尚珂 胡鹤 胡又佳
中国基因工程药物研究进展
有关作者： 尚珂博士，女，1980年生，现就职于上海医药工业研究院，创新药物与制药工艺国家重点实验室（筹），任助理研究员。2001年毕业于中国药科大学，2006年获上海医工院微生物与生化药学博士学位。主要研究方向：链霉菌基因工程；重大抗生素品种产生菌的基因工程改造。我国生物技术药物工业总产值至2006年为400~500亿元，仍然保持了高速的增长，新批准的进行临床研究和注册的基因工程药物及新剂型有17个，但其中大部分属于新剂型。创新药物的研究更多地体现在科研领域，尤其是在基因重组蛋白方面，无论是研究的创新性还是品种的多样性都体现了我国在基因工程药物研究领域所取得的长足进步。近年来有越来越多的研究结果发表在国外SCI收录的杂志上，引起了国际上广泛的关注。
1重组蛋白
1.1 活性多肽
1.1.1 志贺毒素抑制多肽
志贺毒素是痢疾志贺菌的主要毒力因子，是一种烈性蛋白质毒素。以制备的重组志贺毒素B亚单位(StxB)为靶标，利用噬菌体展示亲和淘选技术的4轮筛选，从随机十二肽库中筛选到与StxB结合的一批噬菌体克隆，对特异结合活性较高的27个噬菌体克隆的表面展示肽进行序列测定，克隆展示肽出现频率最高的A6噬菌体，在体外与志贺毒素孵育进行动物试验，动物存活率达33.3%，表明毒素的毒性得到部分抑制，A6短肽可能发展成为志贺毒素的拮抗剂[1]。
1.1.2 降钙素
降钙素是甲状腺滤泡旁细胞产生的一种多肽类激素，它是体内钙平衡和骨代谢的调节因子，鲑降钙素已经在临床上用于骨质疏松症，但需要反复多次的注射，且与人降钙素的同源性仅为50%，易产生抗体。将人降钙素在成肌细胞中进行表达，能持续表达人降钙素的细胞进行微囊包埋后仍能持续分泌重组人降钙素到培养液中，这为利用包埋的重组成肌细胞释放人降钙素以及进一步采用移植细胞来治疗绝经后骨质疏松提供了可能[2]。
降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)是从甲状腺髓样癌细胞中克隆发现的一种神经肽，由降钙素基因初级转录产物选择性剪接产生，属于降钙素(Calcitonin，CT) 超家族。CGRP 有两种分子异构肽：αCGRP和βCGRP。采用大肠杆菌偏爱的密码子人工合成hαCGRP 基因，构建了原核融合表达载体，对融合蛋白成功地进行了表达和纯化，Western免疫印迹验证该蛋白具有αCGRP 抗原性，为下一步hαCGRP 纯品的获得及动物实验的研究奠定了基础[3]。
1.1.3 葡萄糖依赖性促胰岛素多肽
GIP，即葡萄糖依赖性促胰岛素多肽或抑胃肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide or gastric inhibitory peptide)是由42个氨基酸组成的胃肠调节肽，具有广泛的临床应用价值。人工合成具有大肠杆菌偏爱密码子的编码GIP成熟肽的cDNA序列，利用pET32a(+)系统
进行原核表达。诱导表达的rhGIP占细胞总蛋白质的35%，纯化后的
rhGIP具有免疫活性，大鼠实验证实其具有抑制胃酸分泌和降低大鼠血浆血糖浓度的生理活性，并且对神经细胞有营养和保护作用[4]。
1.1.4 bFGF抑制多肽
bFGF，又称FGF-2，即碱性成纤维细胞生长因子。利用肽类新药开发的重要工具—噬菌体展示技术，以Balb/ c3T3细胞为靶标，以COS-7细胞作消减，对噬菌体随机七肽库进行4轮生物淘洗，再采用ELISA检测单克隆噬菌体对Balb/c3T3的亲和性和特异性，选取阳性克隆进行DNA测序分析。得到2段bFGF的受体结合模拟肽，有望作为bFGF抑制剂的先导肽，为bFGF肽类抑制剂的研发提供实验基础[5]。
1.1.5 人胰高血糖素样肽
人胰高血糖素样肽-1(human glucagon-like peptide-1
，hGLP-1)是肠降糖素( incretin )中的主要成分。将人工合成的hGLP-1基因插入质粒载体pET-32a(+)中，
构建成rhGLP-1与硫氧还蛋白(thioredox)及六聚组氨酸(hexahistidine)的融合表达载体pET32-GLP-1，转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株，经IPTG诱导表达及Ni 离子亲和层析纯化等步骤得到rhGLP-1样品，纯度大于90%，等电点介于pH5.2~pH5.85之间。动物实验表明重组蛋白具有明显的降血糖活性和促胰岛素分泌作用。该研究使通过基因工程方法在微生物中大量表达hGLP-1成为获得该肽的一种新途径[6]。
1.1.6 抗菌肽
传统的抗生素是通过抑制细菌的蛋白质或DNA的合成以及破坏细胞壁来发挥作用，其过程需要特殊受体，微生物很容易通过基因突变对药物产生抗性。抗菌肽作用机理不同于传统抗生素，一般是通过物理作用造成细胞膜的穿孔，不需要特殊的受体，不会导致抗药菌株的产生，因此极有希望开发成为新型的多肽类抗生素。昆虫抗菌肽是昆虫体液免疫的重要成分，具有分子量小、对热、广谱抗菌等特点。自从惜古比天蚕(Hyalophera cecropia)的蛹中分离出第一个昆虫抗菌肽天蚕素(Cecropin)之后，陆续又从家蚕、蚊虫等昆虫体内分离出了很多抗菌肽，它们基本都为碱性的阳离子多肽。 通过浸提、吸附、洗脱、层析等方法，配合杀菌活性检测手段，从家蝇蛆中分离纯化出一组弱酸性抗菌肽，对苏云金芽孢杆菌等革兰氏阳性菌和几种革兰氏阴性菌有强烈的杀灭作用，并有很强的耐热、耐冻融的特性。通过电洗脱进一步纯化出该抗菌肽MD7095，其分子量为7095Da，等电点为5.59，为一新肽，扫描电镜超微结构观察表明其杀菌机制主要是使细胞膜穿孔，内容物外泄，最终使细菌完全解体死亡[7]。 防御素(defensin)是抗菌肽中较为重要的一种，主要来源于上皮组织,是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的第一道防线。猪的β2防御素1 (porcineβ2defensin 1, PBD21) 广泛分布于消化道、呼吸道、肝肾等多种组织细胞内，在猪防御系统中有重要作用。根据已发表的猪β防御素1 (PBD-1) 氨基酸序列和酵母偏好密码子，在毕赤氏酵母中重组表达分子量约4.5 kD 的PBD-1，实现了PBD-1的分泌表达，体外抗菌研究表明，重组菌的培养上清对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性[8]。
将家蝇防御素(Defensin)基因克隆到真核细胞构建了重组表达质粒，以阳离子脂质体为载体转染非洲绿猴肾细胞株COS-7细胞，表达产物经亲和层析纯化后体外试验表明其对大肠杆菌具有明显的抗菌活性[9]。
Perinerin是一种分离自亚洲海蚕Perinereis aibuhitensis的结构新颖的抗菌肽，其对革兰氏阳性和阴性细菌均表现出强大的抑制作用；尤其对临床常见的耐药性绿脓杆菌更有明显的抑菌作用。采用巴斯德毕赤酵母表达系统，对海蚕抗菌肽perinerin进行分泌性重组表达, 并经超滤和阳离子交换层析进一步纯化。生物学活性检测证实重组蛋白对金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌均具有明显抑制作用[10]。 Hepcidin是2000年发现的一个主要在肝脏表达的含有8个半胱氨酸的小分子多肽，和许多富含半胱的抗菌肽类似具有显著的抗菌作用。重组融合hepcidin经金属螯合初步纯化后，先在cysteine / cystine氧化还原体系中氧化形成二硫键，再经凝胶过滤, 稀释复性，酶切后可得到重组hepcidin。总收率50% , 纯度大于95%。和先切除载体蛋白, 再氧化复性的方法相比, 这种方法可以节省50%肠激酶[11]。
1.1.7 内毒素结合肽
革兰阴性菌外膜的主要成分LPS是脓毒症发生的主要触发因子，其活性中心lipidA分子富含负电荷磷酸基团，构建带正电荷的肽类通过静电作用与其结合中和其毒性，可减少细胞因子释放。对一内毒素结合肽(EBP)进行突变，以期通过增加正电荷数来增加其抗内毒素活性，并诱导相应基因得到高效融合表达。酶切获得目的片段并分离纯化后纯度大于95%。为进一步研究其生物学功能奠定基础[12]。
1.1.8 线虫抗凝肽
线虫抗凝肽(nematode anticoagulant peptide, NAP)是自犬钩口线虫成虫体内分离得到的一系列具有抗凝作用的小分子多肽类物质，其中NAP5的抗凝活性最强。NAP5含77个氨基酸，通过与凝血因子Factor X/Xa的活性位点结合来抑制其活性，具有丝氨酸蛋白酶抑制作用，可抑制
凝血酶原酶的形成，在脓毒血症、弥散性血管内凝血、膝关节完全置换术后防治静脉血栓栓塞等急性血小板相关性动、静脉血栓的预防和治疗中具有良好的临床应用前景。在毕赤氏酵母中分泌表达重组线虫抗凝肽，酵母培养上清中的重组NAP分子量比预计分子量稍大，可能与糖基化有关。体外活性检测证实其有较强的抗凝活性[13]。
1.1.9 抗栓肽
抗栓肽(Decorsin)作为一种抗血栓药物，其作用靶标与水蛭素不同，水蛭素是凝血酶抑制剂，而抗栓肽是血小板聚集的抑制剂。它由39个氨基酸组成，其内部含有一个三肽Arg-Gly-Asp (RGD)序列，并且有三对保守的二硫键，重组表达量一般比较低，而且复性时易发生错配。用基因工程的方法获得抗栓肽基因并采取了与大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)基因融合表达的策略，在大肠杆菌中获得了可溶性表达，表达量占菌体总蛋白的35%。纯化的蛋白在体外实验中表明其具有显著的抑制ADP诱导的血小板聚集活性，抑制常数IC50为500nmol/L，完全抑制浓度≤2.5μmol/L，与天然抗栓肽活性相似[14]。
1.1.10 α1胸腺肽
α1胸腺素是分离自胸腺素F5的具有激活T-淋巴细胞的活性多肽，在治疗乙肝、丙肝、多种肿瘤及艾滋病等方面有潜在的疗效，但其在胸腺素F5中的含量只有0.6%，尽管α1胸腺素只有28个氨基酸，但化学合成的成本还是较高。将重组α1胸腺素在大肠杆菌中表达，在周质空间中获得了高效的可溶性表达，表达量占周质蛋白总量的64.7%[15].
1.1.11 水蛭素
水蛭素(hirudin)是从水蛭中分离出的抗凝血活性成分，是凝血酶的天然抑制剂，有多种变异体。运用DNA家族改组技术构建了噬菌体展示的水蛭素改组文库，经凝血酶亲和淘选，ELISA筛选得到了高活性的水蛭素变异体。将水蛭素变异体在大肠杆菌中进行重组表达，得到了一个活性高于野生型水蛭素HV2的突变子，并研究影响水蛭素活性的重要氨基酸位点[16]。
水蛭素作为新一代抗凝剂，有望在临床上取代肝素，但其会引起出血倾向副作用尚没有好的解决办法。依据血栓形成的生理生化机制，用PCR方法将凝血因子FXa识别氨基酸序列嵌合到水蛭素结构基因的氨基端，纯化的重组蛋白小鼠尾部血栓模型实验表明，此新型嵌合抗栓剂由于在水蛭素的N末端与凝血因子FXa识别位点的短肽相融合，使得融合蛋白在非血栓部位不表现出抗凝血活性，而在血栓部位，水蛭素被从融合蛋白上切割下来发挥抗凝血作用，这样可以在不减少水蛭素抗凝血活性的同时，大幅度地降低出血副作用，在临床上具有非常重要的意义[17]。
1.1.13 胰岛素模拟肽
胰岛素在治疗I型和II型糖尿病方面发挥了重要作用，但作为药物有其固有的缺点，比如蛋白质分子量大、易聚集导致效用下降、具有较强的抗原性等，而研究保留蛋白质生物活性位点的小肽可以在一定程度上克服生产和使用上存在的问题，不失为开发药物的又一途径。以胰岛素多克隆抗体为靶，对噬菌体展示随机C7C环肽库进行胰岛素相关肽的筛选，经过三轮筛选和ELISA结合，获得了两条序列，体外生物学活性检测表明小肽CPTSQANSC能够模拟胰岛素的功能，竞争性的抑制胰岛素与其受体的结合，体内实验表现出明显的降血糖作用。而另一小肽CVQPSHSSC则表现出胰岛素拮抗活性，会引起正常小鼠血糖升高。值得注意的是，胰岛素模拟小肽与胰岛素之间并没有同源性，或许是空间上模拟了胰岛素的结合位点从而具有降血糖功能，这或许在临床的糖尿病治疗中有潜在的应用价值[18]。
1.2 蛋白与细胞因子
1.2.1 天花粉蛋白
天花粉蛋白（Trichosanthin, TCS）是中草药天花粉的有效成分，有较强的抗HIV活性，存在于栝楼的块根中。从新鲜栝楼叶片中获取TCS基因组DNA，利用PCR技
术扩增其全长基因，经BamHI和EcoRI双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接，转化感受态E.coli DH5α，将所获阳性重组质粒转化感受态E.coli BL2(DE3)得到工程菌，经IPTG诱导表达并经Ni-NTA柱纯化后，得到大量均一的6His-TCS融合蛋白。实现了TCS在大肠杆菌中的高效表达，为通过基因工程方法研制具有抗HIV活性的药物奠定了基础[19]。
1.2.2 中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin
中性粒细胞蛋白酶抑制剂elafin是中性粒细胞弹性蛋白酶特异性抑制剂。通过逆转录PCR扩增获取elafin cDNA，定向克隆至穿梭质粒pPIC9K上。转至毕赤酵母GS115菌株中。检测重组蛋白免疫原性、抗蛋白酶活性。重组elafin在毕赤酵母系统中呈分泌性表达，产量及活性高，分离纯化简便。此表达系统的建立为其后续研究及临床应用奠定了基础[20]。
1.2.3 凋亡抑制蛋白Survivin
凋亡抑制蛋白Survivin 在恶性肿瘤细胞的药物耐受和
放化疗抗性及癌症复发中起着重要作用。成功克隆Survivin 蛋白的全长cDNA 并突变其活性的关键位点34位氨基酸的密码子， 与具有高效蛋白转导作用的HIV-TATm连接后在大肠杆菌中表达并纯化。获得了促癌细
胞凋亡的重组蛋白药物HIV-TATm-Survivin (T34A)，经离体培养人乳腺癌细胞B-Cap-37 和人胰腺癌细胞系SW1990 的试验, 显示了其较强的抑制癌细胞增殖和促进凋亡作用[21]。
1.2.4 凝血酶敏感蛋白
凝血酶敏感蛋白-1能够抑制动物体内肿瘤的生长。构建凝血酶敏感蛋白-1N端片段(TSF)的原核表达体系，从人脐静脉内皮细胞cDNA中扩增得到thbs1基因片段，获得了原核表达的重组TSF蛋白，测定重组蛋白的活性，结果目的蛋白对CD36阴性的ECV304细胞有增殖抑制作用。是一个具有临床应用前景的抗肿瘤辅助治疗方法[22]。1.2.5 Neuritin
Neuritin是一种新发现能促进神经突起和轴突分支的蛋白，对多种因素引起的神经系统损伤后突触和突起的生长具有潜在的治疗和预防作用。在已克隆Neuritin cDNA 的基础上PCR扩增出Neuritin ORF，插入原核表达载体pET32a后转化B121大肠杆菌，表达产物用SDS-PAGE 和Western blot证实并用镍离子亲和层析的方法获得了纯化的Neuritin蛋白[23]。
1.2.6 表皮分化蛋白
1-磷酸鞘氨醇活化的EDG-1(表皮分化基因-1)属于G蛋白受体家族，能激发细胞增殖、迁移、形态形成等多
种生理活动，并与血管发生、发炎和一些心血管疾病
有关系。将重组人EDG-1在毕赤氏酵母中表达，通过Western blotting和共聚焦显微观察证实重组蛋白表达在酵母细胞的质膜上，并且重组的EDG-1在体外能结合其配体1-磷酸鞘氨醇[24]。
1.2.7 PTEN抑癌蛋白
PTEN（phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10，PTEN）是具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌蛋白。研究尝试利用大肠杆菌表达有活性的PTEN蛋白。利用PTEN基因cDNA和原核表达载体pET44a(+)分别构建带6×His和Nus标签的两种诱导型原核融合表达载体pET-PTEN和pET-Nus-PTEN，分别在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)和Rosettagami(DE3) pLysS（RG）中诱导表达。在BL中目的蛋白的表达量较高(18.7%)。重组融合蛋白经Chariot转运入小鼠实体瘤及人前列腺癌DU145细胞。抑癌实验表明：与对照
组相比，重组PTEN蛋白对小鼠实体瘤的生长抑制率为58.76%；对癌细胞DU145的生长抑制率可达46.16%；并可导致明显的G0PG1期阻滞，其中在宿主RG中表达的重组蛋白抑癌效果明显高于BL宿主中表达的目的蛋白。实验证实在原核系统中表达的重组PTEN蛋白具有抑癌活性，同时制备了PTEN的高效价腹水多抗，为深入研究PTEN蛋白在癌症治疗中的应用打下了良好的基础[25]。
1.2.8 干扰素
β干扰素(Interferon beta，IFN-β)具有诱导细胞产生
多种抗病毒蛋白、增强自然杀伤细胞的活性、增加抗
原提呈细胞MHCI型分子表达以及抑制白细胞增殖等功能，在人类主要用于治疗多发性硬化症。为了研制高
活性的重组猪β干扰素,对PoIFN-β成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并
构建了酵母表达载体pPICZαA-PIB。经SacI 酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X233。阳性酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFN-β,其中B1株产量最高,约为2.5×105U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×106U/mg。经浓缩检测，表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIF-β阳性抗血清发生特异反应。重组PoIFN-β对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFN-β对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显[26]。
干扰素α是治疗慢性乙型肝炎或慢性丙型肝炎的首选治疗药物。以抗病毒活性最高的集成干扰素和毒副反应
最轻的干扰素α1b分子为模板，通过DNA Shuffling技术获得集成干扰素突变体Ⅰ( IFN-Con-m1)。以其为模板再利用重叠延伸法进行定点突变, 在86 位引入一个半胱氨酸(Cys)，获得兼具高活性和可用PEG定点修饰的集成干扰素突变体Ⅱ( IFN2-Con-m2)。研究中构建了IFN2-Con-m2的表达载体，并成功地在大肠杆菌中表达，获得了高活性突变分子IFN-Con-m2，建立了IFN-Con-m2的纯化工艺[27]。
通过比较14个α干扰素的亚型并在每个位点选用最常见的氨基酸获得的重组人共同α干扰素(IFN-Con1)是一个纯粹人工得到的α干扰素，它的抗病毒活性比天然的α干扰素要高5-10倍。进一步通过比较30种α干扰素的序列又得到两个IFN-Con1的突变子：cIFN (R164S)和cIFN (R22S, R164S)，他们对蛋白酶的抗性更强。将cIFN (R164S)在毕赤氏酵中表达，分泌到培养液的cIFN以非共价方式聚集，浓度达到每升1.24g，以变性剂去聚集后重组cIFN的抗病毒活性达到2.2×108IU/ml[28]。
胎盘干扰素(IFN-τ)2001年最初被发现是一种孕期识别激素，后被确定为一类不同于I型α、β、ω的新干扰素，具有与其他I型干扰素类似的生物活性，但无明显的毒副作用，并具有跨越种系的抗病毒作用。将585bp 编码195个氨基酸残基的IFN-τ基因在大肠杆菌中重组表达，包涵体经溶解，离子交换层析、硫酸铵沉淀、梯度透析及复性，纯化的重组IFN-τ纯度达90%以上，为进一步生物学研究打下了基础[29]。
用不同比生长速率的毕赤氏酵母研究了其表达重组人干扰素-ω的差异性，通过起始pH、甲醇诱导浓度和周期、菌体浓度、装液量等优化了对数生长期毕赤氏酵母表达rhIFN-ω的表达条件。结果发现比生长速率μ对其表达有显著影响，μ为0.1612h-1的毕赤氏酵在最适摇瓶表达条件下，rhIFN-ω的表达量达到1070mg/L，大大高于国外同类文献报道的400mg/L的水平，为在酵母中高水平表达重组人干扰素-ω提供了经验[30]。
1.2.9 tumstatin
人tumstatin是胶原蛋白Ⅳα3 链的C端包括非胶原区( non-collagenous domain，NC1) 在内约28kD大小的一个片段，能专一性地促进内皮细胞凋亡，抑制血管生成和肿瘤生长，其抑瘤作用可能超过内皮细胞抑制素。利用PCR 技术从重组质粒pET-3c-tum中扩增人tumstatin 的cDNA 片段，连入pPICZαA 酵母表达载体，重组质粒pPICZα-tum电激法转化毕赤酵母GS115。经表型鉴定、诱导表达筛选，得到可分泌表达人tumstatin 的重组酵母转化子，表达蛋白质的相对分子量约30kD，表达量约25mg/L。初步纯化产物具有免疫活性，能够抑制内皮细胞增殖，诱导其发生细胞凋亡，并能抑制鸡胚尿囊膜血管生成[31]。
1.2.10 脑钠素
脑钠素(BNP)是临床治疗代偿失调性心衰竭的有效药物。将脑钠素与组氨酸标签(His-tag)以及具有自我剪
切功能的Ssp dnaB微型蛋白质内含子进行融合表达。表达产物经Ni-Sepharose亲和层析及体外复性处理后，用CM_纤维素对复性产物进行了浓缩，并通过改变CM-纤维素柱内的pH及温度，诱导Ssp dnaB微型蛋白质内含子的剪切作用，使脑钠素从融合蛋白中释放并与载体蛋白(His-DnaB)分离，再经C4反相高效液相色谱法进一步纯化后，从每升培养液中获得了2.8mg纯度达97%的重组人脑钠素。体外活性测定结果表明，重组人脑钠素对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应，其EC50为1.94×10-6mg/mL[32]。
1.2.11 血管内皮生长因子
血管内皮生长因子（VEGF) 是血管内皮细胞特有的促血管生成调控因子，是阻断肿瘤血管形成比较理想的靶点。VEGF 在肿瘤系统的发展过程中,机体对其获得了免疫耐受，为了提高其免疫原性，打破机体的免疫耐受，应用PCR 介导的定点突变方法, 将其中对活性影响较
小的1 - 8 位和115 - 121 位两个肽段替换成破伤风毒素(TT) 的两个强表位肽段618 - 627 位和831 - 837 位，构建高效表达重组质粒。动物免疫发现突变体VEGF121′和VEGF121 有相近的免疫滴度，但前者抗肿瘤效果更显著[33]。 血管内皮生长因子(VEGF)有显著促进血管侧支循环的作用。可用于辅助治疗缺血性心肌病。利用RT- PCR 方法, 从人扁桃体组织中扩增人VEGF165基因，构建了其真核表达载体。应用脂质体介导的基因转移技术，转染至人胚肾细胞(293 细胞)。体内、外表达研究证实重组质粒的表达产物具有促血管生成的生物学活性, 为VEGF 基因治疗缺血性心肌病的研究提供实验基础[34]。
1.2.12 凝血因子IX
血友病B临床主要靠定期输新鲜血浆或人凝血IX因子（hFIX）浓缩剂进行治疗。以烟草作为表达系统，构建在花椰菜花叶病毒35S启动子驱动下含hFIX的植物双元表达载体，在烟草中表达人凝血IX因子。hFIX在转基因烟草叶片中的表达量为2. 5 - 8. 8ng/g·FW，并具有免疫活性[35]。
1.2.13 神经生长因子
神经生长因子(NGF) 对老年性痴呆，帕金森氏病及脑萎缩等神经性疾病有明显的治疗作用。以人胎盘组织总DNA为模板PCR扩增出人神经生长因子成熟肽基因。在大肠杆菌中NGF以融合蛋白形式表达，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的25%左右。每升菌液得到4. 56mg重组NGF蛋白。结果表明重组NGF具有免疫学活性及良好的生物学活性[36]。
1.2.14 血管内皮抑制素
血管内皮抑制素是胶原ⅩⅧ C-末端的一个片段，是有效的血管生成抑制因子。克隆人血管内皮抑制素的基因并用毕赤酵母进行表达。发酵液上清经凝胶一步层析产物纯度达到98％以上，纯化收率达到95％以上。能明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生长，并且能特异性地抑制bFGF刺激的人微血管内皮细胞的迁移。为应用人血管内皮抑制素治疗肿瘤奠定实验基础[37]。
1.2.15 凋亡素
凋亡素(apoptin) 由鸡贫血病毒vp3 基因编码,能特异地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有毒性。为了获得可转导入细胞内部的凋亡素，将人工合成的编码TAT 蛋白转导结构域的DNA 片段与凋亡素编码基因克隆入质粒pET-28a 内，在大肠杆菌内诱导表达，经纯化后加入体外培养的肿瘤细胞和正常细胞中，转导24 h 后, TAT-apoptin 已经由人肺癌Anip973 细胞的胞浆迁移进入胞核，转导48 h 后处理过的Anip973 细胞大量凋亡。表明融合蛋白在肿瘤治疗上有潜在的应用价值[38]。
1.2.16 芋螺毒素
芋螺毒素(CTX)是一类作用于离子通道的富含二硫键的多肽，其中ω-CTX MVIIA是一个有25个氨基酸，含有
6个半胱氨酸三个二硫键的阳离子多肽，是N型电压敏感型钙离子通道特异拮抗剂，具有很强的镇痛和舒缓神经作用。合成的CTX MVIIA(齐考诺肽)已经在美国和欧洲上市，用于严重和慢性的疼痛疾病。通过设计大肠杆菌偏爱的密码子，在大肠杆菌中表达了CTX MVIIA-GST 融合蛋白，纯化后注射老鼠显示其镇痛作用比玛琲强800倍[39]。
1.2.17 内皮他丁
内皮他丁是从鼠的内皮肿瘤细胞中分离到的胶原蛋白XVIII的C末端蛋白水解片段，共184个氨基酸，能专一性地抑制内皮细胞的增殖并进而抑制血管发生和肿瘤生长。将重组内皮他丁在大肠杆菌中进行可溶性表达，发现表达的重组蛋白会自发地形成多聚体，体外实验表明在低剂量的情况下，单体和多聚体的重组内皮他丁的生物活性相似，但与对照相比均有很高的抑制细胞增殖的作用。而在剂量>0.6μg/ml的情况下，多聚体的生物活性要比单体高50%以上[40]。
将重组人内皮他丁进行PEG修饰，结果发现PEG修饰的重组人内皮他丁比不经PEG修饰的重组内皮他丁稳定性更好，而使用PEG修饰的重组内皮他丁只需一半的剂量就能达到不经PEG修饰的重组内皮他丁的肿瘤抑制活性，表明PEG修饰不仅增加了重组内皮他丁的稳定性，更增强了其抗肿瘤活性[41]。
1.2.18 白细胞介素
人白细胞介素 - 29是2003年最新被发现的细胞因子，隶属于IL-28家族。由于还缺乏有效的手段来获得大量的纯的IL-29，对于它的功能还不知道，其在疾病中扮演的角色也不清楚，但一些研究表明IL-29能保护细胞免受病毒感染，还能提高细胞免疫水平、抑制细胞的增殖以及诱导树突状细胞的成熟。将IL-29在大肠杆菌中表达，并与NusA蛋白、组氨酸标签、S多肽标签融合并引入凝血酶切割位点，通过亲和层析纯化表明IL-29的重组表达量约为每升菌液60mg。重组IL-29与IFN α-2b的抗病毒活性相当[42]。
白细胞介素-18具有强烈的IFN-γ诱生能力、增强NK 和CTL细胞活性、促进T细胞增殖、诱发Th1、Th2类细胞因子产生，促进免疫细胞表达FasL、增强Fas介导的细胞毒作用，在抗肿瘤、抗感染方面具有潜在的应用价值。RGD肽是一类含有Arg-Gly-Asp序列的肽，除了能抗血小板聚集外，还能抑制肿瘤细胞粘附、肿瘤细胞转移和肿瘤新血管生成，因此具有干扰肿瘤细胞的侵袭、迁移过程的活性。利用点突变及DNA重组技术，在人IL-18的第39位精氨酸和第40位的天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基，人为地构建了一个RGD模体，并在毕赤氏酵母中表达，纯化的重组蛋白体外显示对黑色素瘤细胞株B16的抑制作用明显，而体内实验的结果说明IL-18-RGD比IL-18的作用强，同时对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用也比对照IL-18更强，同时保存了对PBMC诱导产生IFN-γ的能力，说明重组的IL-18-RGD在具有抗炎、抗感染作用的同时增加了抑制肿瘤血管生成的新功能[43]。
1.2.19 胰岛素样生长因子(IGF)
类胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)的氨基酸序列与胰岛素原具有一定的结构同源性，能介导生长激素的促生长作用，也具有胰岛素那样促合成代谢活性，是一种多功能细胞调控因子，对多种组织器官有生物学作用，其可以促进成骨细胞的增殖与分化、加速骨形成，对骨质疏松症具有潜在的治疗作用。另外还发现IGF与肿瘤的发生有密切的关系。IGF已在临床上用于治疗糖尿病、胰岛素抵抗综合症、侏儒症及神经系统疾病等多种顽症，取得了良好的效果。IGF-1为70个氨基酸的单链蛋白质，含3对二硫键，将重组的IGF-1与一段截短型半乳糖苷酶及His-tag融合表达，包涵体经亲和层析纯化后在小分子保护剂及GSH-GSSG存在下复性，复性率达60%以上，纯度达90%以上，得到了具有较高生物活性的重组IGF-1[44]。
1.2.20 人生长激素
人生长激素(hGH)是主要由垂体前叶嗜酸性料细胞分泌的含191个氨基酸的疏水性球蛋白，它的主要生理作用是促进生长、蛋白质合成和影响脂肪、糖及能量代谢，它能作用于T淋巴细胞，从而调节炎症反应，并能用于多种心血管疾病的预防和治疗。构建了能表达重组人生长激素的慢病毒载体，并在骨骼成肌细胞中进行了表达，结果显示转染了重组质粒的细胞培养至第8周rhGH 仍持续稳定表达，并且获得的rhGH具有较强的促进肝细胞分泌IGF-1的能力。将hGH基因通过慢病毒载体的介导，实现了其在鼠骨骼肌成肌细胞中长期表达并稳定分泌，能克服传统的注射方法其半衰期短、无法保持足够有效的血药浓度的弱点[45]。
1.2.21 蝎毒素
作用于可兴奋细胞Na+通道的蝎毒素(Na+通道神经毒素)是蝎中引起动物麻痹或致死的主要成份，由60~76个氨基酸组成，含有4对二硫键，分为α和β两类。根据所筛选到的1个α钠通道蝎毒素BmKT的序列，设计引物以蝎总基因组DNA为模板，获得了4个BmKT的同源基因BmKT、BmKTa、BmKTb、BmKTb’，它们的内含子大小不同，但均符合GT/AG拼接规律。由于目前对蝎毒素的研究工作主要集中在毒素的分离纯化、比较、功能鉴定上，对那些蛋白质初级、高级结构相似但功能却有很大差异的研究较少，该项基于蝎基因组水平的研究对基因的进化或表达调控可能具有指导意义[46]。
1.2.22 Gelonin
Gelonin是来源于植物的一种细胞毒蛋白，由251个氨
基酸组成，分子量约为28KD，通过抑制蛋白质生物合成导致细胞死亡。由于它属于单链核糖体失活蛋白，因此它对真核细胞的毒性较低，常被作为免疫毒素的毒蛋白，用于研究或治疗自身免疫疾病或恶性肿瘤。根据gelonin的二级结构预测及三维空间构象，将其N
端的三个氨基酸Gly、Leu、Asp和C端的五个氨基酸Asp、Lys、Asp、Pro、Lys分别删除，表达和纯化了3种截短型gelonin (G-N3、G-C5、G-N3C5)，结果表明完整型gelonin (G-0)与截短型gelonin的分子构象有明显的差异，他们的类DNase活性与抗肿瘤活性均为G-0≥G-N3>G-C5>G-N3C5，证实了构象变化与生物活性的关联性[47]。
1.2.23 骨形态发生蛋白
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一类广谱性的蛋白质生长调节因子，对骨组织、心脏及生殖系统等多种组织器官的决定与分化起重要作用。采用毕赤酵母（P. pastoris）表达系统进行了hbmp7的重组表达。通过重叠延伸PCR(Overlap extension PCR，OE-PCR)将人hbmp7成熟肽编码序列中的3个酵母低频使用的精氨酸密码子改造为高频使用的同义密码子，显著提高了hbmp7 成熟肽的表达水平。所得重组BMP7成熟肽仅以单体形式存在，具备良好的免疫原性，纯化后的样品能异位诱导间充质细胞分化形成软骨细胞[48]。
高思红等实现了rhBMP-4在大肠杆菌中的高效表达。在不改变氨基酸序列的前提下，以全基因合成的方
式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变，将之
重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌BL21 (DE) plysS。IPTG诱导和包涵体复性后，利用C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性。该研究获得了能够高效表达具有生物活性的rhBMP-4 蛋白的大肠杆菌菌株，为进一步药物研制以及临床应用奠定基础[49]。
1.3 融合蛋白
由于将两个活性蛋白融合以获得更好生物学活性的研究日趋增多，在此特意将融合蛋白的研究单独列出。
1.3.1 IFN-α与HSA融合
I型IFNα是临床广泛应用的抗病毒和免疫调节类药物，但其血浆清除率太快。人血清白蛋白( Human serum albumin，HSA) 是体内因子和药物转运的天然载体，肾清除率非常低。为了延长IFNα2b在血浆中的半衰期，构建了编码HSA和hIFNα2b的融合基因并在毕赤酵母中获得高效表达，工程菌经5L发酵罐培养后经几步分离纯化和浓缩，融合蛋白的纯度达到95%以上。该融合蛋白能与干扰素抗体和人血清白蛋白抗体结合，并表现出与重组干扰素α2b相似的抗病毒活性。以猕猴为动物模型，证实IFNα2b与HSA融合后，血浆半衰期有了明显的延长，显现了其良好的临床应用前景[50]。
1.3.2 抗菌肽与haFGF的融合
皮肤伤口很容易受到细菌感染而影响愈合。研究将具有抗菌功能的杂合肽和具有皮肤修复功能的人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）融合在一起：利用PCR技术扩增出带有凝血酶Xa因子切割位点的天蚕素蜂毒素杂合肽和aFGF的融合基因，插入大肠杆菌表达载体pET-3c 中，构建出表达质粒pET-aF-CM，转化至大肠杆菌
BL21 (DE3)中，IPTG诱导表达并纯化，得到电泳纯的融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。并深入研究了融合蛋白的增殖活性和Xa 因子切割以后杂合抗菌肽对多种人致病菌的抑制活，为日后开发出一种既能杀菌又能促进伤口愈合的新型药物奠定了基础[51]。
1.3.3 G-CSF与HSA的融合
人粒细胞集落刺激因子( hG-CSF)在肿瘤放疗、化疗引起的粒细胞减少症、再生障碍性贫血、放射病等血液病的治疗及骨髓移植方面具有重要作用。为了延长人粒细胞集落刺激因子G-CSF半衰期，利用甲醇酵母表达重组人血清白蛋白融合的集落细胞刺激因子(rHSA-G-CSF)。工程菌经发酵罐培养表达,层析法分离纯化融合蛋白。纯化的融合蛋白经Western印迹分析表明具有HSA和
G-CSF的免疫原性。体内动物实验研究表明，经HSA融合的G-CSF的半衰期为G-CSF单体的15－20倍，有良好的临床应用前景[52]。
1.3.4 葡激酶与水蛭素的融合
葡激酶( SAK)能与纤溶酶原1∶1结合后能激活纤溶酶原，产生的级联反应发挥溶栓作用。水蛭素(HV)是凝
血酶的特异性抑制剂但有一定的出血倾向。重组融合蛋白SFH是葡激酶和水蛭素通过Xa 因子连接起来的蛋白
多肽，有着很好的溶栓和抗凝功能，出血倾向降低，且具有一定的血栓靶向性。采用溶氧反馈的分批培养流
加补料的方法高密度培养重组大肠杆菌BL21 (DE3)生产SFH，菌体密度最终达到115g/L以上，可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上,含量约为1. 1－1. 2g/L[53] 。
1.3.5两个抗菌肽的融合
来自于植物、无脊椎或脊椎动物自身免疫系统的阳离子抗菌肽为滥用抗生素引起的耐药性问题带来了新的解决方案，天蚕素是第一个被发现的抗菌肽，而马盖宁则是第一个临床应用的抗菌肽，天蚕素1-8个氨基酸和马盖宁的1-12个氨基酸已被证明具有广谱和强抗菌活性。将
这两段多肽通过基因工程的手段进行融合，并在毕赤氏酵母中表达，表达量为每升菌液22mg，重组融合多肽的分子量为2.6KDa。抗菌实验表明该融合多肽对真菌、格兰氏阴性菌、格兰氏阳性菌都有活性，显示了进一步的开发价值[54]。
抗菌肽Pexiganan和IB-367分别属于两栖类抗菌肽和哺乳动物抗菌肽。在国外Pexiganan和IB-367都已进入临床研究阶段，分别用于治疗糖尿病足感染和口腔感染。人工合成了这2种抗菌肽基因，构建相应GST融合表达载体，在大肠杆菌中进行表达，以融合蛋白的形式获得了两种小分子多肽[55]。
1.3.6 TNF受体与血管活性肠肽的融合
可溶性肿瘤坏死因子受体II( sTNFR II)和血管活性肠肽(VIP)对类风湿性关节炎(RA)均有治疗作用，但两者的作用机制不同。制备两者融合蛋白，可能具有更好的防治类风湿关节炎的作用。用PCR扩增出由连接序列将VIP和sTNFR II基因连接的片段，再在大肠杆菌DH5α内诱导表达。表达产物经分离纯化及活性检测，结果显示融合蛋白具有较好的抑制炎症分子诱导的炎症反应生物活性[56]。
1.3.7 VEGF与抗菌肽的融合
血管内皮生长因子（VEGF）具有促进血管内皮细胞增殖、血管生成等功能。VEGF特异性受体在肿瘤组织中高度表达。通过VEGF与其受体的特异结合，可以将某些细胞毒素带到肿瘤新生血管，从而发挥抗肿瘤作用。在大肠杆菌中高效表达并纯化血管内皮生长因子异构体VEGF121与抗菌肽KLAK的融合蛋白，用RT-PCR法扩增目的基因，在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白。对产物进行SDS-PAGE及Western印迹分析。结果表明高效表达并纯化了融合蛋白VEGF121-KLAK。为进一步研究其抗肿瘤血管形成作用奠定基础[57]。
1.3.8 TPO与SCF的融合
血小板生成素(TPO)是主要的促进巨核细胞形成的调节因子，成熟的TPO由332个氨基酸组成，其中N端的153个氨基酸是受体结合区域。干细胞因子(SCF)能促进红细胞生成并与其他细胞因子发挥协同增效作用。将TPO 的1-157个氨基酸与SCF的1-145个氨基酸通过一段多肽GGGGSPGGSGGGGSGG相连，在大肠杆菌中表达量占总蛋白的6%，如与分子伴侣共表达还能提高表达量四倍。纯化后的重组融合蛋白显示能刺激TF1和Mo7e细胞的增殖，融合蛋白与TPO相比，ED50对TF1细胞和Mo7e 细胞分别提高79%和20%[58]。
1.3.9 降钙素与生长肽的融合鲑降钙素(Salmon Calcitonin, SCT)具有抑制骨骼重吸收，而骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide, OGP)则能促进骨骼形成，都是治疗骨质疏松的药物，但单独使用都有缺点，比如需要使用较长时间才能对骨质疏松症有较好疗效，而且一旦停止用药，治疗效果会很快消失。将SCT和OGP在酵母中融合表达，获得了可溶性重组蛋白，体外实验显示重组SCT-OGP可以促进成骨细胞和成纤维细胞增殖，而体内实验则证明该融合蛋白可以提高碱性磷酸酶活性和降低血钙，具有抑制破骨细胞和刺激成骨细胞增殖的活性，同时通过两个方面来调节骨骼的生理状态，使骨骼向富集的方向发展，在治疗骨质疏松症方面具备良好的应用前景[59]。
1.4 酶
1.4.1 HIV整合酶
HIV-1整合酶是HIV病毒复制中一个重要的酶，也是
治疗艾滋病药物的一个重要靶点。为了开展以整合
酶蛋白为靶点的抑制剂筛选，通过重叠PCR技术引入
F185K和C280S突变于HIV-1B亚型标准株的整合酶cDNA片段中，PCR扩增片段克隆到pET-28a(+)表达载体中，构建重组质粒，在E.coli中获得高效稳定的可溶性表达。SDS-PAGE鉴定表达产物，亲和层析纯化蛋白，ELISA实验证实该蛋白具有整合酶的3’切割DNA 和5’链转移的活性。该研究为建立以整合酶为靶点的抗HIV药物筛选平台打下了基础[60]。
1.4.2 蚯蚓纤溶酶
蚯蚓纤溶酶具有抗凝、纤溶和溶栓作用，从赤子爱胜蚓( Eisenia foetida) 中克隆到一条蚯蚓纤溶酶新基因EfP-0。与已报道的蚯蚓纤溶酶基因之间的相似性均低于40 %，因此为蚯蚓纤溶酶中的一个新基因。在大肠杆菌中获得融合蛋白MBP- Ef P-0 的可溶性表达，产物有酪蛋白平板溶解活性[61]。
蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme, EFE)是从蚯蚓中分离纯化出的一组蛋白水解酶，与链激酶和尿激酶相比，具有更好的溶栓应用前景。但EFE是多种同工酶的混合物，至少有6种不同的组分。通过RT-PCR从赤子爱胜蚓中克隆到1个蚯蚓纤溶酶基因，经DNA序列分析表明，其编码区为735bp，共编码245个氨基酸，成熟序列为238个氨基酸，与GenBank中报道的多条EFE基因序列具有高度同源性，为用基因工程的方法生产单一成分的高酶活性EFE奠定了基础[62]。
1.4.3 蛇毒纤溶酶
Alfimeprase是Fibrolase的突变体，是一种蛇毒纤溶
酶，有纤溶活性而无出血性。利用PCR的方法合成
Alfimeprase DNA 序列，分别融合在NusA和MBP的C 端，与分子伴侣FkpA在大肠杆菌中共表达，融合蛋白NusA/Alfimeprase以部分可溶的形式存在，可溶部分占上清总蛋白的25%左右，纯化后得到具有纤溶活性的重组蛋白Alfimeprase[63]。
1.4.4 基质金属蛋白酶
对肿瘤浸润转移机制进行的研究发现细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解是肿瘤侵袭和转移
的关键步骤，而ECM的分解代谢与基质金属蛋白酶(MMPs)的活性表达密切相关，MMPs活性的调节决定了ECM的降解程度。MMP-9是一种与肿瘤发生、发展及侵袭、转移密切相关的基质金属蛋白酶，其作用底物IV 型胶原是基底腊屏障结构的主要成分，临床上把它作为一种新的标志物，判定肿瘤的发生和发展。以体外培养的鹌鹑成肌细胞QM-7作为宿主细胞，建立了人MMP-9的骨骼肌细胞表达体系。表达的重组蛋白可以降解明胶，具有生物活性，为以MMP-0为靶分子筛选特异拮抗剂奠定了基础[64]。
2 重组疫苗
2.1 避孕疫苗
卵透明带(zona pellucida，ZP)是卵泡发育过程中由卵母细胞和颗粒细胞分泌的一种酸性糖蛋白，主要参与受精过程的精卵识别、阻止多精子受精和诱发顶体反应。早期的免疫研究工作表明ZP抗原组分是发展孕前型避孕疫苗的一种理想靶抗原。将编码天然提取pZP3α上的DNA 序列(446－1423) 插入至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上，重组质粒pPICZαA-pZP3α线性化后通过电穿孔转入毕赤酵母GS115，工程菌高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3 抗体反应的46kD成分，命名为rpZP3α，平均产量为8m/L，纯度达92 % ，回收率63 %。该研究用酵母表达系统成功表达了rpZP3α，保留有天然pZP3的免疫活性[65]。
2.2 疱疹病毒疫苗
疫苗是防治单纯疱疹病毒HSV-2 感染重要手段之一，但单独采用抗原治疗作用较弱。结核杆菌热休克蛋白70 (Hsp70) 具有很强的抗原性，能够发挥类似免疫佐剂的作用。研究将Hsp70和HSV-2gD蛋白基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1，构建成重组质粒pGEX-4T-Hsp70-gD，转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达并免疫BALB/c小鼠，可以刺激小鼠产生有效的细胞免疫和体液免疫应答，为研究以Hsp70作为疫苗载体，HSV-2gD为靶点的疫苗提供实验依据，并为其在临床的应用打下了基础[66]。2.3 黄热疫苗
黄热疫苗是一种减毒的黄热病毒17D(YF-17D)活疫苗，是现有疫苗中最安全、最有效的疫苗之一。用RT-PCR 法扩增出覆盖YF-17D全长基因组的3个cDNA片段：5’cDNA(A)、3’cDNA(B)和中间cDNA(C)，同时引入SP6增强子序列、酶切位点和重复序列。顺序将A 和B 同E. coli-yeast 穿梭质粒pRS424 连接，再与C共转染酵母菌，利用缺少色氨酸和尿嘧啶的选择性固体培养基筛选出含YF-17D全长基因组的cDNA质粒。以该质粒为模板，经过DNA重组和酵母同源重组，获得含有口蹄疫病毒蛋白水解酶2A 片段的重组YF-17D 表达载体。体外转录后，电击转染BHK-21 细胞。间接免疫荧光检测结果表明，RNA 转录体在BHK-21细胞中进行了稳定的表达；滴度测定与形态学观察结果表明，重组病毒在细胞中的生长曲线等特征同母本YF-17D十分相似。结果提示，利用酵母菌同源重组在2A 部位引入异种抗原基因，重组YF-17D 表达载体pRS-YF-2A1 具有成为高效活疫苗表达载体的潜力[67]。
2.4 人巨细胞病毒
人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV) 是一
种β亚科疱疹病毒，在人群中感染非常普遍。HCMV UL83基因编码一种分子量为65kDa的被膜磷蛋白(phosphoprotain 65，pp65)，不仅是HCMV病毒血症
的主要抗原，而且是HCMV 特异性细胞毒性T 细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL) 的主要靶蛋白。采用
基因重组的方法，将HCMV AD16株截短UL83基因定向克隆到带有绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因的载体pEGFP-C1上，构建真核重组表达质粒pEGFP-C1-UL8；脂质体转染至Hep-2 细胞中，经RT-PCR 和Western blot检测证实其可稳定表达。并在HCMV先天性感染小鼠模型上进行免疫保护试验。初步结果表明，pEGFP-C1-UL83具有较好的免疫原性，可作为DNA 疫苗刺激机体产生有效抗体，并具有阻止病毒垂直传播的保护性作用[68]。
2.5 HCMV病毒疫苗
HCMV UL32 基因编码的磷蛋白pp150是急性感染的最
佳血清学标志物之一。HCMV UL57 基因编码的蛋白是HCMV IgM抗体检测的主要抗原。以HCMVAD169病毒株基因为模板，经PCR扩增了UL32基因和编码MDBP 蛋白片段的UL57基因，分别克隆至pMD18-T载体，再经酶切与表达载体pET-11a连接构建出融合基因表达载体，转入大肠杆菌BL21，经诱导表达得到融合蛋白pp150/MDBP，相对分子量约为27kD，表达量约占菌体蛋白的17.45%
，ELISA及蛋白芯片检测表明融合蛋白具有良好的抗原性，经过初步应用表明其对血清IgG及IgM的检出率与全抗原相比一致，具有进一步开发应用的价值[69]。
2.6 HPV治疗性疫苗
高危型人乳头瘤病毒（HPV）是宫颈癌的主要病因，自宫颈癌高发现场分离到的毒株—HPV16z中获得E6 /E7转化基因片段，经过定点突变修饰后连接卡介苗菌株中的Hsp65基因片段，构建融合蛋白表达质粒，在大肠杆菌中以包涵体的形式表达的目的蛋白，经二步纯化目的蛋白纯度达到95%，为HPV16型的治疗性无佐剂蛋白疫苗的进一步功能研究奠定基础[70]。
2.7 结核疫苗
ESAT6和CFP10抗原是结核分枝杆菌的早期分泌性低分子量蛋白，能诱导机体产生强烈的T细胞免疫应答和释放高水平IFN-γ。以结核杆菌H37RV基因组为模板克隆cfp10基因，将其插入载体后与esat6基因连接，构建重组质粒。以电穿孔方法转化至耻垢分枝杆菌疫苗载体。获得能表达ESAT6-CFP10融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌，为结核病的预防奠定了一定的基础[71]。
目前结核病基因疫苗的免疫保护效果不如卡介苗，而白细胞介素12(IL-12)在体内外均能高效激发并维持早期Th1型细胞应答，作为结核病疫苗的佐剂，能增强细胞的免疫应答。将结核分枝杆菌Mtb8.4的成熟基因构建的重组质粒作为基因疫苗与表达人白细胞介素12的重组质粒联合免疫小鼠，结果表明，联合免疫组能诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答，免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-γ和IL-2的水平显著高于Mbt8.4单独基因免疫组，与卡介苗组相当，IL-4分泌减少，特异性CTL杀伤活性增强，对小鼠结核杆菌感染有更好的免疫保护效果，使小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数显著减少，组织病变明显减轻[72]。
结核病至今仍是世界上一个严重的公共卫生问题，由于人口流动，结核分枝杆菌(MTB)感染和结核病发生率有上升趋势，给全球结核病防治提出了新的挑战。通过PCR扩增了结核分枝杆菌Rv3369基因并在大肠杆菌中进行表达，重组蛋白基本为包涵体，表达量为每升培养液15.6mg，约占菌体总蛋白的18%，纯度为90%以上，为更深入地研究Rv3369蛋白的免疫学特性，研究更有效的结核病免疫诊断试剂或者疫苗打下基础，同时也为该蛋白是否可以作为复合抗原的一个组分提供依据[73]。
2.8 尼帕病毒疫苗
尼帕病毒(Nipah Virus, NiV)为副粘病毒科副粘病毒亚科的成员，是导致高死亡率的急性发热性脑炎的尼帕病毒脑炎的罪魁祸首。NiV的囊膜功能糖蛋白受体结合蛋白F与融合蛋白G是病毒的主要结构蛋白，在病毒侵入宿主细胞的过程中共同作用介导细胞膜发生融合，同时也是诱导中和抗体的主要免疫原。通过构建表达NiV F 蛋白和G蛋白的重组杆状病毒，其昆虫细胞表达产物与NiV全病毒免疫阳性血清具有良好、特异的免疫反应原性，以重组病毒感染昆虫细胞培养物直接免疫BALB/c 小鼠，可诱导显著的NiV F蛋白和G蛋白特异体液免疫反应。因此，杆状病毒表达重组F和G蛋白抗原具有替代NiV全病毒，作为安全、经济、敏感和特异的诊断抗原的潜力，并为重组病毒亚单位疫苗防制尼帕病毒性脑炎的探索研究奠定了基础[74]。
2.9 乙肝疫苗
有10%的人群对由乙肝表面抗原(HBsAg) 主蛋白(S) 制成的重组疫苗无应答或应答低下。在疫苗中加入前S 抗原成分则有可能克服这种不应答或低应答的情况。在成功构建羧端含前S1 (20-47) 免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因( SS1) 和羧端含前S2 (Met1-Gly26 ) 免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因(SS2)基础上进一步构建了同时表达SS1、SS2 两种多肽，preS1、preS2 和S 三种抗原的毕赤酵母工程菌株。ELISA 及Western blot 结果显示，产物同时具有S、前S1 和前S2 抗原性。纯化抗原经SDS- PAGE 分析, SS1 和SS2多肽仍然保持完整, 基本无降解[75]。
HBcAg由183－185个氨基酸组成，在病毒复制期间可以自主装配成一个由180或240个亚基组成的规则正20面体颗粒结构。其作为一种T细胞依赖性和T细胞非依赖性抗原，可以激发机体产生强烈的Th1型免疫反应以及CTL 反应。前S1抗原在T和B细胞水平均具有免疫原性，能够诱导出有效的细胞和体液免疫反应。构建、表达并纯化了HBcAg与HBsAg前S1表位肽融合蛋白BTcs1，为开发新型HBV治疗和预防性疫苗提供实验依据[76]。
乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcAg)由于含有多个能够激发机体细胞免疫和体液免疫的抗原表位，被认为在乙型肝炎治疗性疫苗的开发和其他疫苗分子佐剂方面具有很大的潜力。研究了重组乙型肝炎病毒核心蛋白的表达条件，在大肠杆菌中实现了可溶性表达，再使用离子交换和分子筛进行层析纯化，得到了纯度为98.9%、抗原性较好、产生抗体滴度高的抗原蛋白，为大量制备HBcAg蛋白提供了简便高效的方法[77]。
乙肝病毒前S2蛋白(HBV PreS2)是包膜蛋白大蛋白和中蛋白的组成成分之一，在人体血液中多聚人血清白蛋白(PHSA)介导下，促使HBV与肝细胞表面的PHSA受体结合，是HBV嗜肝性感染的重要机制之一。HBV PreS2蛋白含有T细胞和B细胞表位，能诱导机体产生保护性免疫应答，是组建新型乙肝疫苗和慢性乙肝与肝癌免疫治疗药物的重要成分。HBV PreS2蛋白是由165个碱基编码的55个氨基酸残基组成，在真核细胞和酵母中表达效率
不高，采用pMAL-2x系列融合表达载体，分别在大肠杆菌的细胞质与细胞周质中表达HBV PreS2-MBP融合蛋白，结果发现在细胞周质中表达的HBV PreS2-MBP 融合蛋白在转运过程中被蛋白酶降解，而细胞质中的表达产物为完整的融合蛋白，且表达量较高，说明HBV PreS2适合在细胞质中进行表达，但所表达的融合蛋白仍然存在两种形式：包涵体和可溶性蛋白，尚需进一步对表达条件进行优化[78]。
2.10 抗GnRH疫苗
哺乳动物生殖的一个主要的调节因子绒促性素释放激素(GnRH)被广泛研究用于抗生育药以及肿瘤的免疫治疗等，在依赖激素的免疫性疾病的治疗中可能会发挥比较大的作用。但以前的研究发现GnRH的免疫原性比较弱，要得到较高浓度的抗体需要多次免疫。通过基因工程的手段设计了一段嵌合肽，将三段重复的GnRH序列与麻疹病毒T细胞表位蛋白通过人IgG1连接区相连，在大肠杆菌中表达，纯化的重组蛋白在小鼠中获得了很高的抗体产生，可能被用来产生新的抗GnRH疫苗[79]。2.11 霍乱疫苗
霍乱毒素无毒部分B亚单位(cholera toxin B subunit, CTB)是一种良好的载体分子，连结于CTB的抗原能长时间地与肠道集合淋巴小结等处的免疫活性细胞接触，使之发生识别，从而产生针对口服抗原的免疫耐受效应。以1型糖尿病为例，通过口服抗原能诱导免疫耐受，但需要大剂量抗原或长期给予小剂量抗原来维持，且抗原剂量只在一个相当狭窄的范围内才有效，而在免疫致敏的个体中，口服耐受不仅很难诱导，且保护作用维持时间很短。而将CTB与胰岛素分子经化学结合后口服给予NOD小鼠，其所需的胰岛素剂量是单纯口服胰岛素的1/5000~1/500，且胰岛炎症程度较轻，保护时间也显著延长。将CTB基因与1型糖尿病的自身抗原谷氨酸脱羧酶(GAD)分子中人鼠完全相同的531~545肽段基因在大肠杆菌中表达，结果表明融合的CTB-GAD(CG) 能够特异性地结合GM1神经节苷酯，具有CTB相似的五聚体结构，具备生物活性和抗原性[80]。
3 重组抗体
3.1 诊断用抗体
3.1.1 上皮细胞角蛋白单抗
利用杂交瘤技术制备了一株单克隆抗体T2-2，对其生化性质的研究及其与抗细胞角蛋白多克隆抗体完全重合的定位表明，该抗体特异性识别一种分子质量为46ku的角蛋白。对68例正常组织和65例肿瘤组织的免疫组化结果显示，T2-2 具有上皮细胞特异性。与其他多数抗细胞角蛋白抗体常与一种以上细胞角蛋白多肽表现出交叉反应不同的是，该抗体只识别46ku细胞角蛋白多肽上的某一单特异性表位。另外，T2-适用于多种免疫实验技术，包括ELISA、细胞免疫荧光及蛋白质印迹等，而且适用于多种固定剂。研究表明，单克隆抗体T2-2将成为细胞角蛋白功能研究和肿瘤诊断的有力工具[81]。
3.1.2 CTGF单抗
结缔组织生长因子(CTGF)与纤维化疾病的发生、发展等病理过程有密切的关系。用纯化的人结缔组织生长因子(CTGF) 免疫BalB/ C 小鼠,采用杂交瘤技术制备CTGF 单克隆抗体McAb) ,获得2 株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。并制备了一定量的CTGF，为器官纤维化,恶性肿瘤等疾病的诊断和相关的实验研究奠定了基础[82]。
3.1.3 CTnI单抗
心肌钙蛋白CTnI 指标对评价心肌损伤有效。制备抗CTnI 单克隆抗体，以期制备双抗夹心ELISA检测试剂盒，用于临床诊断。以重组表达并纯化后的CTnI免疫BalB/ C小鼠,采用传统单克隆抗体技术筛选能稳定分泌抗CTnI McAb 的杂交瘤细胞株。结果建立了3 株稳定分泌的杂交瘤细胞株，最低检测浓度分别为20 ,40 ,20μg/ L，且2 株针对CTnI 的不同抗原表位,为建立CTnI 单抗检测试剂盒奠定了基础[83]。
3.1.4 内皮细胞生长抑制素抗体
将重组的人抗内皮细胞生长抑制素(ES)蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓细胞Ag8.653细胞融合，获得鼠抗人ES蛋白的杂交瘤细胞株，ELISA、Western 免疫印迹等方法鉴定结果表杂交瘤细胞分泌的单抗效价高且特异性好，具有较高的应用价值。为ES制剂提供更有效的质量控制手段和为内皮细胞抑制素介入基因治疗肿瘤提供临床评价工具[84]。
3.2 治疗用抗体
3.2.1 转铁蛋白受体单链抗体
血脑屏障阻止外源性物质进入脑的同时也阻止了潜在治疗药物的进入。然而在脑毛细血管内皮细胞上存在特定的受体介导的转运机制，利用人的转铁蛋白受体从全人源噬菌体抗体库中筛选其特异性抗体，构建一个以转铁蛋白受体为介导的跨血脑屏障的转运载体。将筛选到的抗体基因插入表达载体后在大肠杆菌中诱导表达。表达的抗体可以与转铁蛋白受体结合且可以通过血脑屏障[85]。 转铁蛋白受体特异性富含于血脑屏障和肿瘤细胞的表面，是当前中枢神经系统疾病和肿瘤治疗中定向转运的重要靶标。将序列正确的链亲和素（SA）基因与大鼠转铁蛋白受体单链抗体基因(ox26-scFv)连接，并在大肠杆
菌中诱导表达。获得在大肠杆菌中能高效可溶表达的重组融合蛋白，且该融合蛋白具备与转铁蛋白受体和生物素的结合的双重活性。为构建一个通用性的以转铁蛋白受体介导的血脑屏障和肿瘤转运靶向载体打下了基础[86]。 脑源性神经营养因子(BDNF)对中枢神经系统的多种神经元具有营养、修复和保护功能，但因无法通过血脑屏障限制了其应用。利用抗转铁蛋白受体(TfR)的单链抗体(ox26-scFv)作为脑转运载体，构建融合基因表达载体pTIG-Trx/ scFv-BDNF在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达。大鼠GH3细胞免疫酶染色显示, ScFv-BDNF 融合蛋白能与转铁蛋白受体特异性结合，同时能够促进鸡胚背根节神经突起的生长，具备了BDNF的生物学活性。为使BDNF能够跨越血脑屏障成为中枢神经系统的治疗药物打下了实验基础[87]。
3.2.2 HER-2单链抗体
将金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 与抗人表皮生长因子受体 HER-2 单链抗体 scFv-B1以一连接短肽连接，构建融合免疫毒素 B-L-SEC2。流式细胞术和 MTT 实验结果表明，纯化复性的融合免疫毒素在体外具有与 HER-2 过表达的靶细胞 SK-Br-3 特异性结合的活性，并对该细胞产生显著的特异性生长抑制作用[88]。
3.2.3 结肠癌单抗
在获得了一个针对结肠癌细胞表面的糖蛋白的鼠源单抗的基础上，又采用基因工程的手段将其改造成嵌合抗体，在保持其抗体专一性的情况下有效地降低了免疫原性，并在动物试验中发现该嵌合抗体能有效减少肿瘤细胞的量70%以上，且毒性很低，具有进一步开发成治疗人结肠癌单抗药物的潜能[89]。
3.2.4 p185单抗
人类的原癌基因Her-2编码了一个185KDa的跨膜受体酪氨酸激酶，也称为p185，是肿瘤相关蛋白，在多种癌细胞，特别在乳腺癌中有高表达。将前期研制成功的抗
p185单克隆抗体杂交瘤细胞中抗体重链和轻链基因构建成单链抗体scFv，再将scFv和人IgG1的Fc片段融合，构建了嵌合抗体scFv-Fc，保留了亲本抗体的特异结合活性但降低了抗体的异源性，并进而建立了高表达的CHO 细胞株，表达量可以达到30mg/L。对大规模培养产物的纯化条件进行了摸索，通过亲和层析和阳离子交换层析得到的最终产物的纯度在95%以上，回收率为63%。采用合适的冻干保存条件可以保持嵌合抗体稳定性和结合活性一年以上[90]。4 其他
4.1 基因治疗
可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)可以拮抗肿瘤坏死因子的活性，已被用来治疗与TNF相关的炎性疾病。研究将sTNFR与IgGFc片段的融合蛋白基因克隆到真核表达载体pStar上，转染到人的内皮细胞中，表达的sTNFR-IgGFc能够拮抗TNFα对L929细胞的细胞毒活性。将该质粒DNA与脂质体混合，经尾静脉注射到Ⅱ型胶原诱导的关节炎小鼠体内后，应用RT-PCR在鼠的肝脏检测到了sTNFR-IgGFc的表达，并显著地改善了治疗组小鼠关节炎症状和病理反应。这表明抗TNF基因治疗有可能作为治疗类风湿性关节炎的新的途径[91]。
凋亡素是一个鸡贫血病毒衍生的，不依赖于p53，对bcl-2不敏感的凋亡蛋白，能特异性地在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡。为了研究凋亡素是否能用于肿瘤的基因治疗，构建了一株表达凋亡素蛋白的重组禽痘病毒，体外试验表明重组的病毒比对照不表达凋亡素的禽痘病毒有更强的杀死肝癌细胞的能力。而给小鼠同时注射肝癌细胞和表达凋亡素的重组禽痘病毒的体内实验结果证明表达的凋亡素能起到保护和治疗作用，与对照相比，注射重组病毒的小鼠存活率显著提高，表明表达凋亡素的重组禽痘病毒能抑制肿瘤的生长，诱导凋亡的发生，可能是一个有效的肿瘤基因治疗手段[92]。
4.2 反义核酸
Fas是一种细胞表面抗原，属于神经生长因子受体/肿
瘤坏死因子受体超家族，Fas基因的过度表达是引起爆发性肝炎的原因，应用PARASS(poly-A anchored RNA accessible sites screening)技术筛选Fas基因mRNA获得3个潜在反义作用靶点，设计了对应靶点的反义寡核苷酸和DNAzyme。体外验证结果表明3个靶点的反义寡核苷酸组及DNAzyme均能降解Fas基因RNA，为有效靶点[93]。 ZP3 作为精子结合的靶对象在卵母细胞受精中起着
关键作用，参照新疆草原兔尾鼠卵透明带3 (lZP3) 的mRNA，选择针对lZP3 mRNA 的3 个区域合成寡聚核苷酸连接到干扰载体上，共转染Hela 细胞以及通过尾静脉大容量快速注射法(Hydrodynamics2based transfection method，HD法) 共注射小鼠。表明有2 个干扰载体可以有效干扰lZP3 mRNA 的表达[94]。
4.3 发酵条件研究
人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF) 是一类对来源于中
胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛生物学活性的细胞生长因子。研究了乙酸浓度对重组人酸性成
纤维细胞生长因子( rhaFGF) 改构体表达体系生长和表达的影响, 探索了几种高密度培养重组大肠杆菌的流加分批发酵技术。有效的避免了乙酸的积累。菌体密度OD600nm = 22 左右，可溶性重组人酸性成纤维细胞生长因子纯化后水平为450mgPL[95]。
4.4 给药方式的研究
水蛭素有三个变种，HV2具有相对最强的抗凝活性，而HV2 (K47Q)变种与凝血酶的解离常数大大增加，与重组的野生型水蛭素相比，活性增加61%。采用PCR方法得到了rHV2 (K47Q)并包埋在肠溶胶囊中以避免在胃里被蛋白酶和胃酸降解，尝试了重组水蛭素口服的可能性。动物实验表明口服的重组水蛭素在体内有效地延长了凝血时间，与静脉注射相比，口服rHV2 (K47Q)的生物利用度为传统给药方式的10.11%，给水蛭素以及其他的多肽及蛋白质药物的口服给药提供了一条新思路[96]。
4.5 RNAi
由于癌基因与肿瘤发生相关基因超表达引起细胞过度
增殖会导致癌症，如果利用RNAi抑制这些过度表达的基因，可能会使癌症表型逆转或病程得以控制。甲硫
氨酸腺苷转移酶(MAT)表达由MAT1A转变成MAT2A
在肝癌发病机制中起了重要作用，并为肝癌细胞生长
提供了有利条件。采用脂质体转染法将MAT2A小干扰RNA(siRNA)质粒表达载体转染人肝癌细胞系Bel-7402细胞、HepG2细胞和HepG3B细胞，结果发现MAT2A siRNA能特异性地抑制人肝癌细胞MAT2A mRNA和蛋白质的表达，刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变，降低了肝癌细胞中MAT II的活性，从而诱导肝癌细胞凋亡，较对照组siRNA具有显著差异。进一步实验表明其是通过升高肝癌细胞中SAM含量，刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变，从而抑制肝癌细胞生长[97]。
我国的生物制药经过近20年的发展，取得了一些成绩，但是与欧美的差距仍然存在。从2006年生物技术药物的研究来看，大肠杆菌以及毕赤氏酵母表达的产品占绝对统治地位，且是以细胞因子等激动剂为主，仍然没有大规模培养动物细胞的技术，缺少以拮抗作用为主的新生物技术药物以及重组治疗性抗体。
当今国外抗体药物的发展如火如荼，我国在这方面的研发还刚刚起步，至今还没有一个人源化（基因工程）抗体药物上市。但我们也很欣喜地看到，近期在这方面的研究已经有所进展，所构建的嵌合抗体具有一定的临床价值，虽然还只是在实验室阶段，但如果能在今后几年从根本上改善我国基因重组治疗性抗体的上游构建技术，并将大量生产抗体的动物细胞培养从实验室制备发展到工业化大规模生产，克服这一限制我国生物制药发展最主要的瓶颈，我们一定能够把握机会，实现跨越式发展。
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