得新培养板与没有铺过胶原得新培养板 ,铺过胶原得老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原得新培养板中长势更好、新得培养板使用 Sigm a公司提供得胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8％胎牛血清得Ｗ E作培养基 ,效果不错 , 但WＥ价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清得RPM 1６４0培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞得接种密度对其以后得生长状况有很大得影响 : 密度太小 ,细胞不易生长; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够得空间供细胞伸展、当细胞密度为 5×1０５ / m ｌ左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为
原代细胞的取材 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。 （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min 的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞． 二、实体组织材料的分离方法 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头 压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （１）胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开．胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。 ①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效．