聚氨酯植入装置用于血管内局部定位基因
治疗的实验研究?
张琳华1，宋存先1*，杨菁1，SJ Stachelek2, RJ Levy2 1中国医学科学院中国协和医科大学生物医学工程研究所（300192）
2The Division of Cardiology, Children’s Hospital of Philadelphia，USA （PA 19104）
摘要：目的 利用可植入体内的经过修饰的功能化聚氨酯构建2种血管内植入装置，分别植入猪主动脉和羊肺中进行基因转染实验，研究其作为基因运载平台的可行性。方法 将涂覆胶原的聚氨酯膜通过抗体免疫偶联编码绿色荧光蛋白的腺病毒（AdGFP）制备成聚氨酯-胶原膜埋植钮装置并植入猪主动脉中，7天后取出埋植钮及其周围组织进行切片、荧光显微镜检测及PCR分析，用以评价AdGFP的转染情况及分布；将抗腺病毒抗体直接通过共价连接在带有硫醇化烷基的功能化聚氨酯膜上实现与AdGFP的免疫偶联，制备成聚氨酯人工瓣膜并植入羊肺中，7天后取出肺部小叶及其周围组织进行荧光显微镜检测及PCR分析，用以评价AdGFP的转染情况及分布。结果 在猪体内实验中，植入体表面的新生内膜细胞基因转染率为14.3±2.5%；在羊体内实验中，聚氨酯瓣膜小叶上的细胞有25.1±5.7%被转染。PCR研究表明血液或末端组织中都没有检测到GFP DNA。结论 研究表明这两种血管内聚氨酯基因载运系统能够作为靶向高效载运腺病毒的载体，用于心血管疾病的基因治疗。
关键词：功能化聚氨酯 埋植钮 人工瓣膜 基因治疗
心血管疾病的基因治疗发展迅速，显示出巨大潜力。然而，目前血管疾病的基因载运方案大部分还只是集中于病毒载体悬浮液注入血管内腔的实验性研究，进行基因转染的结果显示局部只有微量的基因表达，而在周边却有大量的基因扩散1–3。很多文献报道基因支架作为基因治疗载体更具优势。我们已经报道了将腺病毒通过共价键连接到球囊扩张不锈钢支架的表面上，作为载体将其运送到靶部位4–8，结果证明此方法切实可行，放置支架处有很高的基因表达而外周无基因扩散。我们进一步制备和表征了可植入体内的用于基因运载的功能化聚氨酯，它可以通过化学反应连接抗体，再通过特异免疫反应偶联病毒基因，达到靶向基因运载。本文利用这种功能化聚氨酯构建了两种血管内植入装置模型：（1）聚氨酯-胶原膜埋植钮（2）聚氨酯人工瓣膜，并分别在猪和羊动物模型上进行体内实验。实验结果显示这两种血管内聚氨酯基因载运系统能够靶向载运腺病毒，并且能够达到较高效的基因表达，其末端
?国家自然科学基金(50473059)，天津科委重点基金(043803011)和教育部博士点基金(20030023004)资助Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (50473059), the Tianjin Committee of Sciences and Technology Key Program (043803011) and the Fund for Doctoral Discipline Area from the Ministry of Education of China (No. 20030023004)
#Corresponding author Tel/ Fax: 022-********, E-mail: scxian@https://www.doczj.com/doc/6a12329768.html,
扩散却很少甚至没有末端扩散。
1 材料与方法
1.1 材料
Vitrogen100 I型牛真皮胶原购于Cohesion公司；携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）编码基因片断的腺病毒（V,E1,E3缺失）原液购于宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所；小鼠抗腺病毒纤突单克隆F(ab)’2抗体(anti-knob F(ab)’2)购自美国加利福尼亚州圣地亚哥Selective Genetics；Carbothane3575A（一种脂肪族聚氨酯）和Tecothane TT1074A（一种芳香类聚氨酯）购于Thermedics公司；化学偶联剂N-琥珀酰亚胺基3- (2-吡啶二硫基)丙酸酯 [N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)-proprionate,SPDP]购于Pierce化学公司；二甲基亚砜(DMSO)和1-乙基-3-(3-N,N二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDAC）购自Sigma化学公司。
1.2 方法
1.2.1 聚氨酯-胶原膜埋植钮的制备
将Delrin?聚甲醛树脂钮与血液接触的表面浸于聚氨酯（Carbothane 3575A）氯仿溶液中，室温过夜除去氯仿。切除Delrin?钮上多余的聚氨酯并在三环氧丙烷基胺（triglycidyl amine，TGA）溶液中孵育过夜。用PBS冲洗除去游离TGA，未反应的基团用10mg/ml 的牛血清封闭。I型牛胶原溶液调pH值为7.4，按0.1mg/mg胶原的浓度加入EDAC溶液，37oC放置40min，将该胶原滴加到已涂覆聚氨酯的Delrin?钮上，真空干燥过夜。涂敷聚氨酯-胶原膜的钮首先与浓度为20mmol/L 的SPDP溶液在室温反应5小时，经大量的PBS冲洗后，再与抗腺病毒纤突抗体(anti-knob F(ab)’2)室温反应过夜，使抗体化学偶联到涂覆在Delrin?钮上的聚氨酯-胶原复合膜上，经大量的PBS冲洗除去未偶联的游离抗体，再与编码绿色荧光蛋白的复制缺陷腺病毒（AdGFP）溶液（108 PFU/ml）在37oC孵育30min，使AdGFP 通过与anti-knob F(ab)’2特异结合连接至聚氨酯-胶原膜上，然后用PBS冲洗除去未结合的游离AdGFP，得到偶联AdGFP的聚氨酯-胶原膜埋植钮，储存于4℃，并在24h内埋植在动物体内。
1.2.2聚氨酯人工瓣膜的制备
聚氨酯（TT1074A）溶于N,N-二甲基乙酰胺并与过量的1,4-二溴丁烷混合，冷却到–5oC～–8oC后加入叔丁醇锂进行阴离子聚合反应，在0oC反应2h后用冷甲醇沉淀, 洗涤并干燥后与硫代乙酸在温和条件下反应生成带有硫醇化乙酰基的聚氨酯。将该聚氨酯制备成0.15mm厚的膜，膜和5M氨水反应2h生成硫醇基团并用大量双蒸水冲洗后与过量的1,4–二-(DPDPB) 反应过夜。次日，用PBS冲洗膜，并在anti-knob F(ab)’2溶液中孵育5h，然后在AdGFP溶液（108 PFU/ml）中孵育过夜并制备成肺部小叶，得到固定化抗体免疫偶联
AdGFP的聚氨酯人工瓣膜。
1.2.3猪植入手术
实验选用体重约70公斤的雌性猪，肌肉注射Telazol (10mg/kg)并辅以静脉注射硫喷妥钠（12mg/kg）进行麻醉。从腹部中线处割开，暴露出肾主动脉以及相连的动脉外膜。按70U/kg静脉注射肝素，用止血钳剥离动脉，将四个埋植钮沿肾主动脉插入，每个间隔大约1cm。腹腔用5-0号聚丙烯纤维缝线缝合。7天后给实验动物注射肝素 (5000U)处死。手术切开缝合部位暴露出埋植钮，在不触动埋植钮的情况下从其周围和末端血管组织切离取出埋植钮，将聚氨酯-胶原膜轻轻地从埋植钮的表面剥离。
1.2.4 羊植入手术
实验选用雌性或阉割的雄性羊（4-5个月，体重30-55公斤），用三氟溴氯甲烷或异氟烷麻醉。将约1.5cm2的聚氨酯人工瓣膜用常规的胸廓切开术通过第四脉间的心肺旁路血管埋入肺部。7天后，用过量的巴比妥酸盐安乐处死羊。
1.2.5聚合酶链式反应(PCR)
及时从处死动物身上切取约1cm3大小的肺、肾、肝和脾，立即于液氮中冰冻。用苯酚和氯仿提取DNA，上游用GFP特异性引物5’-GGC TGC TGC AAA ACA GAT AC-3’，下游用GFP特异性引物5’-GGC ATC CTC TAG AGT CGA C-3’进行PCR扩增，循环次数为35。采用琼脂糖凝胶电泳分析结果。
1.2.6荧光显微镜观察
取出的组织经OCT固定后切片，组织切片用DAPI进行细胞核荧光染色，在尼康TE-300荧光显微镜下通过相应的滤镜观察并计数GFP的表达和细胞核的总数，评价GFP的转染效率。
2 实验结果
2.1猪肾主动脉聚氨酯-胶原膜埋植钮的体内基因转染研究
对聚氨酯-胶原膜上腺病毒介导性基因载运进行体内实验研究。实验组和对照组每组6只猪，每只猪的肾主动脉被缝入4个聚氨酯-胶原膜埋植钮。实验组每个埋植钮含有1×108PFU的AdGFP，对照组埋植钮的制备如上所述，但对照组没有连接腺病毒。所有的动物在存活时均未出现明显不良反应。7天后埋植钮和周围组织切片病理分析显示实验组和对照组没有差别，说明被实验动物对该剂量下的AdGFP具有良好的耐受性。但无论是实验组还是对照组都观测到了组织血栓症。
荧光显微镜观察移植出的聚氨酯-胶原膜埋植钮上的AdGFP转染情况的结果示于图1a 和1b。用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)滤镜观察GFP转染，呈绿色荧光；4，6-联脒-2-苯基吲哚（4-6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）滤镜观察细胞核，呈蓝色荧光。实验组中，通过抗体免疫偶联AdGFP的埋植钮可观察到明显的绿色荧光点，表明有GFP表达（图1a）。对照组中，未免疫偶联腺病毒的埋植钮未观察到绿色荧光，表明没有GFP表达（图1b）。基因转染率的定量分析显示埋植钮表面的细胞总转染率为14.2±2.5％。这些研究
表明了可以通过抗体免疫偶联实现特异位点的腺病毒介导性基因载运。用PCR检测分析血液﹑肝脏﹑肺﹑脾和肾，以观察埋植部位以外腺病毒介导性基因的转染情况（图1c）。进行35周期的PCR反应，在琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）上检测，结果显示在血液和末端组织没有检测到GFP DNA，说明腺病毒载体紧密地偶联在埋植钮上，实现了靶向基因投递。
a 实验组埋植钮的FITC/DAPI荧光显微图（×200）
b 对照组埋植钮的FITC/DAPI荧光显微图（×200）
c 肝脏﹑肺﹑脾、肾、血液的PCR分析结果
图1聚氨酯-胶原膜埋植钮在猪肾主动脉的基因转染结果
2.2羊肺聚氨酯人工瓣膜的体内基因转染研究
我们将共价键结合抗体并免疫偶联AdGFP（剂量为1×108PFU）的聚氨酯膜制备成肺部小叶，替代小羊（n＝6）的肺瓣膜尖，进行通过固定化抗体免疫偶联腺病毒的体内基因转染研究。对照组中，聚氨酯膜以共价键连接抗体，但未偶联腺病毒（n＝6）。7天后，小羊被处以安乐死，取出肺部小叶及其周边组织，评价其生物相容性和AdGFP介导的基因转染情况。
一只小羊在埋植了连接有病毒的小叶后约24小时死亡。尸检显示该羊体内各器官状态良好，无感染出现，说明该羊死于严重的术后并发症。其余的小羊在为期7天的实验研究中继续观察，观察结果显示实验组和对照组小羊的健康状况没有明显差异。实验组和对照组的肺外流道处检测结果无明显差别，都显示出光滑的血液接触表面。
荧光显微法检测术后聚氨酯人工瓣膜埋植处的AdGFP转染情况。用FITC滤镜观察GFP 转染和DAPI滤镜观察细胞核。实验组中，免疫偶联AdGFP的瓣膜小叶及其相邻心肌层出
现明显的绿色荧光斑（如箭头所示），说明在该区域有GFP表达（图2a和图2c）。对照组中，未偶联腺病毒的瓣膜小叶及其周围心肌层却没有检测到绿色荧光斑，说明没有GFP表达（2b 和2d）。基因转染率的定量分析显示连接在聚氨酯瓣膜小叶上的细胞有25.1±5.7％被转染，聚氨酯心肌层交接处有17.8±1.89％的心肌肌细胞表达了GFP。以上实验说明抗体免疫偶联腺病毒载体的聚氨酯人工瓣膜能够作为基因载运系统。PCR分析（图2e）血液、肝脏、肺、脾、肾中的GFP DNA，结果显示在血液及末端组织中没有GFP DNA，说明基因被靶向投递到了植入体小叶。
a 实验组人工瓣膜的FITC/DAPI荧光显微图(×400)
b 对照组人工瓣膜的FITC/DAPI荧光显微图(×400)
c与实验组人工瓣膜相邻心肌层 d 与对照组人工瓣膜相邻心肌层
的FITC/DAPI荧光显微图（×400）的FITC/DAPI荧光显微图（×400）
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e 肝脏﹑肺﹑脾、肾、血液的PCR分析结果
图2 聚氨酯人工瓣膜在羊肺的基因转染结果
3 讨论
主动脉聚氨酯-胶原膜埋植钮和聚氨酯人工瓣膜第一次被用作功能性特异位点基因载运装置。不同于以前通过导管将病毒载体悬浮液灌注到指定部位的基因治疗方案，其基因转染效率较低并且不能在疾病部位有效靶向定位，同时病毒载体广泛扩散有可能引起系统性毒副作用，本文采用化学反应连接抗腺病毒抗体，再通过特异免疫反应将腺病毒基因偶联在埋植钮和人工瓣膜上，达到局部定位基因运载。这种抗体偶联的病毒定位递送大大减少了病毒的远距离扩散，增加区域有效性。研究结果表明这2种抗体偶联病毒的聚氨酯植入装置能实现腺病毒的定位递送，提高病灶局部的基因表达并防止末端组织转染，实现高效局部基因运载。
聚氨酯本身缺乏反应性基团，我们通过新型化学合成在聚氨酯共聚物硬段引入硫醇化烷基侧链，可以将活泼的硫醇基团通过共价连接在聚氨酯表面，进而实现以聚氨酯作为基因载运平台用于体内基因治疗。
由于胶原的生物相容性，在聚氨酯表面进行胶原涂覆用于基因载运时发生炎症的可能性很小。另外由于胶原的血栓形成特性，胶原可以作为一种有用的血管移植复合材料，因此本文采取在聚氨酯膜表面涂覆胶原，然后通过抗体免疫偶联AdGFP制备成聚氨酯-胶原膜埋植钮。然而，选择合适的人工瓣膜复合材料时需要考虑血小板的黏附作用，由于胶原可以增强血小板黏附作用，在设计聚氨酯人工瓣膜时，我们将抗体直接通过共价连接在功能化聚氨酯膜上，这种设计不但可以降低血小板黏附作用且具有良好的血液相容性。我们的研究显示聚氨酯人工瓣膜在体内的作用可超过5个月，并且不会发生炎症反应。对猪主动脉聚氨酯-胶原膜埋植钮和羊肺聚氨酯人工瓣膜动物模型进行PCR分析，结果表明在末端组织和血液中都未检测到GFP DNA，说明抗体免疫偶联腺病毒联合体随聚氨酯血管埋植体进入细胞，实现了靶向基因载运。
三环氧丙烷基胺（triglycidyl amine，TGA）是美国费城儿童医院Robert Levy教授等研究合成的一种新型聚环氧交联剂9，我们将聚氨酯膜及其Delrin?钮在TGA溶液中孵育不仅可
以将胶原与聚氨酯相连接，还能提高制备的聚氨酯-胶原膜埋植钮的生物相容性及抑制钙化作用。
我们首次利用修饰后的功能性聚氨酯膜作为靶向高效的基因载运系统。结合聚氨酯的基因携带能力可以将其应用于心脏起搏器、支架、血管移植、心脏瓣膜等装置中[9,10]。总之，我们发现通过抗体免疫偶联腺病毒的聚氨酯膜能够作为基因载运系统，在两种不同的血管移植装置中，这种修饰后的功能性聚氨酯表面能提供高效靶向的基因表达，可以实现高效靶向基因治疗。
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Zhang Linhua 1, Song Cunxian1*,Yang jin1 , SJ Stachelek2, RJ Levy2
1 Institute of Biomedical Engineering, CAMS and PUMC, Tianjin, China, 300192
2The Division of Cardiology, Children’s Hospital of Philadelphia, USA, PA 19104
Abstract:Objective To explore the feasibility of utilizing two implantable devices made from modified polyurethane films with antibody tethered AdGFP as gene delivery platforms. Methods Intra-aortic button implants of collagen–coated polyurethane films with antibody tethered AdGFP were sutured into the infrarenal aorta of adult pigs and pulmonary valve leaflet in juvenile sheep was replaced by polyurethane pulmonary valve cusp replacement with antibody-tethered AdGFP. After 7 days, the buttons, prosthetic leaflets and their surrounding tissues were explanted and evaluated for biocompatibility and AdGFP-mediated gene transfer by fluorescent microscopy and PCR analyses. Results In vivo analysis of gene transfer from collagen-coated polyurethane films in pig infrarenal aorta implants, one week explants of the collagen-coated polyurethane films demonstrated14.3±2.5% of neointimal cells on the surface of the implant. In sheep pulmonary valve leaflet replacement studies, polyurethane films with antibody tethered AdGFP vector demonstrated 25.1±5.7% of cells attached to polyurethane valve leaflets were transduced in 1 week. PCR analyses showed that GFP DNA was not detectable in blood or distal tissues. Conclusions It is concluded that site-specific intravascular delivery of adenoviral vectors for gene therapy can be achieved with these two kinds polyurethane implants utilizing the antivector antibody tethering mechanism.
Keywords:modified polyurethane; button implant; prosthetic leaflet; gene therapy