通过母系血浆的高通量平行DNA基因组测序来进行胎儿染色体非整倍性的无创产前诊断
前言
染色体非整倍性是很多配偶选择做产前检查的主要原因。现在决定性诊断的方法主要靠破坏性的过程，比如绒毛膜取样和羊膜穿刺术，然而这些方法都有流产的风险。虽然胎儿的DNA可以在母亲的血浆中找到，但是作为其中非常微小的部分，总是伴随着大量母系DNA 背景。因此胎儿基因组内的非整倍性染色体数量上的不同对于母亲血浆中全部的染色体序列表达就非常的微小。即使用非常精确的单分子计数方法比如数码PCR，为了达到必要的分析精度仍必须分析大量的DNA分子，即需要大量的母系血浆。这样我们就证明了使用独立位点的方法比定位于某一基因位点的方法将极大的提高从相同一定容量的血浆中可供分析的非整倍性染色体目标分子的数量。因此我们为了达到产前胎儿二十一三体综合症的无创检测，应使用高通量平行基因组测序来量化母系DNA序列。我们检测了28个怀孕六个月内母亲的血浆样本并正确辨别出了其中14个二十一三体综合征胎儿和14个整倍性胎儿，高通量平行血浆DNA测序展示了一个为所有孕妇进行无创产前胎儿染色体非整倍性诊断的新途径。
正文
检测胎儿非整倍性是许多孕期妇女做产前诊断的主要原因。传统的产前检测方法包括绒毛膜取样和羊膜穿刺术，这些具有破坏性的取样方法有可能导致流产，因此许多人都在研究无创取样方法，其中超
声波扫描和母亲血清的生物化学标记被证明是有效的筛选方法，然而他们发现的是负现象而不是染色体异常的病理学特征。这些方法也存在很大的局限性，比如妊娠期适用性和同时需要联合多个标记，甚至需要通过不同的时间节点来达到一个临床上有用的灵敏度和特异性。为了从母亲血样中直接检测胎儿的染色体和基因组异常，早期的工作聚焦于如何将稀少的胎儿有核细胞从母亲血浆中分离出来。1997年发现的母亲血浆中无细胞胎儿核酸开创了新的可能，然而胎儿DNA 仅仅占母亲血浆DNA的很小部分。绝大多数都是孕妇自己的DNA，这点造成了巨大的挑战。最近，生物学家发明了大量的方法。一个策略以母亲血浆中胎儿特异性的核酸作为目标，比如说胎盘的mRNA 和DNA分子创造了一个胎盘特异性DNA甲基化信号。胎儿的染色体剂量然后用目标分子中SNPs的等位基因比率分析来评估，这种策略叫做RNA-SNP等位基因比率法和表观遗传等位基因比率法。这种基于等位基因比率的方法只能用在被分析的SNPs位点上是杂合的胎儿中，所以为了提高这种方法的覆盖率需要多样的标记。
为了创造一种从母系血浆中检测胎儿染色体非整倍性的单独多态性的方法，我们团队最近提出了使用数码PCR来进行相关染色体剂量（RCD）测量的原则。数码RCD是用来数母系血浆中可能的非整倍性染色体的一个特殊位点的总数量，比如说二十一三体综合症中的二十号染色体，并且将其与参考染色体比较。因此我们检测到由三条二十一号染色体带来的基因位点与对照基因的微小增加时，我们就可以诊断出二十一三体综合症，二十一号染色体序列成比例的增加预
期就很小，因为胎儿DNA在母亲血浆DNA中仅占很小一部分。为了可信的检测出这个微小的增加，需要高精度地分析和计数大量确定数量的二十一号染色体和由数码PCR试验定位的位点的对照染色体序列。因此当部分富集的循环胎儿DNA非常低，比如说在早期怀孕时，就需要大量的母亲血浆。另一种方法是进行多个遗传位点的多样化分析，然而多路复用的数码PCR法的优化十分具有挑战性。如果使用荧光标记，我们就能很快地分辨出不同位点的各种标记。
为了克服以上的限制，我们打算用一种独立于任何特定基因位点的方法来计量母系血浆中二十一号染色体序列的数量。当使用独立位点的方法时，非整倍性染色体的每一个DNA片段都会对这条染色体的数量的计量产生影响。因此对任何固定容量的母系血浆中可计量的序列都比特定位点基因试验中作为模版的DNA分子多，所以过量或较低的非整倍性染色体的表达更容易被精确地检测出。我们之前提议高通量平行基因测序（MPGS）平台会是无创产前胎儿染色体非整倍性诊断DNA序列的一种方法。在这份研究中我们证明＂Solexa＂测序技术（Illumina）可以实现这个目标。
结果
过程框架。母系血浆中的无创胎儿染色体非整倍性检测使用MPGS的过程框架按图示表达在图一中，在这份研究中我们使用了Solexa的合成测序方法。因为母系血浆中地DNA分子在自然条件下就已经变成碎片了，所以我们无需再将其碎片化。每个血浆DNA碎片的一个同源衍生拷贝的末端都进行了测序且用Illumina Genome
Analyzer标准前测序生物信息学分析方法进行处理，后者使用了高效、大范围核苷酸数据库软件分析（ELAND）。这个测试的目的在于简单辨别测序血浆DNA碎片的染色体来源，但我们并不需要知道他们基因特异性位点的相关细节。每一个人类染色体上任何特定染色体的序列数量之后会被计数和制表。在这份研究中我们只数了没有错误配对并且只能和对照人类基因组作一个位点映射的序列，比如说那些在人类基因组中视为特殊的那些序列。我们根据ELAND序列测试软件（Illumina）的输出数据把这些序列称作U0-1-0-0。
然后我们用某一染色体的U0-1-0-0数除以所有样本中的U0-1-0-0总数，通过该比例得出的值叫做%chrN。为了确定我们测试的母系血浆样本属于二十一三体综合症，我们需要计算一个叫做Z-score的值，这个Z-score是根据参照组数据平均值的标准偏差得出的。因此对于二十一三体综合症胎儿来说，我们就会看到其Z-score 要高于整倍体胎儿。
为了使无创产前胎儿非整倍性体染色体检测的过程高效，必须符合几个假设。首先，MPGS需要足够灵敏来捕捉和产生在母系DNA 的背景下所有胎儿DNA的小片段的序列读数。其次，捕捉来做测序的血浆DNA碎片必须是在母系血浆中有类似染色体间的分布的具有代表性的样本。再次，对每条染色体上DNA测序的能力不应有巨大偏见。当这些假设成立时，%chrN就能反映出母系血浆中母亲和胎儿的基因表达。更甚的是，如果在母系血浆中，母亲和胎儿的基因是平等表达的，每条染色体上成比例的血浆DNA序列的贡献会产生人
类基因组里每条染色体相对大小的关联。如果%chrN值可以通过测序和点一个够大的血浆DNA库来使其变得足够精确，我们假设可以辨别出大量映射到非整倍体染色体序列表达上的不同。我们准备分别测试这些假设。
在母系血浆中检测胎儿DNA。
如果MPGS可以可以给母系血浆中胎儿DNA测序，那么我们就应该可以检测出血浆中有y染色体的DNA，如果孕妇怀的是男性胚胎，从四个怀着整倍体胎儿的孕妇获得的血浆样本（三男一女）用Illumina的beta hIP-Seq-protocol进行处理，这个功能包括副本文件中所描述的化学凝胶电泳尺寸分流法步骤之前或之后的适配器绑定的DNA片段的放大。
这四个样本的临床信息和测序的数据详见S1表格。从每个样本获得的总的序列数约为9*10^6。每例中总的U0-1-0-0计数范围为1.8*10^6〜2.0*10^6。映射到每个染色体的U0-1-0-0计数的比例见图S1。对于这三个怀男性胎儿的孕妇，比如3009、3034和3143完全的和部分的映射到y染色体的计数分别为636（0.032%）、858（0.048%）和1054（0.056%）。然而没想到177（0.009%）的序列同样映射到了y染色体，包括一个女性胎儿。对sry基因的实时PCR对着之后的血浆样本产生了否定的结果。我们然后考虑凝胶电泳时可能有男性序列污染的出现。
血浆DNA的测序方案。
我们创造了一个新的方案来为MPGS准备血浆DNA样本，不需
要凝胶电泳和二次放大步骤，这个新的和原来的方案作了对比，并且分别表示为方案A和方案B。为了将低DNA通量在测序结果中造成的偏差降到最低，三个血浆样本每个都抽取了100ng的DNA。每个血浆样本的一半（50ng）都用两个方案作了处理，并且进行了同样的测序。被测试的血浆样本包括一个怀着女性胚胎的孕妇，一个怀着男性胚胎的孕妇,和一个两个男性个体的血浆混合体。最后一个样本需要做混合那样才能获取100ng的DNA。这三个样本分别叫作样本1、2、3。
每个样本和每个方案的临床细节和测序结果显示在表格S2中。总体的U0-1-0-0结果分布在2.0*10^6〜2.2*10^6。全部和部分的使用新方案的样本1、2、3的映射到y染色体的U0-1-0-0结果是184（0.009%）,1444（0.066%）和3523（0.175%）。相应的，原来的方案的数值为218（0.011%），1615（0.077%）和3468（0.169%）。因此污染主要是由凝胶净化产生，而二次放大步骤得不到证实。我们接下来探索了是否存在一个生物信息学的解释，我们使用Basic Local Alignment Search T ool（BLAST），来分析这三个样本的每一个样本和每一种方案的映射到y染色体的每一个U0-1-0-0序列。我们用BLAST评估了只能匹配到y染色体的DNA序列的所占比例。通过BLAST得出的特异性匹配到y染色体的序列的比例，分别用新的和旧的方案进行了对比（表格S3）。怀着女性胎儿的孕妇的血浆样本，只有30%的通过ELAND映射到y染色体的序列被BLAST确证只映射到y染色体。这和样本2、3形成了鲜明的对比,他们有超过
90%被ELAND映射到y染色体的序列可以被BLAST确证。尽管如此，怀有男性胎儿孕妇的血浆样本中检测出的y染色体序列可以证明母系血浆中的胎儿DNA可以用MPGS进行测序。为了确认ELAND 软件得出的U0-1-0-0序列有着比较小的映射错误，我们进行了一个涵盖三个血浆DNA样本的在每一个染色体上的利用新方案进行的基于120个随机选择的U0-1-0-0序列的BLAST分析，正如表格S4所示。在选取的测试的序列中大于99%的利用ELAND来映射到常染色体的U0-1-0-0序列被BLAST确认只匹配到相应的染色体。样本一中所有的120个ELAND映射的x染色体序列都被BLAST确认了，它仅包含女性DNA。样本二和三中超过97%ELAND映射的x染色体序列被B LAST所确认，它们包含男性DNA。这些数据表明ELAND 所映射的U0-1-0-0序列除去y染色体外还是基本上非常准确的。
母系血浆DNA序列在人类染色体中的分布。
样本一、二、三分别计算了每一个染色体的U0-1-0-0数量占所有序列的U0-1-0-0的比例的贡献。为了调查是否母系血浆DNA序列在人类基因组重平均分布，我们比较了血浆DNA数据和每条染色体的期望的基因贡献。我们主要的目的是分析占支配地位的DNA背景为女性的母系血浆DNA。因此我们计算了一下基因的相对表达，比如说每条染色体的大小，基于一位女性参考者的单倍体人类基因组的每条染色体的核苷酸构成，每条染色体的相对大小和测序的血浆DNA样本的U0-1-0-0序列的染色体贡献的比例被绘在一起。正如图表2中所示，使用新方案进行的血浆DNA的标本，比如说样本1A、
2A和3A，和每个人类染色体预想中的基因表达比相关的用原来方案进行的标本，比如说样本1B、2B和3B都更加相似。我们进行了线性回归分析来比较，从新旧两种方案中获得的每个染色体的百分之U0-1-0-0和在人类基因组中每个染色体的预期的基因表达。正如图表S2所示，样本1A、2A和3A中获得的斜率大于0.95，而样本1B、2B和3B分别为0.755，0.795和0.859。样本1A、2A和3A的R^2大于0.980，但是样本1B、2B和3B分别为0.803，0.840和0.910。这些数据客观上证实了只有一个PCR放大步骤的和疏忽了凝胶电泳过程的DNA处理方案会产生一个大量的序列的简况，比原来的方案更好的符合每条人类染色体的基因构成。更重要的是这些数据表明母系血浆的DNA分子的在人类基因组中的总体分布是相当平均的。母系血浆样本（1A和2A）的DNA分子的染色体分布和成年男性血浆（样本3A）是相似的。这些观察结果表明母系血浆中的母亲和胎儿的DNA序列不太可能在它们的基因分布上有显著的不同。否则如果母亲DNA和胎儿的DNA在基因分布上有着本质上的不同，我们可以预见总体的基因表达会和非怀孕的人类血浆DNA样本有差异。从母系血浆中检测出胎儿二十一三体综合症。
我们进一步测试是否胎儿的染色体非整倍性会导致非整倍性染色体的匹配序列的百分比贡献中的数量上的扰动。血浆样本采自六月之内的十四个怀着整倍体胎儿的孕妇和十四个怀着二十一三体综合症胎儿的孕妇。胎儿的染色体状态由完全的人类染色体核型分析来确认。二十八个孕妇的血浆DNA(平均怀孕周数为14.1周)用新的方案
来处理并且进行了测序，每个样本的临床细节和测序结果展示在表格S5中。二十八个样本间隔六周分两批进行处理并且流动地在四组细胞中进行测序。
每个样本产生的平均序列数为10.8*10^6。平均的U0-1-0-0数为2.5*10^6。每条染色体的U0-1-0-0序列的百分比贡献和人类基因组的每条染色体的基因表达的百分比标绘在一起，见图S3。二十一号染色体和x号染色体的数据展示在图表3A里。和二十一号染色体相匹配的U0-1-0-0序列的百分比在二十一三体综合症中比整倍体样本稍高，女性胎儿与男性胎儿相比%chrX更高而%chrY更低。
为了客观的计量二十一三体综合症胚胎的二十一号染色体序列的过量表达的程度，我们使用十个整倍体男性胚胎的数据作为一个参考群体来数每条染色体的%U0-1-0-0平均值和SD值。参考群体被限制为整倍体男性胚胎，这样的话%chrX在女性胚胎中将会观察到一个预期的增长。使用这些参考值，我们数了这二十八个样本除了Y 染色体外的每一条染色体的z值，结果显示在图表S4中。二十一号染色体和X染色体的z值展示在图表3B中。所有的二十一三体综合症的样本在二十一号染色体上都有一个大于3的z值（在5.03-25.11之间），比如与建立在整倍体男性胚胎参考组相比其标准偏差为3。女性胚胎的样本在X染色体上有z值大于1.67。所有二十八个样本中的其他染色体z值都在+-3之间。
染色体表达的百分比的计量的重现性。
在测试的二十八个母系血浆样本中，我们预计在二十一三体综合
症和整倍体胚胎的%chr21表达上和女性及男性胚胎的%chrX表达上有差异。然而非常有趣我们观察到%chr21表达只有一个非常微笑的绝对差异，这个之后引起了巨大的z值差，但是%chrX表达上的巨大的差异随后反而引起了样本中z值上的微笑的差异（图表3）。男性和女性胚胎中的X染色体的绝对差异本来预想要比二十一三体综合症和整倍体胚胎的21号染色体的数据要大得多。因为一个女性要比男性在X染色体的剂量上要多2倍，但是二十一三体综合症比整倍性个体在21号染色体的剂量上只高了1.5倍。此外，X染色体要比21号染色体更大并且在男性胚胎中贡献了一个均值达到9.5*10^4的U0-1-0-0数值，而所有样本中21号染色体贡献的均值只有3.2*10^4。
因为z值反映了参考数据库均值的作为SDs数量表达的计量上的更多的区别，我们假定，SD在%chr21的衡量中非常小，但是在%chrX的衡量中非常大。既然数据库的SD事实上反映了其计量方法的精确性，我们使用了十个整倍性男性胚胎的数据来数，每个染色体的表达的计量百分比的变化系数（CV=SD*100%/平均值）。正如表格S6所示，二十一号染色体在所有的染色体里CV第三低（0.54），%chrX的CV=3.1%。因为X染色体的U0-1-0-0序列的绝对计量数比二十一号染色体高三倍，序列的数量不能够解释精度上的变化。我们因此探索了%U0-1-0-0计数的CV值和每条染色体的GC容量之间的关系（图表S5）。人类染色体可以根据GC容量的不同水平被分成五组。组一染色体水平最低，组五染色体水平最高。
非常有趣地，五组染色体的CVs统计学差异显著（P<0.001，ANOVA）。BonferroniT测试确定了第五组的CV值统计学上比其他四组更高（P<0.05）。第四组和第一组的CV值统计学上比第二组和第三组更高（P<0.05）。
讨论
我们已经证明了MPGS可被用来作为无创产前诊断的一种诊断工具。我们也展示了二十一三体综合症胎儿与整倍体胎儿的母系血浆中的二十一号染色体DNA序列的数量上的差异可以被清楚地检测出来。男性胚胎和女性胚胎在母系血浆中X染色体和Y染色体两种DNA 序列数量上的差异也能够被清楚地观测到。MPGS的区分染色体上的基因分布的微小的数量上的扰动的能力在于对非常大量的分子的分析，这点能够使数量上计量的不精确性最小化。因为没有定位到某一特定的基因位点，所有的血浆DNA碎片一起提供了一个空前的每个分析样本的分子的数量。
这种方法和现今的方法有显著的不同，现今的方法一般来说都是只计量能作为位点特异性PCR测试模版的DNA分子，比如说Y染色体上的SRY。基因位点特异性的DNA模板只代表了母系血浆中一个极小部分的DNA碎片。事实上，MPGS是血浆DNA分子的相对基因表达的计量的如此强大的工具，只有人类基因组中数量和代表性碎片一致的那一部分需要测序。比如说每个血浆样本产生约一千万个36核苷酸的读取框，这只相当于人类基因组的十分之一。此外，在这份研究中只有占每个血浆DNA样本测序阅读框20%的U0-1-0-0
序列，被用来产生关于染色体分布情况的定量信息。因此，这和之前描述的一些为定量核苷酸信息并且依靠高覆盖的测序技术的依赖测序的方法相当不同，比如说决定在转入组分析中RNA种类的相对丰度。相反，我们现在的方法只简单的测序了人类基因组的随机的代表性的片段，大部分DNA片段最多只测序了一次。相关的染色体大小随后靠数染色体匹配的序列的相对数量来推导出。所数出的每一个DNA片段的核苷酸序列都是不同的。事实上，每次我们得到的一个样本的DNA序列池都不同。
尽管测序存在随机性，但是%chr21序列的定量估计如此的精确和坚定，二十一三体综合症孕妇的二十一号染色体的z值和对照组的整倍体样本的平均值有显著差异。在这份研究中二十一三体综合症孕妇的怀孕时间（14.1周）和整倍体组的平均值（15.4周）有的比。所有整倍体组的样本都是在任何目前怀孕过程中的侵入性过程之前收集的。十一个二十一三体综合症孕妇的血样是在侵入性的产前诊断过程造成的妊娠终止前马上采集的，平均天数是六天（范围在2至22天）。我们目前的研究表明在羊膜穿刺几天后采集的样本的胎儿DNA中没有任何实质的区别。尽管如此，从三个二十一三体综合症孕妇所采集的血样（样本17、19和25，表格S5），是在绒毛膜取样之前的三周里采集的。因为二十一号染色体带来的z值的增加已经可见（图表3B）。
理论上，任意染色体上的一定量扰动的存在的决定因素都能够更精确的达到，例如，考虑胎儿DNA的浓度能够预估染色体扰动的预
期程度。胎儿DNA的浓度通过胎儿表观遗传标记或者父系遗传的多态标记会很容易的测量出来。在我们的研究中，每个样本中的胎儿DNA浓度不需要源自决定每个样本疾病情况的临界值。首先，根据表格S6，二十一号染色体是表达百分比能被我们目前的非常低精确度的方案所计量的染色体的一个。第二，当与单核数码RCD这样的方法作比较时，这个方法需要与胎儿DNA浓度相关的疾病临界值，更多的二十一号染色体的序列是靠测序来计量的。对于数码RCD，我们报告了对于一个胎儿DNA浓度达到25%的样本来说，为了达到97%的正确的分类率我们需要做7680个数码PCRs。我们现在的数据同样显示20%的相当于1536个二十一号染色体分子，7680孔实验的分析的数码PCRs的总数量，会包括只有二十一号染色体的基因目标，因此是有益的。因此，通过测序方法分析的二十一号染色体分子的数量（平均值为3.2*10^4）是数码RCD方法的20倍。因此，这种测量会比现在的数码PCR分析的范围明显更精确。然而考虑到胎儿DNA的浓度，对一些其他染色体或其他批次的的染色体表达的百分比的计量可以做得更精确并因此能够使错误的诊断最小化。
事实上，决定母系血浆DNA的基因表达的MPGS的准确度和精确度都能够通过一系列的交测序分析策略得到改善。例如，出现在已知拷贝多态性区域的序列可以被调整使整倍性怀孕参考范围更紧密。比如说，在某些情况下与参考基因有1-2处错误配对的序列而不是U0-1-0-0，可能就会在测试样本和参照的人类基因组中表现出多态的不同，也可能被用来提高可用测序的数量。我们同时也展现了血浆
DNA序列的贡献比率的测量的再现性在染色体中和染色体GC容量的不同可以部分解释这种多样性。因此，每一个样本需要做的测序的数量可以改变，来确保每一个其他染色体的定量扰动的发现的计量可以被是做的足够准确。事实上，我们预测，如果计算充足的血浆DNA 片段，MPGS就能够精确的检测出包含在小于全染色体的区域的数量上的失常。
我们找到一个当与其他染色体作比较时，Y染色体的ELAND匹配的精确性的不符之处。这有可能归因于已知的许多Y染色体中重复序列的存在。即便反复掩盖，许多留下的Y染色体序列依旧暴露在低拷贝数重复序列之下，后者提高了精确匹配如是序列的困难。尽管如此，对于怀着女婴的孕妇来说，仍然可以发现一小部分匹配到Y 染色体。对于男性DNA来说这些血浆样本是阴性的这点我们已经通过业界广泛使用的SRY实时PCR实验论证了。MPGS方法比实时PCR方法更灵敏。技术上看，这意味着当在一个已经为这种不灵敏的实时PCR系统最优化的实验环境下极低水平的传递污染将会无法避免。非此即彼，由ELAND和BLAST做出来的那些只与Y染色体配对的序列可能事实上是与人类基因组中的一些空白区域相匹配，这些区域的序列还未被覆盖。但是，很明显我们可以通过母系血浆中%chrY计数来清楚地分辨男性和女性胚胎（图表S3F）。
我们已通过现有的MPGS平台证明了血浆DNA测序方法的原则。相同的方法也可以应用于其他平台（16，27）。这里描述这个方法主要的局限就是所用花费相当高。单独的测序试剂每个样本是700美
元。主要的高花费是在建立一个每个仪器一周测试16个样本生产量的Il
luminaSolexa平台的基础建设。然而，在接下来的几年中这种技术的花费将快速降低，使我们能承受。在过渡期，我们只能通过把病人的样本条码化来降低成本，这样一次测序就能为不同的情况都产生诊断信息。可选择地，在对那些染色体来源的DNA片段的随机测序之前测序可以通过阵列捕捉只针对我们感兴趣的染色体。事实上，其他单分子分析的基于非测序的方法或许更适合我们的情况，并且可能杯被证明更加划算。为了包括无创产前诊断项目的花费，我们也可以把测序方法和例如RNA-SNP等位基因比例方法相结合，那样的话非杂合的，因此对RNA-SNP方法不显著的胎儿就可以被更昂贵的MPGs方法所分析。
最后，本研究中的所报道的数据还需要更大范围的临床实验来证明。最后我们希望这种无创产前诊断能够让未来的产检对孕妇和胎儿来说更安全。在这份工作中，我们证明MPGS可以以一种诊断手段来做定量的基因测序。我们希望本篇文章中所描写高通量平行血浆DNA测序策略也能够用来分析一些各种各样与血浆中核苷酸失常有关的病理学情况如癌症。
尽管这篇文章还在审核中，Fan也已经报道了Solexa测序技术在胎儿染色体非整倍性诊断中的应用。这些作者分析了18个母系血浆样本，其中17个是在孕妇进行羊膜穿刺或绒毛膜取样术的15-30钟后取样的，其实，二十一三体综合症组的平均胎龄（18周）实际
上要比整倍体组的胎龄（12周）要大。由于释放进入母亲循环系统中的胎儿DNA在侵害性步骤中和怀孕过程中会显著增加，所以说，也需要考虑这些因素的混杂效应。尽管如此，Fan的文章和我们的研究都证明了MPGS能够用于无创产前诊断。
为规范高通量基因测序产前筛查与诊断技术临床应用工作，制定本规范。该规范主要包括高通量基因测序产前筛查与诊断的适用范围、临床服务流程和质量控制等内容。 第一部分适用范围 一、适用目标疾病 根据目前技术发展水平，高通量基因测序技术在产前筛查与诊断领域适用的目标疾病为常见胎儿染色体非整倍体异常（即 21 三体综合征、18 三体综合征、 13 三体综合征）。 二、适用时间 高通量基因测序产前筛查与诊断时间应当为12+0-26+6周，最佳检测时间应当为12+0-26+6周。 三、适用人群 （一）血清学筛查、影像学检查显示为常见染色体非整倍体临界风险（即 1/1000≤唐氏综合征风险值<1/270，1/1000≤18 三体综合征风险值<1/350）的孕妇。 （二）有介入性产前诊断禁忌证者（先兆流产、发热、有出血倾向、感染未愈等）。 （三）就诊时，患者为孕 20+6周以上，错过血清学筛查最佳时间，或错过常规产前诊断时机，但要求降低 21 三体综合征、18 三体综合征、13 三体综合征风险的孕妇。 四、慎用人群 有以下几种情形的孕妇属于慎用人群，即在该人群中本检测的筛查效果较适用人群有一定程度下降，即筛查的检出率下降，假阳性及假阴性率上升，或已符合介入性产前诊断的指征，知情后拒绝直接选择介入性产前诊断的孕妇。包括：（一）产前筛查高风险，预产期年龄≥35 岁的高龄孕妇，以及有其他直接产前诊断指征的孕妇。
（二）孕周<12 周的孕妇。 （三）高体重（体重>100 千克）孕妇。 （四）通过体外受精-胚胎移植（以下简称 IVF-ET）方式受孕的孕妇。 （五）双胎妊娠的孕妇。 （六）合并恶性肿瘤的孕妇。 五、不适用人群 （一）染色体异常胎儿分娩史，夫妇一方有明确染色体异常的孕妇。 （二）孕妇 1 年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗等对高通量基因测序产前筛查与诊断结果将造成干扰的。 （三）胎儿影像学检查怀疑胎儿有微缺失微重复综合征或其他染色体异常可能的。 （四）各种基因病的高风险人群。 六、其他 （一）对未接受中孕期血清学筛查而直接进行高通量基因测序产前筛查与诊断的孕妇，应当在孕 15 周至 20+6周期间进行胎儿神经管缺陷风险评估。 （二）严禁高通量基因测序产前筛查与诊断用于非医学需要的胎儿性别鉴定。 第二部分临床服务流程 一、临床技术程序 （一）凡符合适用人群标准并自愿进行此项检测的孕妇，或符合慎用人群标准但强烈要求进行此项检测的孕妇，医师应当对孕妇本人及其家属详细告知该检测的目标病种、目的、意义、准确率、风险和局限性，以及检测的种类、费用和技术流程。
无创产前基因检测知情同意书 无创产前基因检测是通过采集孕妇外周血(5ml)，提取游离DNA，采用新一代高通量测 序技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍性疾病（21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体）的风险率，准确率为99%以上；具有无创取样、无流产风险、高灵敏度，准确性高的特点。该方法最佳检测时间为孕早、中期，且不需要实施穿刺手术，避免了孕妇 疼痛、出血及胎儿流产、感染等风险，是非常安全的检测方法。 无创产前基因检测是一项安全性高的早中孕期无创性非介入性的产前筛查技术，进行该检测你需要知情以下内容： 1、无创产前检测抽血与常规静脉采血方法相同，采集5mL静脉血用于检测；采血不需要空腹，只要正常饮食、作息即可。 2、该方法检测时间为孕12周（超声推算或确认）之后，最佳检测孕周为12~24周。 3、无创产前检测可在孕12周开始进行，但鉴于当前医学检测技术水平的限制和孕妇个体差 异等原因，即使在检测人员已经履行了工作职责和操作规程的前提下，仍有可能会出现假阳 性或假阴性；如果孕妇孕周推测不准，或孕周过小（实际孕周<12周），可能影响检测结果 的准确性。 4、无创产前检测仅针对21三体综合征(唐氏综合征)、18三体综合征(爱德华氏综合征)、13三体综合征(帕陶氏综合征)三大染色体疾病。 5、无创产前检测不适于检测：胎儿染色体中的嵌合体型、易位型、微缺失、微重复等结构 性异常；怀有多胞胎的孕妇；孕妇本人为染色体非整倍体疾病患者；孕妇接受过移植手术、 干细胞治疗；孕妇在4周之内接受过免疫治疗；孕妇在一年之内输注过异体血制品等。 6、由于孕妇个体化差异导致的血浆中胎儿DNA浓度过低，可能需要重新抽血取样；若不 重新抽血取样则不能获得退费。 7、本检测结果仅供参考，不作为最终确诊结果。如检测结果为高风险，需进行产前诊断及 遗传咨询；如胎儿患疾病的风险为低风险，建议继续进行常规产检；相关解释需咨询临床医生。 孕妇方已知晓上述所有内容，已充分了解该检查的准确性和局限性，对其中的疑问已 得到医生的解答，经本人慎重考虑愿意进行该项检测，并承担因检测带来的相关风险。孕妇方承诺提供的个人资料真实可靠；同意在去掉所有个人信息后，检测数据可供研究参考并同 意将该检测样本用于非赢利性的科学研究。为确认上述内容为双方意思的真实表达，医方已履行了告知义务，孕妇方已享有充分知情和选择的权利，签字生效。 孕妇同意（签字）医生（签字） 身份证号日期年月日日期年月日
呼伦贝尔市人民医院 高通量基因测序产前筛查（NIPT-plus）知情同意书 版本号：PBR6.1 一、检测需知： 【样本类型】孕妇外周血 【筛查方法】母体外周血胎儿游离DNA高通量测序分析 【筛查项目】 本检测为筛查项目，如筛查结果为阴性，只表明胎儿发生该种异常的机会很低，并不能完全排除这种异常和其他异常的可能性；筛查结果若为阳性，则需要咨询医生进一步检查，以明确诊断。 1. 本检测能检测出99%的21-三体综合症(唐氏综合征)的胎儿，18-三体综合症(爱德华氏综合征)的胎儿和13-三体综合症(帕陶氏 综合征)的胎儿。 2. 本检测能检测出99%的胎儿性染色体非整倍体疾病，包括45,X、47,XXY、47,XXX及47,XYY。 3. 本检测可以检出7种相对高发的大于4Mb大小并位于特定的症候群相关染色体片段位置的微缺失疾病，包括1p36 deletion syndrome、2q33.1 deletion syndrome、22q11 deletion syndrome、Angelman syndrome、Cri-Du-Chat syndrome、Langer-Giedion syndrome 和 Prader–Willi syndrome。 【局限性和风险】 1. 本检测无法检出由以下因素引起的疾病：染色体异倍体（含单倍体、三倍体、四倍体等）；染色体平衡易位、倒位、环状；单 亲二倍体（UPD）；单基因病、线粒体病、多基因病；感染、药物、辐射等环境诱因导致的出生缺陷。 2. 在以下少数情况下，本检测结果可能受影响 1) 胎儿患有嵌合型染色体疾病。 2) 胎儿患有除本检测范围之外的其他染色体异常。 3) 双胎及多胎。 4) 孕妇一年之内接受过异体输血，四周之内接受过引入外源DNA的免疫治疗、移植手术、干细胞治疗等。 5) 孕妇本人为染色体疾病患者或携带者（携带者在我国的发病率为0.47%，即106对夫妻中就有一方为携带者）。 6) 孕妇本人为孕期肿瘤患者。 7) 孕周计算不准（实际孕周小于12周）、抽血时孕妇体重超过100公斤、其他特殊情况个体差异，胎儿游离DNA含量过低。 8) 胎盘嵌合体可能造成假阳性或假阴性结果。 3. 因本检查为全染色体组范围检测，受检者可能会了解到关于其本人、胎儿及其家庭与本次妊娠无关的遗传信息。 4. 理论上，本检测适用于孕12周以上的所有单胎孕妇，但鉴于个别孕妇因特殊原因需要重新采集标本，检测报告需向后顺延等 情况。因此，孕周达26周及以上的孕妇，可能出现：在得到检测报告之前分娩，或得到阳性检测结果需进一步产前诊断确诊，导致引产困难。 5. 在极少数情况下可能因样本自然溶血或血浆中胎儿游离DNA含量过低等原因导致无法进行检测。如果样品出现质量问题，有 如下解决方案： 1) 经受检者同意，重新取样进行检测。受检者无需承担重新取样费用，报告出具时间顺延。 2) 如受检者放弃本次检测，检测方将在扣除样品质检费（200元人民币）以后，将剩余检测费用退还受检者。 6. 检测结果可能包含未知的染色体改变。此时，需采集胎儿的父母的外周血做检测，以便确认这种改变的来源。 1) 如果此种未知染色体改变为“继承性”的（遗传自表型正常的父亲或母亲），那么此种改变极有可能为“良性”，但仍不能排 除胎儿患病的可能。 2) 如果此种未知染色体改变为“非继承性”的（原因不明），且缺乏相关的医学信息，将无法判断此种状况的致病性。 二、其它约定： 1. 本检测结果将以书面报告的形式告知受检者。涉及伦理问题的，应交伦理委员会讨论。 2. 本检测结果仅供参考，不能作为最终临床诊断依据，请接到报告后，向医师进行专业的遗传咨询。
附件 胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册技术 审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体 （T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是针对该类试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下 制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展， —1—
本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 胎儿染色体非整倍体（Fetal Chromosome Aneuploidies）中的21三体、18三体、13三体（Trisomies 21、Trisomies 18、Trisomies13，即T21、T18、T13）是临床上最常见的染色体非整倍体疾病。其对应的分别为21-三体综合征（又称唐氏综合征，先天愚型或Down综合征）、18-三体综合征（又称Edwards综合征）和13-三体综合征（又称Patau综合征），发病率分别约为1/700、1/6000、1/10000，患儿绝大多数存在严重智力障碍及器官畸形。 产前筛查和产前诊断是为避免产生遗传缺陷患儿提供的手段。常规的产前筛查方法包括：早孕期的超声与血清学联合筛查和中孕期母体血清学筛查。筛查结果为高风险的孕妇经建议经产前诊断进行最终确认，由孕妇知情选择。胎儿染色体异常的产前诊断金标准为介入前产前诊断手术,是指通过绒毛取材术/羊膜腔穿刺术/经皮脐血管穿刺术，取相应细胞采用细胞生物学方法对胎儿染色体进行核型分析。 高通量测序方法检测胎儿染色体非整倍体的原理是：孕妇母体血浆中存在胎儿游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），长度约为75bp—250bp，几乎全部来源于胎盘的滋养层细胞，其浓度和孕周密切相关并以一定比例（5%—30%）稳定存在于母体外周血浆中。高通量测序方法通过取母体血浆提取包含正常母体和胎 —2—
无创DNA产前检测技术 无创DNA产前检测，又称为无创产前DNA检测、无创胎儿染色体非整倍体检测等。根据国际权威学术组织美国妇产科医师学院委员会，无创产前DNA检测（Non-invasive Prenatal Testing）是应用最广泛的技术名称。无创DNA产前检测技术仅需采取孕妇静脉血，利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA 片段（包含胎儿游离DNA）进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，可以从中得到胎儿的遗传信息，从而检测胎儿是否患三大染色体疾病。 一、理论依据 母体血浆中含有胎儿游离DNA，为该项目提供现实依据。胎儿染色体异常会带来母体中DNA含量微量变化，通过深度测序及生物信息可分析检测到该变化，为项目提供理论依据。新一代高通量测序、信息分析平台为深度挖掘母体血浆中胎儿游离DNA信息提供技术依据。 二、研究进展 作为一种对胎儿染色体非整倍体筛查手段，无创产前DNA测试，使用来自于孕妇血浆的无细胞胎儿DNA进行检测。这些DNA 学术上也被称为循环游离胎儿DNA，浓度约3-13%，被认为主要来自胎盘，并在分娩后数小时内从母体血液中清除。无创产前DNA 分析已在临床上用于胎儿非整倍体风险检测。
1969年首次报道发现母体外周血中存在胎儿细胞，经过几十年研究发现其含量极低且存在时间较长，这些特点使其在产前诊断领域的应用受到较大的限制。 1997年香港中文大学卢煜明 (Dennis Lo) 教授发现母体外周血浆中存在游离胎儿DNA ，随孕周增加稳定存在，且随孕妇分娩快速消失，可以作为非创伤性产前诊断的理想材料。 母体外周血浆中胎儿游离DNA含量大概占全部游离DNA的3-13%，也有不同研究认为其含量稍高。由于大量来源于母体背景的游离DNA影响，需要选择超级灵敏的新一代分子生物学技术才可以在大数据量水平上对胎儿游离DNA的碱基序列做出准确判断。早期的研究中，无创产前DNA分析对三体胎儿检测需要多个胎盘DNA或RNA标记，这使得试验非常耗时和昂贵[2]。经过改进和优化的技术称为大规模并行基因组测序技术，它使用一个高度敏感的检测方法，可以量化千万数量的DNA片段，与早期的技术相比，其可以准确地检测出13三体、18三体和21三体综合征。 2007年，周代星博士，香港中文大学Dennis Lo教授，以及现任美国约翰霍普金斯教授的高远博士，开始合作研究非侵入性的产前遗传学检测技术，首先于21号染色体三体综合征（即唐氏综合征）取得突破。
非整倍体染色体异常的筛查方法 非整倍体染色体异常是指个体染色体数目的异常，通常由于发生了染色体缺失、增加或重排等突变导致。这种异常在人类中较为常见，可以引起多种遗传病和发育异常。因此，对非整倍体染色体异常的筛查非常重要，可提供早期诊断和干预的机会，有助于改善患者的生活质量。 一、无创产前筛查 无创产前筛查是一种非侵入性的筛查方法，通过检测孕妇的血液样本来评估胎儿是否存在非整倍体染色体异常。这种方法无需取胎儿组织或羊水样本，相对安全且无痛苦，广泛应用于产前筛查中。无创产前筛查主要通过检测胎儿游离DNA中的染色体异常标志物来进行，如胎儿染色体三体综合征（Down综合征）常见的三体综合征标志物为孕妇血浆中游离DNA中的胎儿染色体21号染色体的片段。 二、羊水穿刺 羊水穿刺是一种有创的筛查方法，通过将细针插入孕妇腹部、子宫和羊水囊，取得羊水样本进行检测。该方法可以提供准确的染色体分析结果，能够明确诊断是否存在非整倍体染色体异常。然而，由于该方法有一定的风险，如感染、流产等，一般只在无创产前筛查结果阳性或高风险的情况下才会选择进行。 三、绒毛活检
绒毛活检是一种有创的筛查方法，通过取得胎儿绒毛组织样本进行检测。该方法可以提供准确的染色体分析结果，并且可以早期进行，通常在怀孕8-12周进行。绒毛活检的风险相对较低，但仍存在一定的流产风险，因此一般只在无创产前筛查结果阳性或高风险的情况下才会选择进行。 四、胎盘活检 胎盘活检是一种有创的筛查方法，通过取得胎盘组织样本进行检测。该方法可以提供准确的染色体分析结果，并且可以早期进行，通常在怀孕10-12周进行。胎盘活检的风险较低，但仍存在一定的流产风险，因此一般只在无创产前筛查结果阳性或高风险的情况下才会选择进行。 五、胎儿超声检查 胎儿超声检查是一种无创的筛查方法，通过超声波检查胎儿的形态和结构来评估是否存在非整倍体染色体异常。该方法可以观察胎儿的脊柱、四肢、头部等部位，判断是否存在明显的异常。然而，胎儿超声检查并不能提供准确的染色体分析结果，只能作为筛查方法的辅助手段。 非整倍体染色体异常的筛查方法多种多样，可以根据具体情况选择合适的筛查方法进行。无创产前筛查是最常用的方法，安全、无痛苦且准确性较高，适用于大多数孕妇。而有创的筛查方法，如羊水穿刺、绒毛活检和胎盘活检，可以提供更准确的结果，但风险相对
妊娠早期胎儿染色体非整倍体的无创产前检测主要内容 摘要： 关键词：妊娠早期胎儿染色体非整倍体胎儿DNA片段孕妇体重早孕期无创产前检测 目的：检测212名8–12孕周孕妇血浆样本用以评价无创产前检测(NIPT)在早孕期检测的可行性。 方法：参与本研究的高危孕妇来自同一家医院，运用大规模平行测序检测母体血浆DNA，确定胎儿是否存在21号、18号、13号、X和Y染色体的非整倍体。所有孕妇均需经绒毛膜取样或羊水穿刺，并通过核型分析确认其NIPT结果。跟踪所有NIPT阴性孕妇至分娩，新生儿随访对可能出现的染色体疾病进行临床评估。 结果：NIPT检测出了包括T21（n=2）、T18（n=1）、T13（n=1）在内的常染色体非整倍体，并经核型分析验证。存在一例45，X假阳性和两例47，XXY和45X[16]/47，XXX[14]假阴性。平均血浆DNA含量为8.54%，胎儿游离DNA含量从8周至12周逐渐递增。绝大多数孕妇（95%）血浆中胎儿游离DNA含量超过NIPT的检测下限4%。早孕期胎儿DNA含量与孕妇体重存在轻微的负相关（R2 = 0.186）。 结论：NIPT用于8-12孕周的早孕期检测仍有很高的可靠性和准确性。 背景 无创产前检测（NIPT）运用大规模平行测序检测胎儿游离DNA，现已作为孕妇常规产前保健用于多个国家1,2。前瞻性临床研究结果显示3-5，NIPT
高度可靠，对T21、T18、T13三种常见的染色体综合征灵敏度和特异性超过99%，但是性染色体非整倍体（SCAs）的假阳性率和假阴性率却很高。双胎消失综合征（vanishing twin）、DNA含量过低或操作失误可以部分解释SCAs假阳性或假阴性1，不过胎盘嵌合6-10和母体染色体异常11才是导致NIPT结果不符的常见原因。 目前，用于NIPT的母血浆样本通常从10孕周至整个中孕期取样1。在这一妊娠期间，胎盘向母体循环释放胎儿游离DNA片段，其含量在10孕周至21孕周维持在10-20%7,12,13。同一孕周的胎儿游离DNA含量往往差异很大7,14，表明不同孕妇之间显著的生理差异。许多因素会影响胎儿游离DNA含量，其中孕周、孕妇体重和胚胎数量1,12,15影响最为显著。已报道的前瞻性临床研究3证实，NIPT在检测中孕期胎儿染色体非整倍体方面具有很高的敏感度和特异性。如果将NIPT扩展到早孕期应用，就需证实NIPT在早孕期具有同等的可靠性和精确性。本前瞻性临床研究共招募212名具有胎儿染色体非整倍体高风险孕妇，以评判NIPT在早孕期8-12孕周的检测效果。 方法 试验设计 本研究随机招募213名高龄（>35岁）单胎孕妇（图1）。实验设计经北京协和医院(PUMCH)伦理审查委员会批准，所有受试者均充分知情。采用Streck管采集8-12孕周的血液样本，每一样本配以唯一条码。孕周通过末次月经计算，并于孕7-8周时超声进一步确认。受试者和样本的详细临
无创产前基因检测知情赞同书 无创产前基因检测是经过收集孕妇外周血(5ml)，提取游离DNA，采纳新一代高通量测 序技术，结合生物信息解析，得出胎儿患染色体非整倍性疾病（21-三体又称唐氏综合征， 18-三体，13-三体）的风险率，正确率为99%以上；拥有无创取样、无流产风险、高矫捷 度， 正确性高的特色。该方法最正确检测时间为孕早、中期，且不需要实行穿刺手术，防备了 孕妇痛苦、出血及胎儿流产、感染等风险，是特别安全的检测方法。 无创产前基因检测是一项安全性高的早中孕期无创性非介入性的产前筛查技术，进行该检 测你需要知情以下内容： 1、无创产前检测抽血与老例静脉采血方法同样， 收集 5 mL 静脉血用于检测；采血不需要空腹，只要正常饮食、作息即可。 2、该方法检测时间为孕12周（超声计算或确认）以后，最正确检测孕周为12~24周。 3、无创产前检测可在孕12周开始进行，但鉴于当前医学检测技术水平的限制和孕妇个体差 异等原由，即使在检测人员已经履行了工作职责和操作规程的前提下，仍有可能会出现假阳性或假阴性；假如孕妇孕周推测禁止，或孕周过小（实质孕周<12周），可能影响检测结果的正确性。 4、无创产前检测 仅针对 21三体综合征(唐氏 综合征 ) 、18 三体 综合征 (爱德华氏 综合征 )、13 三体综合征(帕陶氏综合征)三大染色体疾病。 5、无创产前检测不适于检测：胎儿染色体中的嵌合体型、易位型、微缺失、微重复等结构 性异常；怀有多胞胎的孕妇；孕妇自己为染色体非整倍体疾病患者；孕妇接受过移植手术、干细胞治疗；孕妇在4周以内接受过免疫治疗；孕妇在一年以内输注过异体血制品等。 6、因为孕妇个体化差新奇使的血浆中胎儿DNA浓度过低，可能需要重新抽血取样；若不 重新抽血取样则不可以获取退费。 7、本检测结果仅供参照，不作为最后确诊结果。如检测结果为高风险，需进行产前诊断及 遗传咨询；如胎儿患疾病的风险为低风险，建议连续进行老例产检；相关解说需咨询临床医生。 孕妇方已认识上述全部内容，已充分认识该检查的正确性和限制性，对此中的疑问已 获取医生的解答，经自己谨慎考虑愿意进行该项检测，并担当因检测带来的相关风险。孕妇 方承诺供给的个人资料真实靠谱；赞同在去掉全部个人信息后，检测数据可供研究参照并同 意将该检测样本用于非盈利性的科学研究。为确认上述内容为两方意思的真实表达，医方已 履行了见告义务，孕妇方已享有充分知情和选择的权益，签字奏效。 孕妇赞同（签字）医生（签字） 身份证号日期年代日 日期年代日
无创产前常见问题与解答 1、介绍一下无创产前检测 核子基因无创产前基因检测是通过采集孕妇外周血(10ml)，提取游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍性疾病（21-三体又称唐氏综合征，18-三体又称爱德华综合症，13-三体又称帕陶氏综合症）的风险率。 2、无创产前检测有哪些优点 无创，安全，早期，准确，快速 孕早期，只需抽取10ml孕妇外周血就可以进行。结果准确率高达99%以上，能够极大的减轻孕妇的心理负担，不用担心穿刺等刺激带来的流产等伤害，7个工作日即可拿到检测结果。 3、无创基因检测与唐氏筛查有区别吗？ 无创基因检测在孕早期（12周）即可进行，通过对母体外周血中胎儿的遗传物质DNA进行直接测序分析，具有很高的准确性； 唐氏筛查检测的最佳时间为孕15-20周，是根据孕妇的激素水平结合年龄、孕周、体重等参数进行计算的，因影响因素较多，这些参数经常不是很准确，所以计算出的风险值也是有误差的。虽然检测的都是21，18，13号染色体是否异常，但无创基因检测的准确率较高，可以达到99%。 4、这个就是唐氏筛查里面的吗? 是两个不同的检测技术，无创产前检测准确率高，无感染和流产风险，而唐氏筛查是根据孕妇的年龄、孕周、激素水平以及体重等参数进行计算得出结果，根据科学统计，其假阳性率较高，也存在漏检的风险。 5、羊穿的准确率比你们高吧 准确率是一样的 6、我了解你们只是核查染色体的数量，没有羊穿详细 核子基因无创产前dna检测主要是针对胎儿21.18.13三对染色体数目异常进行检测，准确率达99%以上。羊穿不仅仅检测数目方面的异常，还能检测结构异常，所以无创的范围是比羊穿少一些，但是无创是没有风险的，羊穿有一定的流产风险，具体要选择做哪一项检测，是要看您自己选择的。 7、无创基因检测可以代替羊水穿刺吗？ 不能互相代替，是两种检测方法。无创产前检测只需要抽取孕妇的静脉血，对孕妇及胎儿均无伤害，孕12周即可进行检测，两周左右出检测结果，对于21，18，13号染色体的检测准确率和羊水穿刺是一样的，99%以上。 羊水穿刺需要抽取羊水，最佳检测时间为孕16到21周，对孕妇有一定的创伤，存在流产风险，也存在细胞培养失败的可能，大概要1个月出结果，目前是检测染色体异常的金标准，是诊断方法。 无创产前基因检测的准确率与羊水穿刺基本一致，都达到99%以上。 我们核子基因的项目为无创技术，对孕妇、胎儿没有伤害；羊穿是侵入性技术，存在一定造
大规模平行测序无创基因检测用于胎儿染色体非整倍体异常产 前诊断的临床价值 王海;周蕾;王克义;怀磊 【摘要】目的探讨大规模平行测序无创基因检测在胎儿染色体非整倍体异常产前诊断中的临床应用价值.方法选择预约做产前诊断的高危孕妇914例,按危险因素分为唐氏综合征筛查高危组563例,高龄妊娠组245例和其他原因组106例.抽取孕妇外周血,提取血浆DNA,制备测序文库,用高通量测序仪器检测,结果与人类的参考基因组比对;同时采集胎儿羊水,经细胞培养后行羊水细胞染色体核型分析.结果914例孕妇经大规模平行测序技术检出21-三体综合征高风险8例,18-三体综合征高风险3例,13-三体综合征高风险1例;与染色体核型分析相比,产前无创基因检测21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的阳性预测值均为100％,而假阳性率均为0.914例样本中,检出45,X高风险3例、47,XXX和47,XXY高风险各2例;与染色体核型分析相比,产前无创基因检测45,X的假阳性率为0.11％,阳性预测值为66.7％,47,XXY和47,XXX的假阳性率均为0.22％,阳性预测值均为50％.结论大规模平行测序技术对胎儿常染色体非整倍体疾病的诊断,具有极高的阳性预测值,但对胎儿性染色体非整倍体异常的阳性预测值较低;只能作为一种高级筛查性检测而不是确诊方法.%Objective To assess the clinical value of massively parallel sequencing in diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy.Methods Nine hundred and fourteen high-risk pregnant women registered in prenatal diagnostic centers of Hangzhou First People's Hospital were enrolled in the study.The plasma DNA was extracted and sequenced with high-throughput sequencing procedure.The results were compared with the human reference gene-database and statistically
无创产前基因检测胎儿染色体非整倍体的临床应用分析 【摘要】目的：探讨无创产前基因检测胎儿染色体非整倍体的临床应用分析。方法：选择2013年3月~2015年12月31日在我院遗传科进行无创产前DNA检测的孕妇3520例。应 用高通量测序的技术检测母体外周血中的胎儿游离DNA，确定胎儿患染色体非整倍体疾病的 风险值。对检测结果为阳性的孕妇再采取母体羊水或脐血进行染色体分析，对性染色体异常 的病例同时抽取孕妇外周血做染色休检查，与无创产前DNA结果进行对照。结果：无创产前基因检测共检出染色体异常胎儿69例，其中21-三体综合征23例（假阳性1例），准确率95.6%；18-三体综合征6例，准确率100%；13-三体综合征3例，准确率100%；性染色体异 常37例，确诊孕妇或胎儿性染色体异常为18例，准确率48.6%。检查结果阴性的孕妇，经 过产后随访，无漏诊率。结论：无创产前基因检测胎儿染色体非整倍体中的临床应用卓有成效，尤其是21三体、18三体、13三体，可以提高产前诊断的效率，减少严重出生缺陷患儿 的出生，是一种安全便捷的产前诊断方式，应该在临床上进行推广。 【关键词】无创产前基因检测；胎儿染色体非整倍体；临床应用 染色体数目的增加或减少不是单倍体的整数倍，即染色体非整倍体。在临床实践中常见 的非整倍体有21-三体综合征、18三体综合征和13-三体综合征[1]。随着医疗技术的不断进步，一些染色体患儿的存活率增加，但是其生活质量非常低，在目前的医疗的水平下不能有 效治疗，只能通过产前检查预防患儿出生。无创产前基因检测胎儿染色体非整倍体是目前一 种简便且安全的检测方式[2]。本次选取13年3月~2015年12月31日在我院产科进行诊断 的孕妇共3520例。 1.材料与方法 1.1研究资料 选择2013年3月~2015年12月31日在我院产科进行无创产前DNA检测的孕妇，共检 测3520例。其中3258例是产前筛查高风险（含高龄孕妇）、临界风险或单项指标异常； 262例是B超指标异常；其他因素占158例。 1.2研究方法 在通知孕妇知情并取得同意后，抽取孕妇外周静脉血5ml，采取EDTA抗凝采血管，采 集后将采血管轻微颠倒八次，并放入4℃冰箱中存放。按照全血样本编号，写上对应血浆编 号与分离的日期。在4℃离心机内以1600g离心10min，将上清液分装入两个已编号2.0ml的离心管，每个转入600μl血浆，在离心管上贴上对应条码，并密封。血浆分离后立即低温保存，一周内在20℃下暂存，长期保存需﹣80℃。构建DNA文库，采取最新的测序技术，通 过统计每条染色体上序列条数的分布，计算染色体在其中所占的比率，并分析外周血中不同 染色体差异，最终得出胎儿染色体非整倍体疾病的风险概率。对于检测结果中高风险的孕妇，应该进行遗传咨询，进行羊水、脐血穿刺，经过细胞培养后，确定胎儿染色体核型。检测结 果为性染体异常的病例同时抽取母血确定孕妇核型。 1.3产后随访 对于所有检测结果呈阳性的孕妇，追踪妊娠结局。同时对于检测结果为阴性的孕妇做好 观察随访，确定无漏诊率。 2.结果 所有样本根据试验方法进行测序，检出21-三体综合征23例，18-三体综合征6例，13- 三体综合征3例，性染色体异常37例。对于低风险孕妇的产后随访，未发现染色体非整倍 体异常。
无创产前检测（NIPT）技术的临床应用原则主要内容 我国出生缺陷发生率与世界中等收入国家的平均水平接近，占新生婴儿的5.6%，但由于人口基数大，每年新增出生缺陷病例总数庞大，全国每年新增出生缺陷约90万例。全国累计有近3000万个家庭曾生育过出生缺陷和先天残疾儿，约占全国家庭总数的近1/10。染色体非整倍体是造成出生缺陷的主要原因之一，其中21-三体、18-三体、13-三体较为常见。21-三体综合征（又称为唐氏综合征，Down’s syndrome或先天愚型）最为常见，新生儿中发病率大约为1/600~1/800，且随着母亲年龄的增长有显著上升趋势。患儿通常都存在学习障碍、智能障碍或伴有脏器畸形等问题。18-三体综合征（又称为爱德华氏综合征）是仅次于唐氏综合征的第二种常见染色体三体征，新生儿中发病率为1/8000~1/3500。主要表现为发育迟缓、智能障碍和严重先心病等多发畸形，患儿多于出生后数周死亡。13-三体综合征（又称为Patau综合征），新生儿中发病率约为1/25000。具有严重智力发育障碍，全前脑畸形，严重先心病，多指（趾），严重唇腭裂，多囊肾及多囊肝等异常。存活较久的患儿还有癫痫样发作，肌张力低下等。在这类遗传病中，胎儿期常有流产、死胎、畸胎等，患儿可表现为先天智力低下、生长发育迟缓，常伴有五官、四肢、内脏等方面的畸形，生活自理困难，给家庭和社会造成沉重的经济负担。 无创产前检测 研究表明13、18、21-三体综合征及X，Y染色体非整倍体占新生儿染色体数目异常的95%。对于这些疾病尚无有效的治疗方法，唯一有效的措
施是广泛开展产前筛查与诊断，及时诊断胎儿异常，适时终止妊娠，防止畸形儿出生，是降低出生缺陷的重要手段。研究发现在孕妇外周血中存在胎儿游离DNA、游离RNA、胎儿有核红细胞、甲基化标记位点的胎盘特异性DNA等。胎儿游离DNA中包括约90~95%母体自身凋亡DNA片段和约5~10%胎儿游离DNA，经过DNA萃取和测序前处理等方式，使得母亲外周血中的DNA能在大规模并行基因组测序平台进行碱基信息读取。在得到300~500万个有效DNA序列信息后，基于怀有正常二倍体胎儿的孕妇群体数据构建正态分布模型，以确定怀有二倍体胎儿的置信区间，统计得到怀有二倍体胎儿的检测阈值，从而对受检样本是否怀有染色体非整倍体胎儿做无创产前检测（Noninvasive prenatal test，NIPT）胎儿染色体异常技术的出现，是产前检测技术的一大突破。 该技术仅需抽取3~5 mL的母体外周血，即可检测胎儿是否存在染色体非整倍性异常。母体外周血中胎儿游离DNA含量相对较高，提取及分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本高通量的检测方法。另外，胎儿DNA在孕早期就可检测到，且分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影响。因此，对孕妇外周血中胎儿游离DNA的检测及其临床应用研究将对无创性产前诊断技术的发展产生重大影响。该技术基于新一代高通量测序技术及生物信息学分析方法，具有无创、早期、高通量和高准确性。现阶段对21-三体综合征和18-三体综合征的检出率可以达到100%，特异性为97.9~99.7%。对其它的常染色体及性染色体数目异常的检出率虽不及以上二种病，但是克服了传统的血清学筛查技术不能筛查的困难。随
NIPT问题解答 目录 一、NIPT针对慎用人群的解读 1.适历时刻检测时刻12+0—26+6，最正确检测时刻12+0—22+6 2.产前筛查高风险，预产期年龄≥35岁的高龄妊妇，和有其他直接产前诊断指征的妊妇 3.孕周＜12周的妊妇 4.高体重(体重＞100千克)妊妇 5.通过体外受精-胚胎移植(以下简称IVF-ET)方式受孕的妊妇 6.双胎怀胎的妊妇 7.归并恶性肿瘤的妊妇 二、NIPT针对不适用人群解读 8.染色体异样胎儿临盆史，夫妇一方有明确染色体异样的妊妇 9.妊妇1年内同意过异体输血、移植手术、细胞医治或同意过免疫医治等对高通量测序 产前筛查与诊断结果将造成干扰的 10.胎儿影像学检查疑心胎儿有微缺失微重复综合征或其他染色体异样可能的 11.各类基因病的高风险人群 三、同类型产品比较解读 12. 某公司的检测是针对7条染色体？ 13. 妊妇体内胎儿有核红细胞的检测？ 14. NIPT优势 四、NIPT与传统检测方式比较 15. 无创产前胎儿DNA检测能够代替羊水穿刺吗？ 16. 无创DNA产前检测技术与传统的产前筛查有什么区别？
17. 另一个值得大伙儿关心的问题是检测的准确率。 五、针对临床检测结果的问答 18. 有一例样本进行了NIPT检测为阳性，后进行穿刺检测觉察为阴性，怎么说明？ 19.之前我妻子B超的时候觉察是单脐动脉，但无创结果检测出来没有问题，是不是还需 要做穿刺，谢谢！ 20.什么情形下需要重抽血？ 21.无创基因检测为何不查其他染色体异样？ 22.请问无创DNA检查的假阳性率究竟是多少，网上看到有些人无创检查高危然后羊水 穿刺结果正常的，感觉不太准？ 23．你好，我想问一下你们那个无创DNA检查可否测出胎儿是不是是3倍体？ 24．孩子的父亲为大Y，请问会遗传给小孩吗？无创能够检测的出来吗？ 25. 无创DNA检测能够查神经管缺点吗？ 26.无创产前胎儿DNA检测只检测21，18，13号染色体，可否检测性染色体异样？ 27. 请问无创染色体非整倍体产前检测是不是与具体孕周有关？ 28.该检测结果能够作为临床终止怀胎的依据吗？ 29.已进行过唐氏筛查的妊妇，是不是还需要做该检测？ 30.做无创DNA产前检测时，妊妇抽血需要空肚吗？有需专门注意的事项吗？ 31.检测出低风险，如何处置？ 六、其他问题 32.双胞胎或多胞胎的单子可不能够接？怎么处置？如何收费？ 33.诞生后是不是同时患有2一、1八、13三体综合征才有40万理赔？患其中一种是不 是有理赔？ 34.正常结果，报告上如何说明？ 35.保险费是不是检测外费用，费用多少？
通过母系血浆的高通量平行DNA基因组测序来进行胎儿染色体非整倍性的无创产前诊断 前言 染色体非整倍性是很多配偶选择做产前检查的主要原因。现在决定性诊断的方法主要靠破坏性的过程，比如绒毛膜取样和羊膜穿刺术，然而这些方法都有流产的风险。虽然胎儿的DNA可以在母亲的血浆中找到，但是作为其中非常微小的部分，总是伴随着大量母系DNA背景。因此胎儿基因组内的非整倍性染色体数量上的不同对于母亲血浆中全部的染色体序列表达就非常的微小。即使用非常精确的单分子计数方法比如数码PCR，为了达到必要的分析精度仍必须分析大量的DNA 分子，即需要大量的母系血浆。这样我们就证明了使用独立位点的方法比定位于某一基因位点的方法将极大的提高从相同一定容量的血浆中可供分析的非整倍性染色体目标分子的数量。因此我们为了达到产前胎儿二十一三体综合症的无创检测，应使用高通量平行基因组测序来量化母系DNA序列。我们检测了28个怀孕六个月内母亲的血浆样本并正确辨别出了其中14个二十一三体综合征胎儿和14个整倍性胎儿，高通量平行血浆DNA测序展示了一个为所有孕妇进行无创产前胎儿染色体非整倍性诊断的新途径。 正文 检测胎儿非整倍性是许多孕期妇女做产前诊断的主要原因。传统的产前检测方法包括绒毛膜取样和羊膜穿刺术，这些具有破坏性的取样方法有可能导致流产，因此许多人都在研究无创取样方法，其中超
声波扫描和母亲血清的生物化学标记被证明是有效的筛选方法，然而他们发现的是负现象而不是染色体异常的病理学特征。这些方法也存在很大的局限性，比如妊娠期适用性和同时需要联合多个标记，甚至需要通过不同的时间节点来达到一个临床上有用的灵敏度和特异性。为了从母亲血样中直接检测胎儿的染色体和基因组异常，早期的工作聚焦于如何将稀少的胎儿有核细胞从母亲血浆中分离出来。1997年发现的母亲血浆中无细胞胎儿核酸开创了新的可能，然而胎儿DNA仅仅占母亲血浆DNA的很小部分。绝大多数都是孕妇自己的DNA，这点造成了巨大的挑战。最近，生物学家发明了大量的方法。一个策略以母亲血浆中胎儿特异性的核酸作为目标，比如说胎盘的mRNA和DNA 分子创造了一个胎盘特异性DNA甲基化信号。胎儿的染色体剂量然后用目标分子中SNPs的等位基因比率分析来评估，这种策略叫做RNA-SNP等位基因比率法和表观遗传等位基因比率法。这种基于等位基因比率的方法只能用在被分析的SNPs位点上是杂合的胎儿中，所以为了提高这种方法的覆盖率需要多样的标记。 为了创造一种从母系血浆中检测胎儿染色体非整倍性的单独多态性的方法，我们团队最近提出了使用数码PCR来进行相关染色体剂量（RCD）测量的原则。数码RCD是用来数母系血浆中可能的非整倍性染色体的一个特殊位点的总数量，比如说二十一三体综合症中的二十号染色体，并且将其与参考染色体比较。因此我们检测到由三条二十一号染色体带来的基因位点与对照基因的微小增加时，我们就可以诊断出二十一三体综合症，二十一号染色体序列成比例的增加预期就
附件1 胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）技术审查 指导原则（征求意见稿） 一、前言 本指导原则旨在指导注册申请人对胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对该类试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究内容，可自行补充。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 二、适用范围
(一)临床背景 胎儿染色体非整倍体（fetal chromosome aneuploidies）中的21三体、18三体、13三体（trisomies 21、18、13，即T21、T18、T13）是临床上最常见的染色体非整倍体疾病。其对应的分别21-三体综合征（又称唐氏综合征，先天愚型或Down综合征）、18-三体综合征（又称Edwards综合征）和13-三体综合征（又称Patau综合征），发病率分别约为1/700、1/6000、1/10000，患儿绝大多数存在严重智力障碍及器官畸形，生活无法自理，不仅影响儿童的生命健康和生活质量，同时影响经济社会的健康可持续发展。 依据《中华人民共和国母婴保健法》，为了保障母亲和婴儿健康，提高出我国出生人口素质，医疗保健机构应当为育龄妇女和孕产妇提供孕产期保健服务。产前筛查和产前诊断即是为避免产生遗传缺陷患儿提供的有效手段。常规的产前筛查方法包括：早孕期的超声与血清学联合筛查和中孕期母体血清学筛查。中孕期母体血清学筛查是指通过中孕期母体血清甲胎蛋白、血清人绒毛膜促性腺激素、血清人绒毛膜促性腺激素游离ß亚基、抑制素A和非结合雌三醇指标结合孕妇的年龄、体重、孕周、病史等进行综合风险评估，得出胎儿是否罹患相关三体综合征或神经管缺陷的风险度。筛查结果为高风险的孕妇经建议经产前诊断进行最终确认，由孕妇知情选择。胎儿染色体异常的产前诊断金标准为介入前产前诊断手术,是指通过绒毛取材术/羊膜腔穿刺术/经皮脐血管穿刺术，取相应细胞采用细胞生物学方法对胎儿染色体进行核型分析。 我国对以下孕妇均实行产前诊断：35岁以上的高龄孕妇；产前筛查出来的胎儿染色体异常高风险的孕妇；曾生育过染色体病患儿的孕妇；产前B超检查怀疑胎儿可能有染色体 异常的孕妇；夫妇一方为染色体异常携带者；医师认为有必要进行产前诊断的其他情形。 （二）高通量测序法进行产前筛查 高通量测序(High-Throughput Sequencing)是近年来迅