横河数字量模块
Digital I/O Modules (for FIO)
? GENERAL
This GS covers the hardware speci?cations of the Digital I/O Modules (FIO) that can be installed in the Node Unit for ESB Bus (ANB10S, ANB10D), the Node Unit for ER Bus (ANR10S, ANR10D) and the Compact Field Control Unit (for FIO) (AFF50S, AFF50D, AFV10S, AFV10D).
? STANDARD SPECIFICATIONS
●Digital Input Modules
The Digital Input Modules receive 32-channel or 64-channel 24 V DC ON/OFF signals.
The ADV151 and ADV161 can be used in dual redundant con?guration.
Item Speci?cations
Model ADV151-P/ADV151-E (*1) ADV157 ADV161 Number of input channels 32 32 64
Rated input voltage (*2)24 V DC (sink/source) 24 V DC (sink/source) 24 V DC (sink/source) Input ON voltage 18 to 26.4 V DC18 to 26.4 V DC 20 to 26.4 V DC
Input OFF voltage 5.0 V DC or less 5.0 V DC or less 5.0 V DC or less
Input current (at rated input voltage) 4.1 mA±20 % / channel 4.1 mA±20 % / channel 2.5 mA±20 % / channel Maximum allowable input voltage 30.0 V DC 30.0 V DC 30.0 V DC
Withstanding voltage Between input signal and system: 2 kV AC, For 1 minute
Between commons: 500 V AC, For 1 minute, common every 16-channel (*3)
Functions
Status input Function for detecting
ON/OFF status Function for detecting
ON/OFF status
Function for detecting
ON/OFF status
Pushbutton input Function for counting the
pushbutton edges — Function for counting the
pushbutton edges
Input response time 8 ms or less (for status input)
Minimum ON detection time 20 ms (for pushbutton input)
Maximum ON/OFF cycle 25 Hz (for pushbutton input)
Maximum current consumption 500 mA (5 V DC) 350 mA (5 V DC) 550 mA (5 V DC) Weight 0.3 kg 0.4 kg 0.3 kg
External connection Pressure clamp terminal,
Dedicated cable (AKB331),
MIL connector cable
Pressure clamp terminal Dedicated cable (AKB337),
MIL connector cable
*1: Only ADV151-P is allowed to be installed in the remote node. ADV151-E is not allowed to be installed in the remote node.
*2: ADV151, ADV157 and ADV161 are common every 16-channel. All voltage input signals to be connected (24 V DC) must be in the same polarity.
*3: The withstanding voltage for using a dedicated cable is 500 V AC (between input signal and system).
The withstanding voltage for using MIL connector cable depends on the electrical speci?cations of its cable.
滨州新大新机电科技有限公司
The AC Digital Input Modules receive 16-channel 100 V AC or 220 V AC ON/OFF signals.
They can be used in dual redundant con?guration.
Item Speci?cations
Model ADV141 ADV142 Number of input channels 16 16
Rated input voltage (*1) 100 to 120 V AC, 50/60 Hz 200 to 240 V AC, 50/60 Hz
Input ON voltage (peak value) 80 V AC (113 V) to 132 V AC (187 V) 160 V AC (226 V) to 264 V AC (373 V) Input OFF voltage (peak value) 20 V AC (28 V) or less 40 V AC (56 V) or less
Input current (TYP) 4.7 mA (@120 V/60 Hz) / channel 6.2 mA (@240 V/60 Hz) / channel Input current (MAX) 7 mA / channel 9.3 mA / channel
Withstanding voltage Between input signal and system: 2 kV AC, For 1 minute
Between commons: 1.35 kV AC, For 1 minute, common minus (–) side every 8-channel Functions
Status input Function for detecting ON/OFF status
Pushbutton input Function for counting the pushbutton edges
Input response time 160 ms or less (for status input)
Minimum ON detection time 200 ms (for pushbutton input)
Maximum ON/OFF cycle 2.5 Hz (for pushbutton input)
Maximum current consumption 500 mA (5 V DC) 500 mA (5 V DC)
Weight 0.3 kg 0.3 kg
External connection Pressure clamp terminal,
Dedicated cable (AKB332) Pressure clamp terminal, Dedicated cable (AKB333)
*1: Input a sine wave, for AC signals.
Note: AC input signals to the same common should be the same phase.
The Digital Output Modules output 32-channel or 64-channel transistor contact signals.
The ADV551 and ADV561 can be used in dual redundant con?guration.
Item Speci?cations
Model ADV551 ADV557 ADV561 Number of output channels 32 32 64
Rated applied voltage 24 V DC 24 V DC 24 V DC
Load voltage 24 V DC, 50 mA 24 V DC, 50 mA 24 V DC, 100 mA
External power supply voltage
range 20.4 to 26.4 V DC 20.4 to 26.4 V DC 20.4 to 26.4 V DC
Output ON voltage maximum
value 2 V DC 2 V DC 2 V DC
Leak current maximum value
when output OFF 0.1 mA 0.1 mA 0.1 mA
Output format Current sink Current sink Current sink
Maximum load current (*1) 100 mA/channel, 26.4 V 100 mA/channel, 26.4 V 100 mA/channel, 26.4 V
Withstanding voltage Between output signal and system: 2 kV AC, For 1 minute Between commons: 500 V AC, For 1
minute, common minus (–) side every 16-channel (*2)
Functions
Status output ON/OFF status output function ON/OFF status output function ON/OFF status output function
Pulse width output One-shot pulse width output
function — One-shot pulse width output
function
Time-proportioning output Time-proportioning ON/OFF — Time-proportioning ON/OFF Output response time 3 ms or less (for status output)
10 ms or less (for mixed status and pulse outputs)
Pulse width 8 ms to 7200 s
Pulse width resolution 8 ms, but ON/OFF delay of maximum 1 ms is added
Maximum current consumption 700 mA (5 V DC)
60 mA (external power supply)
550 mA (5 V DC)
60 mA (external power supply)
700 mA (5 V DC)
120 mA (external power supply)
Weight 0.2 kg 0.3 kg 0.3 kg
External connection Pressure clamp terminal,
Dedicated cable (AKB331), MIL
connector cable
Pressure clamp terminal Dedicated cable (AKB337), MIL
connector cable
*1: Connect a spark killer diode when driving DC relay.
*2: The withstanding voltage for using a dedicated cable is 500 V AC (between output signal and system).
The withstanding voltage for using MIL connector cable depends on the electrical speci?cations of its cable.
The Relay Output Module outputs the 16-channel relay contact signals.
It can be used in dual redundant con?guration.
Item Speci?cations
Model ADR541 Number of output channels 16
Rated applied voltage 24 to 110 V DC, 100 to 240 V AC, 50/60 Hz
Maximum load current (*1) Resistive load:
24 V DC: 2.0 A/channel, 110 V DC: 0.4 A/channel 100 V AC: 2.0 A/channel, 220 V AC: 2.0 A/channel Inductive load:
24 V DC: 0.6 A/channel, 110 V DC: 0.1 A/channel 100 V AC: 1.0 A/channel, 220 V AC: 1.0 A/channel
Withstanding voltage Between output signal and system: 2 kV AC, For 1 minute
Between commons: 1.35 kV AC, For 1 minute, common minus (–) side every 8-channel Functions
Status output ON/OFF status output function
Pulse width output One-shot pulse width output function
Time-proportioning output Time-proportioning ON/OFF
Output response time 12 ms or less (for status output) 20 ms or less (for mixed status and pulse outputs) Pulse width 40 ms to 7200 s
Pulse width resolution 8 ms, but ON/OFF delay added for maximum 10 ms
Maximum current consumption 780 mA (5 V DC)
Weight 0.3 kg
External connection Pressure clamp terminal, Dedicated cable (AKB334)
Relay switching life 100000 operations (*2)
*1: Maximum 8 A is allowed per common. Connect a spark killer diode when driving DC relay.
*2: The relay cannot be replaced with new one. If it comes to the end of its life, the module should be replaced.
Note: The signals connected the same common should be the same phase when applying AC voltage.
Digital I/O Modules (CENTUM-ST Compatible)
The Digital I/O Modules (CENTUM-ST Compatible) receive contact or voltage status signals from the ?eld, and/or output status signals to the ?eld via transistor contacts.
Item Speci?cations
Model ADV859 ADV159 ADV559
Number of I/O channels 16-channel input,
16-channel output 32-channel input 32-channel output
Signal isolation Isolated channels Isolated channels Isolated channels
Input signal Contact input: OFF signal 100 k? or more
ON signal 200 ? or less
Minimum current value when contact is short-
circuited: 1.25 mA
Voltage input: OFF signal 4.5 to 25 V DC
ON signal ±1 V DC, 200 ? or less
–
Input contact rating 5 V DC, 20 mA or more –Pushbutton input function Not supported Supported –Input response time 8 ms (for status input) 8 ms (for status input) –Minimum ON detection time –20 ms (for pushbutton input) –Maximum ON/OFF cycle –25 Hz (for pushbutton input) –Output signal Transistor contact –Transistor contact
Output contact rating Inductive load, resistive load:
30 V DC, 100 mA (*1) –Inductive load, resistive load: 30 V DC, 100 mA (*1)
Output response time 16 ms or less –16 ms or less Pulse width 8 ms to 7200 s –8 ms to 7200 s
Pulse width resolution 8 ms, add max. 1ms for ON/OFF
delay time –8 ms, add max. 1ms for ON/OFF delay time
Maximum current
consumption 450 mA (5 V DC) 330 mA (5 V DC) 570 mA (5 V DC) Weight 0.3 kg 0.4 kg 0.3 kg
External connection Dedicated cable (KS2) Dedicated cable (KS2) Dedicated cable (KS2) Compatible card ST2 compatible ST3 compatible ST4 compatible *1: Connect a spark killer diode when driving DC relay.
Item Speci?cations
Model ADV869 ADV169 ADV569 Number of I/O channels 32-channel input,
32-channel output 64-channel input 64-channel output Signal isolation Common every 16-channel Common every 16-channel Common every 16-channel
Input signal Contact input: OFF signal 100 k? or more
ON signal 200 ? or less
Minimum current value when contact is short-
circuited: 1.25 mA
Voltage input: OFF signal 4.5 to 25 V DC
ON signal ±1 V DC, 200 ? or less
–
Input contact rating 5 V DC, 20 mA or more
Pushbutton input function Not supported Not supported–Input response time 8 ms (for status input) 8 ms (for status input)–Output signal Transistor contact–Transistor contact
Output contact rating Inductive load, resistive load:
30 V DC, 100 mA (*1)–Inductive load, resistive load: 30 V DC, 100 mA (*1)
Output response time 16 ms or less–16 ms or less Pulse width 8 ms to 7200 s–8 ms to 7200 s
Pulse width resolution 8 ms, add max. 1 ms for ON/
OFF delay time –8 ms, add max. 1 ms for ON/ OFF delay time
Maximum current
consumption 800 mA (5 V DC) 800 mA (5 V DC) 800 mA (5 V DC) Weight 0.3 kg 0.3 kg 0.3 kg
External connection Dedicated cable (KS9) Dedicated cable (KS9) Dedicated cable (KS9) Compatible card ST5 compatible ST6 compatible ST7 compatible *1: Connect a spark killer diode when driving DC relay.
Function Assignment in Digital Modules
Select the patterns for assigning functions channel-by-channel in digital modules.
The following table lists the correspondence between the module types and point modes.
Table: Correspondence Between the Module Types and Point Modes
Point Mode Module Type
SI Status input
PB Pushbutton input SO Status output
PW Pulse width output
TP
Time-proportioning ON/OFF output
ADV151CH1
CH32Pattern 132-point SI ADV157CH1
CH32
Pattern 1
32-point SI
ADV161CH1
CH32CH33
CH64
F07E.ai
Pattern 1
32-point (1-32ch)SI
32-point (33-64ch)
SI
32-point (33-64ch)
SI
Pattern 2
32-point PB Pattern 2
32-point (1-32ch)PB 16-point SI
ADV141, ADV142CH1
CH16
Pattern 116-point PB
Pattern 2F08E.ai
ADV551CH1
CH32
Pattern 132-point SO ADV557*1: If an odd-numbered terminal is specified as PW or TP , the next terminal cannot be specified as a different type.
*2: This pattern applies only for direct-connected nodes. Dual redundancy is not possible.
CH1
CH32
Pattern 1
32-point SO
ADV561CH1
CH32CH33
CH64
F09E.ai
Pattern 1
32-point (1-32ch)SO
32-point (33-64ch)SO
32-point (33-64ch)SO
Pattern 2
32-point PW or TP (*1)
Pattern 3 (*2)
32-point SO or PW or TP
Pattern 2
32-point PW or TP (*1)
32-point (33-64ch)SO
Pattern 3 (*2)32-point SO or PW or TP
16-point SO
ADR541Pattern 1CH1
CH16
16-point
PW (odd
number only)
or TP (*1)
Pattern 2
16-point SO
or PW
or TP
Pattern 3 (*2)
F10E.ai
*1: If an odd-numbered terminal is specified as PW or TP , the next terminal cannot be specified as a different type.
*2: This pattern applies only for direct-connected nodes. Dual redundancy
is not possible.
16-point SI
ADV159 (ST3)ADV859 (ST2)CH1
CH1
CH16CH32
Pattern 1
Pattern 116-point SO or PW or TP
CH17
CH32
32-point SI ADV559 (ST4)CH1
CH32
Pattern 132-point SO or PW or TP
F11E.ai
Pattern 2
32-point PB
ADV869 (ST5)CH1
CH32CH33
CH64
CH64
Pattern 132-point SI
32-point SO or PW or TP
ADV169 (ST6)CH1
Pattern 1
64-point SI
ADV569 (ST7)CH1
CH64
F12E.ai
Pattern 1
64-point SO or PW or TP
For PW (pulse width output), use two contiguous terminal numbers; the ?rst of these must be odd-numbered. If both PW and TP (time-proportioning ON/OFF output) are used together, successive pairs of terminals must be either PW or TP terminals, as shown in the example below.
Example:
For PW output, use two contiguous terminal numbers; the ?rst of these must be odd-numbered. Also if SO and TP terminals are used together with PW, individual terminals that are not PW can be either SO or TP terminals. Example:
? EXTERNAL DIMENSIONS
● ADV151, ADV551 Digital I/O Module
F01E.ai
Unit: mm
● ADV141, ADV142, ADR541 Digital I/O Module
F02E.ai
Unit: mm
●ADV157, ADV557 Digital I/O Module
Unit: mm
●ADV161, ADV561 Digital I/O Module
Unit: mm
●ADV859, ADV159, ADV559 Digital I/O Module for Compatible ST
F05E.ai
Unit: mm ●
ADV869, ADV169, ADV569 Digital I/O Module for Compatible ST
F06E.ai
Unit: mm
MODELS AND SUFFIX CODES
Digital Input Module
Description Model ADV151 Digital Input Module (32-channel, 24 V DC, Isolated)
Suf?x Codes -P With pulse count
-E With SOE capture (*1)
0 General-purpose type
1 With status display
0 Basic type
3 With ISA Standard G3 option and temperature (-20 to 70 °C) option
Option Codes /D5A00 With KS Cable Interface Adapter for 32-channel digital [Model: ATD5A-00]
/B5S00 With Pressure Clamp T erminal Block for Digital Input [Model: ATB5S-00]
/B5S10 With Pressure Clamp T erminal Block for Digital Input (surge absorber) [Model: ATB5S-10]
/B5D00With Dual Pressure Clamp T erminal Block for Digital Input [Model: ATB5D-00]
/B5D10 With Dual Pressure Clamp T erminal Block for Digital Input (surge absorber) [Model: ATB5D-10] /CCC01 With Connector Cover for MIL Cable [Model: ACCC01]
*1: Please refer to GS 33L30D10-40E when using it with the Vnet/IP system, and GS 33M30D10-40E when using it with the Vnet system.
Description
Model ADV141 Digital Input Module (16-channel, 100V - 120 V AC, Isolated)
Suf?x Codes -P With pulse count
0 General-purpose type
0 Basic type
3 With ISA Standard G3 option and temperature (-20 to 70 °C) option
Option Code /C4S50 With Pressure Clamp T erminal Block for Digital [Model : ATC4S-50]
Description Model ADV142 Digital Input Module (16-channel, 200 V - 240 V AC, Isolated)
Suf?x Codes -P With pulse count
0 General-purpose type
0 Basic type
3 With ISA Standard G3 option and temperature (-20 to 70 °C) option
Option Code /C4S60 With Pressure Clamp T erminal Block for Digital [Model : ATC4S-60]
Description
Model ADV157 Digital Input Module (32-channel, 24V DC, Pressure Clamp T erminal support only, Isolated)
Suf?x Codes -S Standard type
0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Description
Model ADV161 Digital Input Module (64-channel, 24 V DC, Isolated)
Suf?x Codes -P With pulse count
0 Standard type
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Digital Output Module
Description Model ADV551 Digital Output Module (32-channel, 24 V DC, Isolated)
Suf?x Codes -P With pulse width output function/time-proportional output function 0 General-purpose type
1With status display
0 Basic type
3 With ISA Standard G3 option and temperature (-20 to 70 °C) option
Option Codes /D5A00 With KS Cable Interface Adapter for 32-channel Digital [Model : ATD5A-00]
/D5S00 With Pressure Clamp T erminal Block for Digital Output [Model : ATD5S-00]
/D5S10 With Pressure Clamp T erminal Block for Digital Output (surge absorber) [Model : ATD5S-10]
/D5D00With Dual Pressure Clamp T erminal Block for Digital Output [Model : ATD5D-00]
/D5D10 With Dual Pressure Clamp T erminal Block for Digital Output (surge absorber) [Model : ATD5D-10] /CCC01 With Connector Cover for MIL Cable [Model : ACCC01]
Description
Model ADR541 Relay Output Module (16-channel, 24 to 110 V DC/100 to 240 V AC, Isolated)
Suf?x Codes -P With pulse width output function/time-proportional output function 0 Standard type
0 Basic type
3 With ISA Standard G3 option and temperature (-20 to 70 °C) option
Option Code /C4S70 With Pressure Clamp T erminal Block for Digital Input [Model : ATC4S-70]
Description
Model ADV557 Digital Output Module (32-channel, 24 V DC, Pressure Clamp T erminal support only, Isolated)
Suf?x Codes -S Standard type
0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Description
Model ADV561 Digital Output Module (64-channel, 24 V DC, Isolated)
Suf?x Codes -P With pulse width output function/time-proportional output function 0 Standard type
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Digital I/O Module
Description
Model ADV859 Digital I/O Module for Compatible ST2 (16-channel input/16-channel output, Isolated channels)
Suf?x Codes -P With pulse count function (DI) and pulse width function/time-proportional output function (DO) 0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Description
Model ADV159 Digital Input Module for Compatible ST3 (32-channel, Isolated channels)
Suf?x Codes -P With pulse count function
0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Description
Model ADV559 Digital Output Module for Compatible ST4 (32-channel output, Isolated channels)
Suf?x Codes -P With pulse width function/time-proportional output function 0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Description
Model ADV869 Digital I/O Module for Compatible ST5
(32-channel input/32-channel output, Isolated, Common Minus Side Every 16-channel)
Suf?x Codes -P With pulse count function (DI) and pulse width function/time-proportional output function 0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Description
Model ADV169 Digital Input Module for Compatible ST6 (64-channel, Isolated, Common Minus Side Every 16-channel)
Suf?x Codes -P With pulse count function
0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
Description
Model ADV569 Digital Output Module for Compatible ST7
(64-channel output, Isolated, Common Minus Side Every 16-channel)
Suf?x Codes -P With pulse width function/time-proportional output function 0 Always 0
0 Basic type
1 With ISA Standard G3 option
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
四按键模块 1、概述 四按键模块包含4个瞬时按压按钮，按压按钮在家用电器方面的电视机、电脑中的录音笔、医疗器材中的呼叫系统等领域都有涉及应用，具有结构简单，反馈良好等特点。该模块可应用在控制小车的移动方向与视频互动游戏等方面。本模块接口是黑色色标，是模拟量信号，需要连接到主板上带有黑色标识接口。 2、技术规格 ●工作电压： 5V DC ●按键数量： 4 ●控制方式：单向模拟口控制 ●模块尺寸： 51.2 x 24 x 18 mm (长x宽x高) 3、功能特性 ●模块的白色区域是与金属梁接触的参考区域； ●四按键模块包含状态提示灯与电源提示灯； ●具有反接保护，电源反接不会损坏IC； ●支持Arduino IDE编程, 并且提供运行库来简化编程； ●支持mBlock图形化编程，适合全年龄用户； ●使用RJ25接口连线方便； ●模块化安装，兼容乐高系列； ●配有OUT、VCC、GND接头支持绝大多数Arduino系列主控板。
4、引脚定义 四按键模块有三个针脚的接头,每个针脚的功能如下表 序号引脚功能 1 GND 地线 2 VCC 电源线 3 OUT 模拟量输出 表 1 3-Pin 接头功能表 5、接线方式 ●RJ25连接 由于四按键模块接口是黑色色标，当使用RJ25接口时，需要连接到主控板上带有黑色色标的接口。以Makeblock Orion为例，可以连接到6，7，8号接口，如图 图 1 四按键模块与 Makeblock Orion连接 ●杜邦线连接 当使用杜邦线连接到Arduino Uno主板时，模块OUT引脚需要连接到 ANALOG（模拟）口，如下图所示：
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
按键模块编程思路 良好的人机交互键盘是仪器仪表必不可少的模块，本设计使用4*4共16个按键，操作者可使用规定的按键对仪器的基本参数进行设置，以便仪器合理使用，方便操作者。 对于按键，一般使用单片机的一个IO口，来控制一个按键，这样对于单片机来说编程简单，易于实现。但是本设计采用的主控芯片为TMS320F2812PGFA,其共有54个可用的IO 口，由于本设计为了完成基本的控制、显示已经使用掉了很多IO口，所以为了很好的管理要使用到的16个按键，我们使用了按键管理芯片CH452L. 按键管理芯片CH452L是数码管显示驱动控制和按键管理芯片；可以进行64个按键的键盘扫描；可以同过硬件设置为四线接口和二线接口与单片机进行通信。 具体的产品资料和使用方法，芯片应用手册中都有详细的讲解。 CH452L的四线与单片机接口，编程简单，易于实现，最重要的是实时性好，方便频繁的按键操作。原理图如下： 首先通过单片机向按键管理芯片写命令，启动按键扫描功能。按键管理芯片就不间断的对按键进行扫描，一旦检测到有按键按下，按键管理芯片就会向单片机发出信号，一般在单片机中设置为此信号为中断信号。单片机检测到按键信号后，就从按键管理芯片中读取按键信息，从而检测出那个按键按下； 这里需要说明下，CH452L数据输出电平为5V的TTL电平，为了与DSP的3.3VCMOS 电平匹配，在CH452L和F2812之间使用SN74ALVC4245A电平转换芯片，可以实现电平匹配。这个电平转换芯片与液晶模块使用到的电平转换芯片原理和使用方法一样，只是管教略有差异，这里不再详述。 下面详细叙述编程思路： 在连接好硬件电路之后， 个变量’KeyWord’，记录按键信息，表示到底哪个按键按下。在上面提到是用DSP的外部中断来提醒主控芯片有按键按下，所以一定要先设置好DSP的中断相关的寄存器。 主程序流程图如下： “按键扫描”过程就是CPU在等待按键中断的过程。当有按键中断到来时，CPU进入
触摸输入芯片TTP224-BSB原理图 改变C1-C4的数值：若其他条件固定不变, 可以根据各键的实际情况通过调节C1-C4电容值使其达到最佳的灵敏度,同时以使各键的灵敏度达到一致。当C1-C4电容不接时其灵敏度为最高。C1~C4的容值越大其灵敏度越低,C1-C4可调节范围为:0≦C1~C4≦50pF. 电容C5 C6 104电容是μF 106电容是10μF C5 C6的功能作用：起到滤波作用，消除高频噪声，防止通过电源引入的干扰和寄生振荡 4个发光二极管接地之前接了一个下拉电阻，为了保护电路，限制输出电流，防止电压波动时引起不必要的损坏及稳定工作状态。 上拉电阻和下拉电阻：单片机电路中，其I/O管脚检测信号是以高、低电平来判断是否有信号变化的，比如5V为高电平；0V为低电平。上拉电阻可以将单片机的输入电压固定在一个比较稳定的电平上并且控制输入电流，更容易让单片机检测到电压的高低，同理，下拉电阻是将输出电压和电流固定在一个较低且稳定的数值上。 TTP224N-BSB管脚图 管脚定义表： 注： pin类型 I ＝＞仅有CMOS输入 I-PH ＝＞CMOS输入带上拉电阻 O ＝＞CMOS输出（输出电路用场效应管） I-PL ＝＞CMOS输入带下拉电阻 I/O ＝＞CMOS I/O OD ＝＞开漏输出,无二极管保护电路 P ＝＞电源 / 地 开漏输出：开漏输出就是不输出电压，低电平时接地，高电平时不接地。如果外接上拉电阻，则在输出高电平时电压会拉到上拉电阻的电源电压（VOD=VCC）。这种方式适合在连接的外设电压比单片机电压低的时候。
按键模块功能说明： 输出模式选择(由TOG, OD, AHLB端口选择). TTP224 在直接输出模式下其输入端口(TPQ0~TPQ3)可由 AHLB 端口来设定其输出高电平或低电平有效,同 时也可由 TOG 端口来设定为触发模式或通过 OD 端口来设定为开漏输出模式（有二极管保护电路），高阻抗状态可视为断路，输入电阻特别大。 开漏模式下TRQ0~TRQ3的功能描述表： 有效键最长输出时间 ( 由MOT0 端口选择) 如果因其它非正常因素造成有物体触摸到键并且电容量改变足够以被承认为有效触摸,会使其一直动作, 为了防止此类现象的发生，所以 TTP224 设计了有效键最长输出时间设定电路,可设置键的最长输出时间,当物体触摸时间超过所设定时间时，系统将会返回到上电初始化状态并停止输出直到下一次被触摸时. 快速模式和低功耗模式选择（由 LPMB 端口选择） TTP224 有提供快速和低功耗两种模式可选择,由 LPMB 端口进行选择,当 LPMB 端口连接到VDD 时 TTP224 工作在快速模式下，当 LPMB 端口悬空或接 VSS 时,TTP224 工作在低功耗模式。 在快速模式下,其响应速度较快,但是耗电流会稍大. 在低功耗模式下,功耗会较小,但是首次触摸时其响应速度会慢些,此后其响应速度将和快速模式一样,因此时系统已经自动转换到快速模式下进行工作。当所有键释放超过 8 秒后，系统又将恢复到低功耗工作模式。两种工作模式状态时序如下图（VDD为高电平，VSS为低电平，高电平有效）:
荧光免疫染色和DAPI染色实验 1．实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。 实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片：
4.5按键控制模块 4.5.1 按键简介 1、按键输入原理 键盘中每一个按键都是一个常开的开关电路，当所设置的功能键或数字键按下时，则处于闭合状态，对于一组键或一个键盘，需要通过接口电路与单片机相连，以便把键的开关状态通知单片机。单片机可以采用查询或中断方式了解有无键输入并检查哪一个键被按下，并通过转移指令转入执行该键的功能程序，执行完又返回到原始状态。 2、独立式按键 独立式按键是指直接用I/O口线构成的单个按键电路。每个独立式按键单独占有一根I/O口线，每根I/O口线的工作状态不会影响其他I/O口线的工作状态，这是一个最简单易懂的按键结构。 4.5.2 延时按键 1. 目前,无论是按键或是键盘大部分都是利用机械触点的合或断作用。机械触点在闭合及断开瞬间由于弹性作用的影响,均有抖动过程,从而使电压信号也出现抖动,如图1所示.抖动时间长短与开关的机械特性有关,一般为5-10ms。 图1 键闭合及断开时的电压波动
2.假设p1.0为延时按键,则下面为延时的程序: if(p10==0){ delay1ms(10); /*去抖动*/ if(p10==0) {delay1ms(8000);/*延时*/ } } 当按键P1.0按下时,执行一个10ms左右的延时程序后,再确认该键电平是否仍保持闭合状态电平,若仍保持为闭合状态电平,则可以确认该键处于闭合状态,否则认为是干扰信号,从而除去抖动影响。 4.5.3 快进按键 程序: if(p11==0) { delay1ms(10); if(p11==0) dpjs=dpjs+2; dpjs++; yj=sound[dpjs]; dpjs++; jp=sound[dpjs]; } 如果P11为低电平时,程序在经过10ms去抖动之后,节拍快进两步,蜂鸣器开始从当前音节唱起. 4.5.4 快退按键 程序: if(p12==0) { delay1ms(10); if(p12==0)
免疫荧光实验步骤 Modified by JACK on the afternoon of December 26, 2020
免疫荧光实验步骤 1. 直接免疫荧光法测抗原 （1）基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 （2）试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L， 荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 （3）实验步骤 ① 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 ② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
③ 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 ④ 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 ⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 （4）注意事项 1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 ① 标本自发荧光对照：标本加1-2滴L，的PBS。 ② 特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理： 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次； ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色： C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检：在荧光显微镜下观察。 ?优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 ?缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度； ?一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化； –染色时间：从10 min到数小时，一般30 min； C的低温，延长染色时间。C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照： –自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象； ?经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法； ?一抗染色： C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体，37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)； ?甘油缓冲液封片 ?镜检
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。 zo-1的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。 2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟 3、4%的甲醛室温固定20-30分钟 4、1×PBS洗3次，每次10分钟 5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟 6、1×PBS洗3次，每次10分钟 7、5%BSA室温封闭30分钟 8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜 9、1×PBS洗3次，每次10分钟 10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!! 11、1×PBS洗3次，每次10分钟 12、95%甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释 从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光 细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。 2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。 3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。 5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。 6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。 7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 细胞免疫荧光简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min*3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2*5min 6.羊血清封闭：37度，20分钟 7.一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时 8.4度PBS洗净，3min*5次 9.二抗37度小于一小时 10.37度PBS洗净，3*5min 凉干封片(封闭液PH8.5) 不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，都要漂洗干净并且要测下pH值，可以使用PBS多清洗几次，也可以延长PBS清洗时间，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
免疫荧光一般步骤 固定液配制： 常用固定液为4%多聚甲醛，将40g多聚甲醛粉剂在三角烧瓶中溶于1000ml 0.1M PB溶液中,放入磁力转子置于加热磁力搅拌器中加热溶解，温度切忌超过70℃，温度过高会导致多聚甲醛解聚成为甲醛，遮蔽抗体影响抗原抗体结合，溶解后待其冷却，调节PH值至7.4，过滤后室温或4℃放置备用，配好后一个月内有效，最好现配现用。2.5％多聚甲醛(含苦味酸300ml／1000ml)亦是选择，由于渗透压的关系,缓中液改为NaH2PO4.２H2O 3.74g；Na2HPO4.12H2O45.11g（500ml:1.87g,22.55g） 灌注固定： 快速生理盐水冲净血液（约需要100ml即可），4%多聚甲醛灌注（快速充灌100ml 左右，再慢速滴150ml）。灌注用的针头前端要磨平，灌注小鼠可以用较粗的头皮针，仅留1cm，插入左心室即可，不必像大鼠那样插入主动脉根部。 取材 按要求不同取组织，取材部位一定要事先确定好，比如脊髓呈现节段性变化，只有取到正确的部位才能获得结果。坐骨神经对应的脊髓阶段（３，４，５）在第一腰椎下，第五腰椎下是第五神经节，对应髂前上棘（动物其实不叫这个名）前缘。 后固定及蔗糖脱水： 组织取材后切成小块放入4%多聚甲醛中，为后固定，建议4℃过夜，随后转入40%蔗糖溶液中脱水（不沉底），3天后即可用于冰冻切片。后固定时间亦不可过长。脱水不彻底表现为组织切片上空洞样组织破坏；固定不完全表现为微米染色集中在周边，组织内部不着色。蔗糖溶液亦用0.1M PB配制（见附录）。 冰冻切片： 漂染时，脊髓片厚可以25~30微米，神经节片厚要30微米 免疫荧光染色： 1.TBS溶液清洗组织片5分钟×2，有利于抗原抗体结合（可选） 2.封闭液（10％血清+1%BSA）＋0.3%triton-100*室温封闭2小时，亦可4℃过夜，除个别 膜抗原外，都需要加triton-100*;个人习惯的做法是把封闭液分装成1ml/管，保存在-20度，用前添加3微升triton-100 3.一抗孵育4℃过夜，一抗浓度需要通过预实验进行确定，比较常见的是１μｇ／ｍｌ。（一 抗稀释液见附录，建议用） 4.TBS溶液清洗组织片5分钟×3 5.二抗孵室温两小时或4℃过夜，感觉背景深的话,建议4℃过夜。 6.TBS溶液中置于摇床上清洗组织片5分钟×3 7.暗室内将组织片贴于载玻片上，室温晾干，载玻片最好经甲醛明胶处理过,防止粘不牢 脱片。微弱的光线对贴片造成相当的困难，特别是像神经节和小鼠脊髓这样的较小的切片，切片皱折，相互覆盖都会导致无法拍照，我的经验是可以用吸管将切片全部吸到载玻片上，然后尽量吸掉水，也可用毛笔等进一步去掉水份，然后室温晾干，大约一小时左右即可。光线方面也不是特别严格，可以用台灯的反射光进行照明，目前认为只要不是光线直射就可以。 8.90%甘油封片，注意汽泡。90%提前配好，用一个20ml玻璃小瓶或者试管，加入甘油和
通用模块 #ifndef _KEY_H_ #define _KEY_H_ #include 贴壁细胞的免疫荧光染色方法 （Protocol of Immunofluorescence (IF) on attached cells）Materials: 1. PBS solution 2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative): Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃ to dissolve; 3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution) 4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution) 5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot; 6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual Procedure: 1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate; 2. Remove medium, rinse with PBS twice; 3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes; 4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time; 5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4℃for 10 minutes; 6. Remove PBS-T solution, rinse cells with PBS for 5 minutes at room temperature; 7. Block non-specific interaction with PBS-B solution at 37℃for 30 minutes; 8. Add primary antibody solution, incubate at 4℃overnight; 9. Remove primary antibody solution, wash with PBS for 5 minutes; 10. Add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1 hour; 11. Wash with PBS three times, 5 minutes each; 12. Add anti-fade DAPI solution if needed; 13. Observation. 石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织的采集、固定和保存： 采取组织后， 方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4 C 固定 1 小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜 方法二：采用bouin ' s 固定RT2h（6-8d tesis ）or RT 过夜（成年tesis ） PBS缓冲液洗三次，每次5min, 4 C保存于70%乙醇中。 2、组织的包埋、切片、展片及保存：： 固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10 m,贴于处理过的干净载玻片上，37 C烤片过夜，之后收集于载片 盒中，RT密封保存。 石蜡包埋： 保存于 4 C 70%乙醇中的组织样品 80% 乙醇15 min 95%乙醇15 min 100%乙醇15min 2 1/2 乙醇1/2 二甲苯15 min 二甲苯透明5-10 min 1/2 二甲苯1/2 石蜡30 min 石蜡（1） 石蜡（2） 石蜡（3）包埋 RT保存 3、石蜡组织切片的免疫组化方法： 密封保存于RT的组织切片 二甲苯（1） 20 min 二甲苯（2） 20 min 100% 乙醇20min 95% 乙醇10 min 80% 乙醇10 min 通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈 切片在PBS 中浸泡5 min*2 %Trito nx RT 10 min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 3%H2O2 RT 10min 切片在PBS 中浸泡5 min*3 佻胰酶RT 10min 如果是增强型DAB 只要1min 即可RT 60min 3%H2O ) Blocki ng buffer(3%BSA+5%NGS+%Trit on x-100 in PBS) DAB 倾去 blocking buffer ，勿洗 一抗 4 C overnight in blocking buffer 取出切片复温1h ，切片在PBS 中浸泡5 min*3 二抗 in blocking buffer GAR1 200 ( GAM1 100)，RT1h 切片在PBS 中浸泡5 min*3 显色5-10min ( 50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升 在PBS 中浸泡5 min*3 细胞免疫荧光染色操作步骤 免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋 白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。实验步骤如下： 1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。 2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。 3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。 4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。 5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。 6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。 7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。 次日： 8.取出细胞复温至室温约1h。 9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS 配制。浓度1:200 11.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。 12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。 14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。 15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。 16.上机confocol 建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题， 再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时 候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。4.不管采用何种 方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。 免疫荧光实验步骤 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998 免疫荧光实验步骤 1. 直接免疫荧光法测抗原 （1）基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 （2）试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L， 荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释？ 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml）？ 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）？ 荧光显微镜？ 玻片架？ 滤纸？ 37℃温箱等。 （3）实验步骤 ① 滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 ② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。 ③ 取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 ④ 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 ⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。 （4）注意事项 1)对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。 2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。 3)为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。 ① 标本自发荧光对照：标本加1-2滴L，的PBS。 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。 5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一贴壁细胞的免疫荧光染色方法(ProtocolofImmunofluorescence(IF)onattachedcells)
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
细胞免疫荧光染色操作步骤
免疫荧光实验步骤
免疫荧光双标操作方法及注意事项
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