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每天对待细胞比孝敬爹妈还用心,那真就是捧在手里怕碎了,含在嘴里怕化了,瞧在眼里怕丢
1。严了,培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢？??早走早脱身,从此专注黑生物??
格无菌操作,多喷喷酒精,要就是对灭菌得东西不放心,自己包自己送自己烘干、??２. 不要与别人共用试剂耗材,自己准备一套。
4. 水浴锅很脏,生化培? 3. 有可能得话在拿到新细胞得时候做好支原体衣原体检测。??
养箱要就是得手动加湿得话盘里得水也会很脏,勤换(灭菌水加进去)、??５. 晚上离开得时候最好给细胞房照紫外,超净台就是用完就开。??6、最好得就是同一时间就您一个人在用细胞房在养细胞。
?非科班出身经验分享
?１。别怕浪费。枪头什么得只要有可能污染就换,如果用酒精灯就什么都稍微烤一下,别直接放到火上,离一段距离。
2。动作要既轻柔又有力、动作太重会有一堆一堆得气泡,动作太轻就吹不下来、、、刚开始得时候吹细胞太痛苦了,稍微一下就起泡。后来就就是吹得时候枪里得培养基不要一次全都压出来,留一点,枪得最头部尽量深得在液面以下。??3、离开过操作台得东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍,包括一切实验耗材、仪器、以及您带着手套得手、
４、实验结束后对实验台得消毒。紫外什么得,用前用后都照个3０分钟。
? 5. 身体得各个部分尽量得少接触不需要接触得地方得地方。比如实验台,又比如培养箱
6、细胞得密度根据细胞得性质、传代得时间以及自己得心情来定。培养基得话内部。??
最多最多不要超过 2 天就要换一次。细胞可以不传代,但就是培养基就是一定要换得。??大概就就是,不该碰得地方不碰,有影响得地方少碰; 该使劲得时候绝对不含糊,不该使劲得地方一定忍住、如果就是比较简陋得操作台就一定要摆个酒精灯,所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果就是高级台子就多用酒精喷喷、感觉生物得实验,心疼钱就还就是不要做了、?最后一点点绝对非科班得经验、癌细胞真就是坚挺。有一次实在就是不想传了,放了 5 天吧,感觉都长了几层出来,培养基都黄了。抱着试一试得心情传了一次,又坚强得活过来了。当然,状态肯定也差得很了。
换种心情,好好生活!
养了三年细胞,各种肿瘤细胞,说一点自己得瞧法:??1。培养细胞前,可以瞧瞧细胞特点说明书,包括细胞正常生长得状态图、传代、培养基得类型等。
2。不同细胞生长周期不同,有得生长很快,比如说MDA—MＢ－2３1,传代得时候取离心悬液得十分之一就已经足够了,有得又就是特别慢,等得人心焦,BＴ474 就就是,传代就是一分二,复苏起始得时候两周多才能长满,所以就要在培养细胞得过程中多多摸索了、?
３、对于娇弱得细胞,就得细心呵护了,胰酶消化不能过久,吹得时候要轻柔,离心时候也要注意转速与时间,每天都要去瞧一下细胞,肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。??４、冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基、?
５。培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。
?6。养细胞最大得教训:不能偷懒!??细胞虐我千百遍,我待细胞如初恋。??1、不管买得细胞、惠赠得细胞,刚拿到手赶紧做两件事:检测就是否有支原体污染;迅速扩增冻存、?
２。发现有污染迅速处理掉,特别就是当您养了很多种细胞时;细菌污染,真菌污染很容易发现,支原体污染得话,细胞会长得慢,买个支原体检测得kit 定期检测一下、
?３、细胞房日常得值日清洁就是必须得,此外还要定期熏蒸。
?4、细胞得传代一定要规律,保持相同得cｏnｆlｕeｎｃy与传代时间间隔,不要随心所欲或者拖延、
5。注意个人卫生、
靠内心感动细胞
1. 自己得细胞自己养,血得教训。?
２。在生物安全柜(或者超净台),枪头,血清管,血清,培养基,瓶子都足够好,并且细胞房有良好得卫生措施(比如隔离服,手套,口罩,清洁,HEＰA 等等)且不违法操作原则得情况下,您其实很难污染。
3。上述条件不完备得情况下,就要多注意无菌操作了:比如要用得东西提前拿到台子里照啊(不过这个其实也不大好,因为会挡住紫外线),使用前SDS+酒精擦台子,进出超净台一定要酒精擦手、
?4。少对细胞说话,多靠内心来感动它们(就是得！心不诚就是不可以得!) 至少１天瞧 1 次。??养细胞很容易??养细胞真得不难,最关键几点:??1。所有得东西使用最好得,如果您用得血清、培养皿、培养基、胰酶什么得都就是进口得,真得很难相信您会把细胞养坏。?
2. 动作要快,胰酶消化,换液什么,细胞暴露在空气中得时间越少越好。另外,要掌握好胰酶消化时间,所谓得细胞状态差,很多时候就是传代得原因。
３、有时间得话,需要细胞计数,传相应数目得细胞到培养皿中,可以大致清楚细胞得生长曲线,不会临时要处理,手足无措。
? 4.要做什么心里要非常清楚,合理安排时间,细胞房得实验穿插进行,可以节省很多时间,也不会耽误别人得实验。
?5、个人得实验器具自己收一套,不要与别人混用,最近换了什么新得东西稍微记一下,试剂一旦怀疑污染,马上丢。?
6、细胞房不能进去太多人,避免相互干扰。?
细胞养不好,自挂东南枝
现在一大型药企养细胞做检测,工作量很大,很多地方都没办法非常仔细得做、但就是两年下来只出现过一次污染,总结一下心得:
?1。好得洁净室,空调系统跟得上、
?2。好得生物安全柜,硬件跟得上。
３、瓶子移液器吸头大都就是进口,耗材跟得上、除了这些就就是自己得操作习惯了。??４、任何东西不要从敞开得瓶口上面经过。?
5。虽然酒精灯会干扰安全柜气流但就是还就是需要一盏用来勤烧瓶口、??６. 实验时所用材料得位置摆放要顺手,污染源与已灭菌物品要分开放置。
?养细胞就像打仗
?细胞饲养涵盖得内容太广了,而且不同种类细胞得饲养难度以及技术要求不同,肿瘤细胞,成纤维细胞,上皮细胞。.。甚至各类干细胞、、.每一种都有自己得生长要求、如果只就是单纯得一般性操作,大同小异,个人觉得练好技术得情况下注意几点就好:??1、各种无菌,从培养基到操作过程再到培养箱,时刻注意无菌、本人曾经所在得实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭。。. 教训惨痛。
２。培养基得配制一定要做好梯度摸索并详细记录,否则细胞死都不知道怎么死得、
?３. 尽量提高操作熟练度,减少培养皿在培养箱外得滞留时间,细胞很脆弱,经不起折腾,不像人,热了有空调,冷了能烤火。
4. 把握好培养基更换得时间,不同细胞类型时间不同,早了浪费试剂,晚了可能全军覆没。?5。经验很重要,养细胞得很多经验您就是无法在公开得书籍与资料上找到得。多向实验室前辈学习,她们会让您少走很多弯路,真得。?
养细胞就像打仗,知彼知己,百战不殆。只有了解您养得对象,才能把她养好。??细胞就就是矫情
养细胞细胞这个东西呢有得时候真说不清。养过一段时间得巨噬细胞,一开始操作各种谨慎小心,随时默念各种无菌原则,培养基什么得都用得进口得,其实国产货真得不差,有钱就就是任性! 但细胞还就是萎靡不振,两个多星期过后实在懒得管,换液等操作也很随意得草草进行,酒精也懒得喷,结果这货却开始疯长,过了几天居然达到一天要传一次代,而且数量甚至可以一传三, 所以说,有得细胞就就是矫情。
传代细胞培养的视频拍摄脚本 一、实验准备 器材 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、离心机、分析天平、倒置显微镜、超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、离心管（9个）、带塞培养瓶（不定个）、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶、无菌冻存管、液氮瓶（一）、器皿 1玻璃器皿的清洗灭菌： 种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管 药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml （1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的） （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干 （镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法） （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作
用，操作过程需戴防护用具。 （镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕的形式显示浸泡时间） （4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次 将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间） （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。 （镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌） （实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）2、橡胶制品清洗消毒 种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头 新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备
细胞培养常见问题及其解决 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 8. 细胞之接种密度为何？
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5小20 d、200 pl> 1ml）,酒精灯1盏，液器1台，斜架1台， 酒精喷壶 1 个，酒精棉球缸 1 个，污缸 1 个， 常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml）,枪头（1ml、200小 10 d）,培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO,胰酶，苯扎溴氨，75% 酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边，待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试 剂及污缸等，关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换
培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取 1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM 含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。
细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细 胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。 水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。 二、制备细胞悬液 吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。 离心：1000rpm，室温离心3min。 注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。 三、细胞培养 离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。 四、注意事项 1、解冻速度要快 在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻 存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多 细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数
细胞培养的流程，从购买试剂、分装，到无菌操作、实验、观察的过程？ 对于新手来说，细胞培养真是太难了，很多的细节你不可能一下子就考虑到、预见到，因此请教细胞培养的高手就显得非常重要且可贵了。 细胞培养包括仪器的清洗、消毒灭菌，试剂的购买、配制、分装，细胞的分离，无菌操作，培养细胞的观察，实验的设计，及结果的分析等等。但这每一个过程的含金量都很高，要求非常严格。 如果你正在培养细胞，或曾经培养过细胞，你一定有很多的经验值得大家分享，你一定有你自己的一套培养细胞的流程，从哪开始到哪结束你也一定有太多的想说。因此，你不妨说说你的细胞培养流程，以便我们广大的细胞培养新借以一鉴。 于此，我先代表广大细胞培养新手谢谢各位园丁里的奉献者！ 有空整理一下再写写。。呵呵谢了先版主建议不错，我刚开始养细胞时遇到的各种困难可以说是不计其数了，解决困难耗费了大量地时间，可惜呀！ 养细胞是一项即有难度又很讲究技术的过程，作起来不易，要真正详细的写出来示人更难！书上的规范和标准很多，但作起来每人都有自己的方法，适宜就好。 我看还没有人跟帖，我就先说一点，从最初阶段开始：（自己的做法） （一）仪器的清洗 总的分为两大类：可泡酸的和不可泡酸消毒的。酸指消毒的清洁液（由浓硫酸、重铬酸钾和蒸馏水配置的次强酸液） 可泡酸的主要是玻璃仪器培养细胞的板子，离心管等塑料器皿。消毒过程：自来水冲洗3-5遍----→超声波清洗30′----→烘干----→濅入清洁液过夜（不少于6h）----→自来水冲洗15－20遍----→蒸馏水洗3-5遍，烘干备用。 不可泡酸的主要是胶塞和盖子，虑器等，先在清水中濅泡后冲洗烘干----→2%NaOH濅泡过夜，自来水冲洗，5%HCl濅泡三○min，流水冲洗----→蒸馏水漂洗----→烘干备用。 消毒好的器具一定找个干净的柜子保存，使用前高压消毒灭菌，我科室主要使用铝制饭盒分装器具，挺方便的，用前高压。 今天暂说一点，以后有机会再续，望给师弟妹们有所借鉴。斑竹不厚道，现在知道为什么没有别的战士跟贴了么？我怎么也耗了几十分钟打的字，你就这样打击别人的信心，还有可能往后面延续么！再说，经验何止这些这点...... 您的帖子我看见了，您的抱怨我也接受！并且跟您补上一分！ 每个斑竹给分的标准有一定的差别，但是可以肯定的是：我们有自己的加分原则，大原则是不变的！比如：版内讨论得很多的东西，重复发帖一般不予以加分！ 您的这个帖子属于改范畴！ 感谢您对细胞版的支持！如果有问题可以直接pm我们！ 再次感谢！再多说点啊！ 呵呵接着说呀，很好，很有帮助，我是新手，要多向你学习顶一下。我也说说我的一些体会吧。 1、首先说清洗： 对于玻璃器皿（如移液管、盖玻片之类）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水将移液管冲洗10遍，除去残留酸液，再用双蒸水冲洗3-5遍，彻底洗净后放入不锈钢筒中，双层牛皮纸扎口，高压灭菌20min，烘干待用。我们实验室的酸液一般是次强酸液（重铬酸钾120g 浓硫酸200 mL 蒸馏水1 000 mL）配液时要小心烫伤。装培养基的瓶子则要在每次用完培养基以后就要立即洗净，临用时再次用清水冲洗3-5遍，再用双蒸水漂洗3次，洗净后瓶口盖上锡箔纸，外包双层牛皮纸扎口后高压灭菌20min，与其配套的瓶盖则洗净后另行包好同时灭菌、烘干。培养基过滤器灭菌同瓶子，也要在用完后及时洗净、
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法： 问题1培养液pH值变化太快 可能原因 (1)CO2张力不对 (2)培养瓶盖拧得太紧 (3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足 (4)培养液中盐浓度不正确 (5)细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法 (1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。 (2)松开瓶盖1/4圈。 (3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 (4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。 (5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因 (1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来 (2)冰冻保存培养液 建议解决方法 (1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。 (2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。 问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化 可能原因 细菌或真菌污染 建议解决方法
丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题4：培养细胞不贴壁 可能原因 (1)胰蛋白酶消化过度 (2)支原体污染 (3)培养瓶瓶底不干净 (4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解) (5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不 细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性) (7)接种细胞起始浓度太低或太高 建议解决方法 (1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 (2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。 (3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶 (4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可) (5)重新配置消化液或培养液 启用新的保种细胞 (7)调节最佳接种细胞浓度 问题5：悬浮细胞成簇 可能原因 (1)培养液中含钙、镁离子 (2)支原体污染 (3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释 (4)DNA污染 建议解决方法 (1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。 (2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。
细胞培养热点常识 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1
精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度
相关疾病: 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心,那真就是捧在手里怕碎了,含在嘴里怕化了,瞧在眼里怕丢了,培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? ?早走早脱身,从此专注黑生物??１。严格无菌操作,多喷喷酒精,要就是对灭菌得东西不放心,自己包自己送自己烘干。 ?２.不要与别人共用试剂耗材,自己准备一套。 ?３、有可能得话在拿到新细胞得时候做好支原体衣原体检测。??4。水浴锅很脏,生化培养箱要就是得手动加湿得话盘里得水也会很脏,勤换(灭菌水加进去)。 5、晚上离开得时候最好给细胞房照紫外,超净台就是用完就开、?? 6、最好得就是同一时间就您一个人在用细胞房在养细胞。? 非科班出身经验分享 1、别怕浪费。枪头什么得只要有可能污染就换,如果用酒精灯就什么都稍微烤一下,别直接放到火上,离一段距离、? 2、动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆得气泡,动作太轻就吹不下来.。、刚开始得时候吹细胞太痛苦了,稍微一下就起泡。后来就就是吹得时候枪里得培养基不要一次全都压出来,留一点,枪得最头部尽量深得在液面以下。??3。离开过操作台得东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍,包括一切实验耗材、仪器、以及您带着手套得手。??４。实验结束后对实验台得消毒、紫外什么得,用前用后都照个3０分钟、? 5。身体得各个部分尽量得少接触不需要接触得地方得地方、比如实验台,又比如培养箱内部。 ?6、细胞得密度根据细胞得性质、传代得时间以及自己得心情来定。培养基得话最多最多不要超过２天就要换一次。细胞可以不传代,但就是培养基就是一定要换得。 大概就就是,不该碰得地方不碰,有影响得地方少碰; 该使劲得时候绝对不含糊,不该使劲得地方一定忍住、如果就是比较简陋得操作台就一定要摆个酒精灯,所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果就是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物得实验,心疼钱就还就是不要做了。 最后一点点绝对非科班得经验。癌细胞真就是坚挺。有一次实在就是不想传了,放了5天吧,感觉都长了几层出来,培养基都黄了。抱着试一试得心情传了一次,又坚强得活过来了。当然,状态肯定也差得很了。? 换种心情,好好生活! 养了三年细胞,各种肿瘤细胞,说一点自己得瞧法: ?１。培养细胞前,可以瞧瞧细胞特点说明书,包括细胞正常生长得状态图、传代、培养 2. 不同细胞生长周期不同,有得生长很快,比如说MＤA-MB—2３1,传代基得类型等。?? 得时候取离心悬液得十分之一就已经足够了,有得又就是特别慢,等得人心焦,BT474就就是,传代就是一分二,复苏起始得时候两周多才能长满,所以就要在培养细胞得过程中多多摸索了。? 3、对于娇弱得细胞,就得细心呵护了,胰酶消化不能过久,吹得时候要轻柔,离心时候也要注意转速与时间,每天都要去瞧一下细胞,肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。?
细胞传代培养SOP（消化法） 具体步骤如下： 1. 传代前准备： 1.1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。 1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。 1.6 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 1.7 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 1.8 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶-EDTA消化： 2.1加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液）,注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37T < 2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞： 3.1 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.3 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞： 4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。最后要做好标记。 5. 继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分
细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应臵于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320
细胞实验的基本操作 【细胞培养】 一、细胞的复苏： 非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 具体操作如下： 1、实验前准备： 1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。 1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 2、取出冻存管及迅速解冻： 2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟； 4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；
5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。 6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括 悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培 养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避 免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。 二、细胞的传代： 培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积 累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞 的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。 1、贴壁细胞的传代 具体操作如下： 1.1、传代前准备： 1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台 1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少 污染。 1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。