醋酸菌分离及鉴定
一、培养基
1、分离培养基（溴甲酚紫显色平板）:葡萄糖1%、酵母膏1%、无
水乙醇3%（体积分数）、0.04%溴甲酚紫5%（体积分数）、琼
脂1.8%、水100 mL，0.1 Mpa 灭菌20 min，无水乙醇在灭菌
后培养基温度降到75 ℃左右时加入。
2 、保藏培养基: 葡萄糖1%、酵母膏0.5%、琼脂2%、丙三醇2.5%
（体积分数）、水100 mL，121℃灭菌20 min 备用。
3、液体培养基:葡萄糖1%、酵母膏0.5%、丙三醇2.5%（体积分
数）、水100 mL，调节pH 至6.30，121 ℃灭菌20 min 备用。
二、醋酸菌分离纯化流程
样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯化→斜面试管
保藏→产醋酸定性测试。
三、步骤
1 、菌株分离
取1g 醋醅样品置入无菌试管，装入9 mL 无菌水，振荡均匀后得到10-1 的稀释液，之后10 倍梯度稀释直到10-6 稀释度。取
10-2至10-6 稀释度的样品稀释液分别涂布溴甲酚紫显色平板，每个稀释度涂布2 个平板，每个平板涂布0.2 mL 的样品稀释液，涂布完成后30 ℃倒置培养48 h左右。选取菌落数在30~50 个左右的平板，挑取该平板上的所有单菌落转入斜面保藏培养基中，
30 ℃培养24 h 左右后保存于4 ℃冰箱。
2 、菌株纯化将试管斜面中的菌株平板划线分离后再转接试管斜面，
4℃冰箱保存。
3、菌株归类以上述各菌株划线分离的平板为基准，将形成菌落极
其相似的菌株归为一大类。
4 、菌悬液的制备用接种环挑取新鲜培养的斜面菌株半环，溶于
装有200 μL 无菌超纯水的Eppendorf 管中，于试管振荡器上
混匀后得到菌悬液。
四、鉴定
1、菌株形态特征:镜下细胞呈短杆状,革兰阴性,无芽胞,单个或成
对、成链排列,个体大小为（0.5～0. 7)μm ×(1. 0～1. 5)μm。
2、培养特征:在葡萄糖、酵母膏、乙醇、CaCO3平板培养基上生
长旺盛,菌落圆形、油脂状,表面光滑、凸起,边缘整齐,培养2 d能
产酸,使CaCO3 溶解形成透明圈,继续培养将乙酸氧化分解产生
CO2 和水,菌落周围出现白色透明圈。在斜面培养基上生长良好,
培养2 d后呈油脂状,并产酸。在10% ( v / v)乙醇的培养基上、
Hoyer2Frateur培养液中、30%葡萄糖培养基上均不生长。
五、测试
1、产酸量的测定方法取1 mL 发酵液, 加入10 mL 蒸馏水, 3 滴～
5 滴0.02 %酚酞酒精溶液, 用标定的0.1 mol/L NaOH 溶液滴定
至浅粉色。由所耗的NaOH 溶液的量来计算样品中的含酸量(以
醋酸计)。
产酸量( %) =( V- V0) ×CNaOH×0.06×100 %
式中：
V——发酵液样品滴定耗用的NaOH 量(mL);
V0——以空白培养基为对照滴定耗用的NaOH 量(mL); CNaOH——NaOH 标准溶液浓度(mol/L);
0.06——消耗1 mL 0.1mol/L NaOH 溶液相当于乙酸的质量( g) ; 100 %——转化为百分含量的系数。
六、有关背景
1、传统法酿醋过程中熏醋醅料固态发酵大致上可分为3 个阶段:
第1 阶段是第1 ～ 10 天主要为酒化、糖化阶段;
第2 阶段为醋酸发酵阶段( 第10 ～ 23天) ；
第3 阶段是第23 ～ 28 天主要为传统酿醋过程中熏醋的后熟
阶段。后熟阶段由于酸的大量积累，大部分微生物在此阶段被
严重抑制，甚至死亡，此时醋酸菌在物料中占绝对优势，物料
中的酒精此时也消耗殆尽，酒化、醋化、糖化作用都基本停止，但各种风味物质酸、醇、酮、酚、酯、醛以及它们的复合物等
的转化还在缓慢地进行。
2、对于醋品的生产而言，不仅需要产酸能力极强的醋酸菌，也需
要产酸及产香的芽孢杆菌以及一些其它的微生物，这也是各地出品的醋口感与香味不一的重要原因。但是，因为选用的分离
培养基主要适用于产酸菌的分离，因而所分离出的菌株只是醋醅中微生物的一小部分。通常环境中可培养的细菌不到细菌总
数的1%。而对于难以培养的细菌及一些需要特殊培养基的细菌，
可以采用免培养法。
3、醅料中的微生物前期以霉菌为主，中后期以酵母菌和细菌为主。
第三节奈瑟菌属(Neisseria) 致病菌脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides) 淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae) 一、脑膜炎奈瑟菌(N. meningitides) （一）生物学性状形态与染色肾形，G-双球菌，有荚膜，菌毛培养特性专性需氧，培养基：巧克力培养基，5%CO2 菌落：光滑，透明，不溶血 1．抵抗力对干燥，热力，消毒剂均敏感 （二）致病性致病物质荚膜：菌毛：内毒素：主要致病物质 1．所致疾病流脑，人是其唯一易感宿主三种临床类型：普通型，爆发型，慢性败血病型 （三）免疫性：以体液免疫为主 （四）微生物学检查法标本采集涂片染色镜检分离培养与鉴定快速诊断法 （五）防治原则流脑荚膜多糖疫苗，治疗首选青霉素G ：1云南大学药学院(昆明650091)；2云南沃森生物技术有限公司(昆明6501l8 为制备四价脑膜炎球菌疫苗的需要2005 A群脑膜炎球菌多糖结合物的免疫原性研究上海生物制品研究所朱为2002 脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides）感染是细菌性脑膜炎的常见病因，按荚膜多糖可将其分成12个血清群，其中A、B 和C 群感染占所有感染者的90%。全球由脑膜炎球菌引起的脑膜炎发病率在30-50万，病死率约10%，有相当一部分儿童因脑膜炎球菌严重感染而发生致聋等永久后遗症。在我国，A群脑膜炎球菌是主要致病菌群，95%的病例由A群引起。80 年代以来，我国进行了A群脑膜炎球菌荚膜多糖疫苗的大面积接种，有效地控制了发病率。该荚膜多糖是N-乙酰-3-O-乙酰甘露糖胺磷酸盐的线形共聚物，属T细胞非依赖性（TI）抗原，具有中等免疫原性和年龄相关的保护力，不能诱导免疫记忆。现已证实它对2岁以上儿童和成人在短期内有效，但随时间延续保护力下降，尤其在幼龄儿童中。因此有必要改进现有疫苗，提高其对各年龄组（包括婴儿）的免疫效果。近期的研究集中在开发多糖结合疫苗，即将多糖共价结合到蛋白质上，使其转化为T细胞依赖性（TD）抗原，以增强免疫原性和诱导免疫记忆。本文报道将! 群脑膜炎球菌多糖共价结合到精制破伤风类毒素(TT)上制备结合物，观察其在小鼠中的免疫原性。 A+C群脑膜炎球菌多糖一DT结合疫苗与多糖疫苗诱导的抗多糖抗体间的功能活性差异[英]2004 多糖蛋白结合疫苗对预防由一些有荚膜细菌(包括b型流感杆菌、肺炎球菌和C群脑膜炎球菌)引起的侵袭性疾病高度有效。与未结合多糖疫苗相比，多糖一蛋白结合疫苗能在婴幼儿体内诱导更高浓度的血清抗荚膜抗体。而且，结合疫苗诱导的抗体亲和力更高，补体介导的杀菌活性更强。 。在限定剂量时，多糖疫苗诱导的血清抗荚膜抗体预防C群脑膜炎球菌感染婴鼠发生菌血症的效力弱于结合疫苗。结合疫苗组的抗C群抗体的亲和力指数高于多糖疫苗组。两种疫苗在成人中诱导的抗荚膜抗体的功能活性差异，意味着各自激活了不同的B细胞群。 (兰州生物制品研究所崔萱林2001 流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌(Meningococcus)引起的细菌性脑膜炎(简称流脑)，发病急，病死率高，且在各年龄组中都可发生，15岁以下儿童发病占75％以上。脑膜炎球菌根据荚膜多糖的结构可分为12个血清群，其中A、B、c群引发的流脑占90％以上。流脑的流行具有菌群漂移特点，如美国在1945年以前为A群流行，1960年以后以B群为主，1967年以后转为C群流行。我国以A群菌流行为主，B群和C群菌有少量病例，约占lO％左右。因此预防流脑的重点应是A、B、C群流脑球菌引起的疾病。由于流脑菌群的漂移现象，国外多采用多价多糖疫苗用于预防流行性脑脊髓膜炎，目前所使用的主要为A+C群二价疫苗(B群多糖对人体无效，主要研制外膜蛋白为基础的疫苗)，其次为A、C、Y及WI35四价疫苗，其它相关菌群引起的流脑病例已少见。国内目前主要使用A群流脑多糖疫苗，自80年代初使用至今效果很好；对于其它菌群的预防．目前尚未有疫苗出现，因此我们研制了A+C群流脑多糖疫苗，即在现有的A群流脑多糖疫苗中加入C群流脑多糖抗原，形成二价疫苗以预防A、C群流脑球菌引起的脑脊髓膜炎。 A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗的制造和检定均按照WHO(生物制品规程》的要求进行，C群流脑多糖原液的主要制造过程借鉴A群流脑多糖原液的生产工艺，在多糖纯化步骤另采用澄清过滤、苯酚抽提控制多糖浓度等措施，使得C群多糖原液的蛋白质和核酸含量符合要求。A群流脑多糖原液为选用的本所常规生产的原液制品。由于多糖原液在制备过程中未进行专门的除类毒素工艺，因而在原液检定中采用鲎试剂法对类毒素含量进行测定，以确保疫苗的安全性。 2岁以下年龄组儿童在接种A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗一个月后，虽然同组儿童的免前及免后的血清杀菌抗体滴度有显著差．但血清4倍阳转率较大年龄组儿童低，而且免后血清中的杀菌抗体滴度的整体水平也相对较低。提示低年龄组儿童对多糖疫苗的免疫应答水平较高年龄组儿童低，有关该疫苗人体接种后的安全性和免疫持久性的结果将另文报告。 A群脑膜炎球菌多糖疫苗自80年代在我国研制成功并广泛接种以来效果明显。我国A群带菌率和发病率大幅度下降，预防效果达90％以上。至今在我国引起流脑的脑膜炎球菌仍以A群为主，同时B群和C群的病例也开始出现。欧美国家主要流行菌群由A群转为B群和c群的事实。提示我们在A群脑膜炎被控制之后要防止B群和C群变迁。 1994年法国由法国巴斯德梅里厄血清疫苗研究所(PasteurMerreux)提供生产的A+C群脑膜炎球菌多糖疫苗，申请在我国注册，中国药品生物制品检定所与河南省卫生防疫站协作，在河南省新县进行了人群安全性与免疫原性的现场考核，现将结果报告如下该疫苗较安全，免疫原性较强，且更具免疫持久性。2000 A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研制2000杨丽华 (长春生物制品研究所，长春130062)李风祥(中国药品生物制品检定所， 本试验制备的A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的理化特性及免疫特性与国内外文献报道结果一致。制备的结合疫苗可诱导出高水平的保护性A群脑膜炎球菌多糖抗体和TT抗体。结合疫苗具有很好的免疫原性和安全性。制备工艺稳定，重复性好，可批量生产。本试验为进一步临床评价结合疫苗的人群免疫效果提供了实验基础。本试验选用Tr作为载体蛋白，因为这种蛋白目前已经标准化，作为载体蛋白的同时兼有预防伤风感染的作用，而用TT蛋白对于已经建立起的免疫程序和“自然”免疫并不产生干扰 A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备熊慧玲成都生物制品研究所 预防A群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎，我国目前采用A群脑膜炎球菌多糖疫苗，而疫苗接种后，小于1岁的婴儿，即使加强接种产生的抗体只能维持1年，1～1．5岁半的婴幼儿，加强后只能维持2年，1．5～2岁的幼儿，接种1针维持不到1年_l1 。wHO指出，按目前的免疫程序，婴儿在出生后5年内至少需要免疫接种4次才可提供中度抗体水平一。说明A群脑膜炎球菌多糖疫苗在婴幼儿中，尤其在2岁以下，免疫原性低，即使产生抗体，抗体水平也不能长久保持。因而提高疫苗免疫原性，使它能对各年龄组，尤其2岁以下婴幼儿提供高水平的长期保护作用，有特别重要的意义。b型流感嗜血杆菌结合疫苗的成功研制和应用给我们以深刻的启示。和流感嗜血杆菌荚膜多糖一样，A群脑膜炎球菌多糖为半抗原，为非T细胞依赖性抗原，当与蛋白结合后，可转化为T细胞依赖性抗原，可刺激机体产生高水平的保护抗体，重复接种有记忆抗体产生因此，我们进行了A群脑膜球菌多糖结合疫苗的研制，并对经中国药品生物制品检定所检定合格的连续3批 2003 流行性脑脊髓膜炎(流脑)被发现并确认已有l00多年．尽管对此病已有有效的预防和治疗措施，但它仍是一种急性传染病．而且病死率高、继续威胁着人类，尤其是儿童的身体健康。我国目前使用的预防制品是A群脑膜炎球菌多糖疫苗，该疫苗对4岁以上儿童有很好免疫效果，对幼儿免疫效果较差，保护时问较短。而脑膜炎球菌多糖与一种蛋白载体连接构成结合疫苗．可增强其对幼儿的免疫回忆反应，提高预防效果?。卫生部成都生物制品研究所已研制成功“A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗”，并由中国药品生物制品检定所、卫生部成都生物制品研究所、江苏省疾病预防控制中心联合于2002年l0月～2003年1月在江苏省射阳县进行的“A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗临床研究”已圆满结束。现将婴幼儿接种A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的安全性报告如下本次临床试验表明，3～4月婴幼儿接种A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗具有良好的安全性，但由于该疫苗首次应用于人群，在大规模推广接种前，仍需对其安全性进一步进行观察 C群脑膜炎球菌结合疫苗的质量控制与生产的科学挑战2004 世界卫生组织(WHO)生物制品标准化专家委员会于1976年通过了脑膜炎球菌多糖疫苗的建议，并于1978年和1981年进行了修订。在临床研究中，疫苗的有效率至少达9O% ，证明其在疫苗接种计划中高度有效。然而，不能在幼婴中诱生保护性应答或免疫记忆制约了其在英国婴儿免疫接种计划中的应用。随着b型流感杆菌(Hib)结合疫苗的成功引入，C群脑膜炎球菌(MenC)荚膜多糖结合疫苗的研究取得了显著的进展。临床对照试验已证实它们在所有年龄组中均可诱生针对MenC多糖的保护性水平的抗体，并且作为T细胞依赖性抗原，能诱导免疫记忆和抗荚膜抗体的亲和力成熟。英国引入MenC结合疫苗后，证实该疫苗可提供保护性免疫。WHO已经制定了有关这些新疫苗生产和检定的建议。 脑膜炎球菌是细菌性脑膜炎和败血病的重要病原。根据荚膜多糖在化学和血清学上的不同，脑膜炎球菌可分为若干群，其中A、B、C、Y、Wl35群对人致病。A群在
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)
1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理
材料与方法 样品 检测用试剂 1、Griess 试剂 溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。 溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。 格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上， 依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有 亚硝酸细菌存在。 2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在） 称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。 由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基 1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母粉 5g 蛋白胨 10g NaCl 10g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g 水 1000mL 灭菌前pH自然 硝化细菌培养基
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
硝化细菌的分离与鉴定 要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度 对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究 杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立? 华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079） E-mail: deliliu2002@https://www.doczj.com/doc/689805494.html, 摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究 1. 引言 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成N O或N2的过程。传统观点认为：反硝化细菌大 2 都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。 具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。 2. 材料与方法 2.1 培养基 富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。 反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。 BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。 基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
硝化细菌相关培养基： 1、富集培养基： 硝化细菌富集培养基： KNO2 0.5g; KH2PO4 0.07g; MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g; 蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0. 亚硝化细菌富集培养基： (NH4)2SO4 0.5g; KH2PO4 0.07g; MgSO4 7H2O 0.055g; CaCl2 2H2O 0.05g; 蒸馏水100ml; 用5%Na2CO3调pH至8.0. 2、分离固体培养基： 硝化细菌平板分离固体培养基： KNO2 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g； MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g； FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g； NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL； 琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0． 亚硝化细菌平板分离固体培养基：(NH4) 2SO4 0.05 g； K2HPO4 3H2O 0.13 g； MgSO4 7H2O 0.03 g； NaCl 0.12 g； FeSO4 7H2O 0.02 g； CaCO3 (MgCO3) 0.1 g； NaHCO3 0.2 g； H2O 100 mL； 琼脂：1.5—2.0g pH 7.5 ~ 8.0． 3杂菌检验培养基： （1）检查异养型细菌： 牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）：酵母粉：0.5g 胰蛋白胨：1.0g 氯化钠：1.0g 琼脂：1g (2)检查酵母菌： 豆芽汁葡萄糖培养基： 10%豆芽浸汁100ml 葡萄糖5g 琼脂1.5—2.0g 自然PH (3)检查霉菌: 马铃薯葡萄糖培养基: 20%马铃薯浸汁100ml 葡萄糖2g 琼脂1.5—2.0g 自然PH
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定 邵基伦环境工程专业 摘要：当今世界环境污染日益加重，尤其是水体污染已严重影响人们的日常生活与身体健康。水污染是多方面的因素综合作用，而以氨氮的污染最为广泛且严重。所以控制污水中的氨氮含量是污水处理中的重要内容。污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌的硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐。硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气等环节成分而释放到大气中，从而实现污水脱氮。硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌完成。硝化细菌是一类好样化能自养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。由于硝化细菌是化能自养菌，其生长速率很慢，因此硝化、亚硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。它们能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。因为硝化细菌、亚硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38 ℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L,低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外,碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。 本实验采用人工培养基方法富集培养硝化细菌．研究了富集培养过程中硝化与亚硝化细菌的结构和性质变化。结果表明，在25-28℃，pH7．5～8.5，D0 2-5mg／L，氨氮浓度100—150mg ／L条件下，经过19d和15d的富集培养，可以得到硝化速率为4.18mg(NH3-N)-[g(MLSS)/h]和10.1mg(NH4-N)-[g(MLSS)/h]的硝化细菌培养物．在这种富集培养过程中，硝化细菌培养物的污泥色泽和结构、MLSS、SV30、SVI、硝化强度和硝化速率等均出现规律性变化且随培养方法不同表现出明显差异。
奈瑟菌属 奈瑟菌属（Neisseria）是一群革兰染色阴性双球菌，是β-变形菌类的一属无芽孢，无鞭毛，有菌毛，专性需氧，氧化酶阳性。奈瑟菌呈球形，成对排列，形似咖啡豆的革兰阴性球菌，通常位于中性粒细胞内，而在慢性淋病时常位于细胞外，新分离株有荚膜和菌毛。 此菌属包括脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis）、淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae）、干燥奈瑟菌（N. sicca）、微黄奈瑟菌（N. subflava）、浅黄奈瑟菌（N. flavescens）、粘液奈瑟菌（N. mucosa）等。其中能引起人体发病的只有脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌。典型的标本涂片，镜下在中性粒细胞内可见到成双排列的脑膜炎奈瑟菌或淋球菌。其他奈瑟菌多为人体呼吸道中寄生的正常菌群。镜下观察时多存在于细胞外。奈瑟菌属细菌常可发酵多种糖类，产酸不产气。糖发酵试验可用于鉴别此属细菌。 脑膜炎奈瑟菌与淋病奈瑟菌遗传性上十分接近，DNA序列存在70%的同源性。主要不同点表现为：①脑膜炎球菌有多糖成分的荚膜，淋球菌分离初期有荚膜；②脑膜炎球菌菌体内很少有质粒，淋球菌可携带几种质粒；③脑膜炎球菌存在于呼吸道，引起脑膜炎，淋球菌引起泌尿生殖系统疾病。 脑膜炎奈瑟菌 生物学性状 1．形态与染色呈肾形或豆形，成双排列，两菌接触面平坦或略向内陷， 直径0.6-0.8 μm。人工培养后可成卵圆形或球形。革兰染色阴性。在 患者脑脊液中，多位于中性粒细胞内，形态典型。无鞭毛，无芽胞，新 分离菌株有荚膜。 2．培养特性营养要求较高，常用的培养基是血琼脂平板和巧克力色平板。专性需氧，初次分离培养须供给5%-10%的CO2。37℃孵育24 h后形成1.0-1.5 mm的无色、圆形、凸起、光滑、透明，似露滴状的菌落，无溶血现象。多数菌能分解葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气。氧化酶试验阳性。
一、实验目的 1. 了解并掌握稀碱法提取核酸的原理和方法。 2. 学习使用血球记数板测定微生物数量的方法。 3. 了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。 二、实验原理 核酸是一类不稳定的生物大分子，在制备过程中很容易发生降解。因此，要使制得的核酸尽可能保持其在生物体内的天然状态，制备核酸必须采用温和的条件。酵母核酸中RNA含量较多，RNA达 2.67- 10.0%,而DNA含量仅为 0.03- 0.516%,酵母核酸的提取方法较多,工业上一般选用成本较低、适宜于大规模操作的稀碱法和浓盐法。稀碱法是用1% NaOH溶液，将细胞壁溶解，用酸 中和,升高温度使蛋白质变性,将蛋白质与核酸分离,然后除去菌体,将pH 调至RNA 的等电点（pH 2.5）,使核酸沉淀出来。稀碱法的优点是抽提时间短,但核酸在此条件下不稳定,容易分解。 血球计数板法主要计数酵母、原生动物等个体较大的微生物,是计数一定容积中的细胞总数的常用方法。其型号分为X B.K. 25.和X B.K. 16. 两种,前者是一个大方格分成25 个中方格,而每个中方格又分成16 个小方格；后者为一个大方格分成 1 6个中方格,而每个中方格又分成25个小方格。但无
论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm,则每一个大方格的面积为1mm2,盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为 0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm3 （万分之一毫升）。 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA的紫外吸收高峰在OD260nm波长处。一般在OD260nm波长下，每毫升含1⑷RNA 溶液的吸光值为 0.022。故测定未知浓度RNA溶液OD260nm波长的吸光值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸等各组分，加入硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。磷酸与定磷试剂作用可以生成蓝色的钼蓝。核糖与地衣酚试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。嘌呤碱与硝酸银反应能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 三、试剂和仪器设备 1. 材料与试剂 酵母粉； 0.04mol/LNaOH;酸性乙醇：将0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇中；95%乙醇； 1.5mol/L硫酸；浓氨水； 0.1mol/L硝酸银。 定磷试剂：17%硫酸： 将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中； 2.5％鉬酸铵：
沙果和桃子中酵母菌的分离鉴定及其生物学特性研究 本试验利用常规分类学和WL培养基相结合的方法对沙果和桃子表面及发酵汁中的酵母菌进行初步分类。选择优质的酵母菌株进行发酵特性的研究。 筛选出具有代表性且性状优良的酵母菌株进行26SrDNA D1/D2区的 PCR/RFLP分析鉴定。研究结果表明：从内蒙古呼和浩特地区采集了两个沙果品种的20个样品,共分离出45株酵母菌,包括3个属,分别为Pichia(毕赤氏酵母属)、Candida (假丝酵母属)、Brettanomyces (酒香酵母属)；包括3个种,分别是Pichia sp.、Candida sake (清酒假丝酵母)、Brettanomyces intermedius(中间型酒香酵母)。 从内蒙古呼和浩特地区从市售水果店采集了五个桃子品种的50个样品,共分离出75株酵母菌,包括4个属,分别为Hanseniaspora (有孢汉逊酵母属)、Torulaspora(有孢圆酵母属)、Pichia (毕赤氏酵母属)、Saccharomycodes(类酵母属);包括4个种,分别是Hanseniaspora uvarum(葡萄汁有孢汉逊酵母)、Torulaspora delbruekii(戴尔有孢圆酵母)、Pichia kluyveri (克鲁维毕赤酵母)、Saccharomycodes ludwigii (路德类酵母)。从分离出的菌株中筛选8株酵母菌进行主要生物学特性分析。 耐受性试验结果表明,菌株D20和F1o具有相对突出的发酵性能,可以耐pH 值为2、糖浓度(w/w)为50、高温(℃)为41、S02浓度(mg/L)为330、酒精浓度(v/v)为16的环境中正常生长发酵。对菌株D20和Flo进行了酒精度和残糖量的酒精发酵试验,菌株Flo的酒精度为10.2%,D20的酒精度为9.5%。 残糖量试验结果,菌株Flo残糖量为2.3g/L,菌株D20的残糖量为3.3g/L。F1o的发酵性能较好于D20,但由于F1o和D20来源于不同样品,因此将两株菌同
一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml
琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧