VEGF165基因转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究1
白晓峰，田卫东，陈希哲，李志勇
四川大学华西口腔医学院口腔颌面外科 （610041）
e-mail：bxfwcums@https://www.doczj.com/doc/6d9279089.html,
摘 要： 目的 探讨对大鼠骨髓基质细胞进行重组人血管内皮细胞生长因子165基因修饰的可行性。方法 采用全骨髓细胞贴壁培养法获得稳定的大鼠骨髓基质细胞，分别在脂质体LipofectMINE2000和新型的阳离子聚合物Sofast介导下行pcDNA3.1-VEGF165转染骨髓基质细胞，在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化，通过免疫细胞化学鉴定VEGF在细胞中的表达情况。结果 免疫细胞化学证实两种方法均能成功地将人血管内皮细胞生长因子165基因转染至大鼠骨髓基质细胞中，并获得一定的表达。新型的阳离子聚合物Sofast的细胞毒性略小于传统的脂质体。结论 真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165可以成功地在骨髓基质细胞中表达，为进一步探讨组织工程血管化的研究奠定了初步的实验基础。 关键词： 血管内皮细胞生长因子，基因转染，骨髓基质细胞
1.引言
组织工程学从20世纪90年代被正式提出以来，这一领域取得了卓越的成就，然而构建功能性的复合组织结构或器官是一直困扰着生物医学领域的关键性问题。问题的焦点集中于如何使重建或再生的组织内部获得血供而保证其正常的生长代谢。所以，为了把组织工程更进一步的应用于临床医学领域，我们必须深入探讨血管再生和血循环重建的相关问题。对血循环的重建而言，血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）无疑是最重要的生长因子，作为血管内皮细胞的特异性丝裂原，无论在生理还是病理状态下，VEGF都是血管形成最重要的调节因子，同时，VEGF通过刺激血管内皮细胞的游走进一步建立新的血管网。VEGF也能改变血管的通透性，促进血浆蛋白的渗出，形成富含纤维素并有利于新血管形成的细胞外基质[1]。实验表明骨髓基质细胞（Bone Marrow Stromal Cells, BMSC）作为组织工程的种子细胞具有多向分化的潜能，是骨组织工程研究中较为理想的种子细胞之一[2]。因此，本实验将对大鼠骨髓基质细胞进行人血管内皮生长因子165的基因修饰，以探
本课题得到教育部博士点基金（B12002060060）和教育部高校优秀青年教师教学科研奖励计划（2003682）资助。
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讨通过VEGF基因治疗来获得生物工程组织的血循环重建的可行性。
2.材料和方法
2.1 材料
真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165由第四军医大学口腔医学院高全文等提供[3]。LipofectMINE2000购自美国Gibco公司，新型的阳离子聚合物Sofast转染试剂购自厦门太阳马生物工程有限公司。鼠抗人血管内皮生长因子单克隆抗体及免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。
2.2 pcDNA
3.1-VEGF165的提取与纯化
用已构建好的真核表达质粒载体pcDNA3.1-VEGF165转化大肠杆菌，按质粒提取试剂盒中的说明书小量提取质粒，纯化后保存备用。
2.3 大鼠骨髓基质细胞的培养
取成年SD大鼠一只，引颈法将其处死后，取其股骨，剪去上下骺端，用含有20%小牛血清的ɑMEM培养液冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲入培养皿中，用吸管吹打使细胞尽可能的分散后接种于培养瓶内。37℃、5%CO2饱和湿度下培养，48小时后换液。多次贴壁法分离培养大鼠骨髓基质细胞。以胰蛋白酶消化法进行传代。于倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。
2.4 大鼠骨髓基质细胞的鉴定
用光学显微镜观测细胞的形态学特征。选取传代的BMSC在矿化诱导液中培养，对BMSC 进行成骨向诱导，培养三周后，茜红素染色以示钙化组织的形成情况。
2.5 VEGF165基因转染大鼠骨髓基质细胞
胰蛋白酶消化后的BMSC按1×109接种于六孔板。当细胞生长至90%-95%时，同时以pcDNA3.1-VEGF165在脂质体LipofectMINE2000和新型的阳离子聚合物Sofast介导下转染BMSC，具体方法按照说明书进行。同时设立未转染的骨髓基质细胞作为对照组。
2.6 人VEGF165在大鼠骨髓基质细胞中表达的免疫组化检测
转染48小时后，取出细胞爬片后，经95%乙醇固定10分钟，PBS冲洗，加3%的H2O2室温20分钟灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗。加100ml/L羊血清封闭30分钟，弃去多余的血清。以鼠抗人VEGF165单克隆抗体作为一抗，生物素标记的羊抗鼠抗体作为二抗，免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165的表达。
3.结果
3.1 大鼠骨髓基质细胞的生物学特点
原代培养时BMSC生长稳定，增殖良好。原代培养的BMSC48小时贴壁。10-14天细胞形成致密贴壁层，传代后细胞生长稳定。细胞的形态和排列如图1。
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BMSC经矿化诱导液培养20天后，部分细胞成聚集生长，逐渐形成茜红素阳性的钙结节。（图2）
图1 正常大鼠骨髓基质细胞的形态和排列
Fig1 Morphological characters of normal rat bone marrow stroma cells （×100）
图2 骨髓基质细胞矿化液培养后钙结节的茜红素染色 Fig2 Afer mineralization-induced culture, BMSCs form mineralized-like tissue (×100)
3.2 人VEGF165在大鼠骨髓基质细胞中表达的免疫组化检测
细胞免疫化学检测结果显示，pcDNA3.1-VEGF165转染的细胞阳性着色，其胞浆和胞核呈棕色，而未转染的对照组则无阳性着色。因此，骨髓基质细胞转染后能在蛋白质水平表达外源性基因。（图3）
A （×200）
B（×200）
C （×100）
图3 pcDNA3.1-VEGF165转染后VEGF在BMSC中的表达
A脂质体介导B 阳离子聚合物介导C空白对照组
Fig3 Detection of VEGF165 expression after transfection by immunohistochmistry
A Liposome mediated transfection
B Sofast mediated transfection
C Negetive control
比较脂质体LipofectMINE2000和新型的阳离子聚合物Sofast的转染效率，计数十个高倍视野，阳性细胞率分别为11.34和11.42，二者无明显差别。而细胞存活率后者稍高于前者。
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4.讨论
组织工程学发展到今天，已经成功地将组织工程皮肤应用于临床治疗。然而要进一步构建结构复杂的组织或器官，保证其植入体内后存活并行使其正常的功能，就必须解决组织工程血管化的问题。目前已经有以下几种方法得到了探索：应用生物材料的缓释系统达到促进血管形成的细胞因子在体内定时、定量的释放以刺激新生血管的形成[4]； VEGF、bFGF、PDGF等细胞因子基因导入种子细胞，经植入体内后获得细胞因子的稳定的表达以诱导血管长入组织内部[5]；应用血管形成前体细胞进行干细胞的局部治疗以获得生物组织内的血循环重建[6]；在体外或体内构建带有血管蒂的生物组织，经显微外科移植以修复或替代缺损的组织器官[7]。
血管内皮细胞生长因子是促进血管形成和血循环重建的最重要调节因子。通过将血管内皮细胞生长因子编码基因导入细胞的基因修饰已成为获得血循环重建的最具发展潜力的治疗模式之一。对肢体缺血性疾病和心脏缺血性疾病的血管内皮细胞生长因子基因治疗已经初步地应用于临床。在组织工程的研究中同样可以通过VEGF的表达来启动一系列的链式级联反应，达到促进内皮细胞的增殖或分化和进一步形成新生的血管。组织工程的基本原理是将体外培养并大量扩增的功能相关的活细胞种植于天然或人工合成的细胞外基质上，经过三维立体培养后进行体内移植，以构建新的有功能的组织。因此，体细胞介导的回体基因转移技术在组织工程领域的研究中具有了其固有的优越性。干细胞作为组织工程的种子细胞的同时，又成为向体内导入基因的载体。目前，骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞和肌原细胞都已作为基因导入的载体而投入研究。本研究利用血管内皮生长因子基因转染的干细胞植入体内，以期探讨组织工程血管化的途径。
本研究选用分泌型VEGF165的编码基因，将其导入骨组织工程的种子细胞——骨髓基质细胞，获得了外源性VEGF的表达。所以，我们可以进一步将阳性表达的细胞继续按照组织工程骨的构建模式来完成体内工程化骨组织的血循环重建。同时本研究发现BMSC一经转染后其增殖能力显著下降，其能否完成体外大量增殖以及同支架材料的复合培养将有待进一步探讨。
传统的脂质体和新型的阳离子聚合物作为两种不同的非病毒载体，本研究也比较了两者的转染效率和细胞毒性。旨在探索更为高效的转染方法。阳离子聚合物作为基因转染载体的研究是从1996年左右开始。它们能够浓缩DNA，促进细胞吞噬聚合物/DNA复合体。由于阳离子聚合物能在细胞内涵体中形成吸收质子的“海绵”，从而使之崩解，而使DNA 免受内涵体酶解，并使其在细胞核内释放， 从而提高基因表达水平[8] 。Sofast新型的阳离子聚合物具有很强的DNA 结合能力，本研究结果显示其转染效率与传统的脂质体无明显差别，而细胞毒性略小于传统的脂质体。
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5.结论
本研究成功地地将真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165转染至骨髓基质细胞中，并获得表达，为进一步探讨组织工程血管化的研究奠定了初步的实验基础。
参考文献
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Expression of Human VEGF~165 Gene in Rat Bone Marrow
Stromal Cells in vitro
Bai Xiaofeng,Tian Weidong,Chen Xizhe,LiZhiyong
Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China College of Stomatology,
Sichuan University, Chengdu,PRC, 610041
Abstract
Objective: The purpose of this study is to evaluate the feasibility of VEGF165 gene transfection into bone marrow stromal cells and make groundwork for VEGF gene therapy for the revascularization of bone tissue engineering. Material and methods: We accomplished bone marrow stromal cells culture in
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vitro. The BMSC were tested for the dexamethasone-induced potential to form mineralized-like tissue in culture in the presence of ascorbic acid and beta-glycerophosphate. The vector pcDNA3.1-VEGF165 was transfected into bone marrow stromal cells with the method of liposome mediated and using Sofast transfectam reagent. The expression of human VEGF165 in the transformed cells was detected by immunocytochemistry. Results: It was conformed that the BMSC had potential to form bone-like tissue. The expression of human VEGF165 in the transformed rat BMSC had been demonstrated by immunocytochemistry. Conclusion: The experiment demonstrated that rhVEGF165 was successfully expressed in the bone marrow stromal cells. It will be useful for the next step of revascularization of bone tissue engineering.
Key words:vascular endothelial growth factor, bone marrow stromal cells, gene transfection
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骨髓间充质干细胞经验总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为翔实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。 一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 1．直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC 的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC 的简便可行的方法，得到了广泛的应用。 culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。 布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤： （1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞 （2）原代培养24h,48h各换液一次 （3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来 （4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。 （5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。 （6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。 菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48h~72h后首次换液，一般7~10天可传代。 天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。 2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离（400g×20min）人骨髓MSCs，取界面处细
作者单位:第四军医大学口腔医学院颌面外科,西安(710032 作者简介:刘彦普(1956-,河北人,副主任医师. 骨组织工程中骨髓基质细胞的研究进展 RESEARCH PR OGRESS ON BONE MARR OW MATRIC CE LL IN BONE TISSUE PR OJECT 刘彦普,钱奇春,杨维东 中图分类号:R322.7文献标识码:A 文章编 号:100524979(20020320229204 种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容。理想的骨种子细胞应具备以下特点:①取材容易,损伤小;②易定向分化为成骨细胞,传代繁殖力强;③适应性强,植入机体后能保持成骨活性。目前,作为骨组织工程的种子细胞有4种来源:骨、骨外膜、骨髓、骨外组织。这些来源各有优缺点,其中骨髓来源的骨髓基质细胞(b one m arrow strom al cell ,BMSC 具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化力强、易于接种成活等优点,在骨组织工程中显示出良好的应用前景。1BMSC 的成骨潜能 骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和功能支持的结缔组织,由基质细胞和细胞间基质构成。骨髓成骨能力主要来源于BMSC 中的成纤维细胞集落形成单位(colony forming unit fibroblast ,CFU 2F ,它具有多向分化潜能,在特定培养条件下可转化成多种间充质细胞,如成纤维系细胞、成骨系细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和内皮细胞等[1]。Mani 2atopoulos [2]等首次观察到鼠BMSC 在体外培养条件下 具有形成钙化的骨样组织的能力,X 线衍射分析表明 钙化物具有与骨组织类似的羟基磷灰石结构,免疫组织化学显示BMSC 产生I 型胶原,骨钙素(osteocalcin ,OC 与骨涎蛋白表达阴性。Benayahu [3]等将BMSC 体外
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞 最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植
小鼠骨髓基质细胞 小鼠骨髓基质细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠骨髓基质细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠骨髓基质细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠骨髓基质细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠骨髓基质细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 骨髓基质干细胞及其应用的研究进展骨髓基质干细胞及其应用的研究进展( 作者： 张秀云发表时间： 2019 年 11 月 ) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等， MSCs 移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。 本文对MSCs 移植治疗脑缺血的研究综述。 1 骨髓基质细胞的生物学特性 1.1 目前发现至少存在 3 种形态的 MSCs。 Colter 等从培养的人骨髓细胞中分离出 MSCs 后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平 MSCs 外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的 1 / 9
MSCs 能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将 MSCs 放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等。 MSCs 具有多向分化的潜能，MSCs 经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时， MSCs 即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。 1.2 MSCs 的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化。 2 骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs 在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，Sanchoz Ramos 等发现，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derived neuotrofic factor， BDNF)可诱导人及小鼠的少数 MSCs 分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其 RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)。 将人或小鼠的 MSCs 与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分 MSCs 分化为 NeuN 阳性的神经元样细胞及 GFAP 阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在 MSCs 的分化中发挥重要作用。 3 MSCS 移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理
小鼠骨髓细胞群细胞系的建立 一、实验目的： 1) 通过培养小鼠骨髓基质细胞，建立小鼠骨髓基质细胞系 2) 了解细胞培养的一般步骤和注意事项，培养无菌操作意识 二、实验原理： 细胞培养：多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞。移植到体外后，只要条件适合，依然保持着分裂增殖的能力。利用这个原理,将小鼠骨髓基质细胞移植到体外培养。通过一定的纯化方法，从原代细胞得到传代细胞，经过若干代中，部分细胞发生遗传物质的变化成为无限传代的性质，分离得到细胞系。 培养细胞纯化：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞先脱壁，利用此道理，采用多次差别消化法将上皮细胞核成纤维细胞分离而达到纯化的目的 三、材料：实验小白鼠 四、药剂及配制：
五、仪器器材： （1）培养皿×3、500ml烧杯×1、棉花、医用解剖器材（剪刀、镊子、解剖刀）、10ml注射器、4号针头、离心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密pH试纸、0.22μm微孔滤膜、血球细胞计数板、标签纸、油性笔、冻存管（2）超净工作台、CO2培养箱、高速离心机、高压灭菌锅、显微镜、水浴锅、-86℃冰箱
2、无菌工作室及其内物品的消毒灭菌（1）超净工作台 检查超净工作台是否正常；用之前用沾了75%酒精的脱脂棉擦拭，再开30min的紫外照射（2）小件物品 用牛皮纸（报纸）将小件物品(如镊子、解剖刀等)包裹好放进饭盒里，放进灭菌锅，其他物品也一并放入蒸汽灭菌锅内，95KPa、121℃下灭菌30min （3）其他仪器灭菌 3、试剂配制（如上表） 4、器材准备 5、注意： 1) 使用高压灭菌锅时注意正确使用方法，以免引起危险 2) 超净工作室和工作台必须清理干净，以免引起细胞污染 浸泡 ?用5%的盐酸溶液浸泡过夜 刷洗 ?用足量的洗衣粉反复刷洗,将瓶壁上的残渍洗干净 浸酸 ?将干燥后的器皿用重络酸钾溶液(重络酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 1L)浸泡过夜 冲洗 ?将浸酸后的玻璃器皿用自来水冲洗,然后用蒸馏水,最后干燥、待用 第二部分原代培养 器材：解剖刀、剪刀、镊子、平皿、注射器、离心机、血球计数板、15ml离心管×4、培养瓶×2，冰块 试剂：乙醚、D-Hank’s溶液、生理盐水仪器：超净工作台、离心机、显微镜步骤： 1.取样 1) 超净工作台上的物品：灭菌后的解剖刀、剪刀、镊子、注射器、平皿、冰块 2) 将小鼠用乙醚麻醉后引颈处死（用培养皿盛），在盛有75%酒精的烧杯中浸 泡5min。在超净工作台上分离双侧股骨（培养皿下置冰块），在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织（皿下置冰块）。 3) 剪去骺端。用10mL注射器抽取食量D-Hank’s液冲洗骨髓腔，将骨髓冲入 培养瓶。
地塞米松对骨髓基质细胞生物学特性的影响 魏宽海 裴国献 郑 磊 王 前 金 丹 胡罢生 【摘 要】 目的 探讨地塞米松对体外培养的骨髓基质细胞增殖和分化等生物学特性的影响。方法 取4～6周龄新西兰兔双侧股骨骨髓3m l,体外分离,培养至第3代骨髓基质细胞,分别用地塞松浓度为0、10-10、10-9、10-8、10-7和10-6mo l L的培养基,作用2、4及6天后,测定骨髓基质细胞的分裂增殖能力和碱性磷酸酶活性。结果 地塞米松对骨髓基质细胞的增殖起抑制作用,并随地塞米松浓度的升高而增强,其浓度大于10-8mo l L后抑制作用越显著。地塞米松在抑制增殖的同时,可显著增强骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性,浓度越高作用也越显著,但超过10-8mo l L后各浓度的作用效果无显著差别;这种作用随时间的延长而增强,至6天时与对照组相比可增强2～4倍。结论 地塞米松抑制骨髓基质细胞的增殖,但可促进其分化为成骨细胞,浓度为10-8mo l L较合适。 【关键词】 组织工程 骨髓基质细胞 地塞米松 增殖 分化 THE EFFECTS OF D EXA M ETHAS ONE ON B I OLOGI CAL CHARACTER ISTI CS OF B ONE M ARR OW STR OM AL CELL S W E I K uan2ha i,P E I Guo2x ian,ZH EN G L ei,et a l.D ep a rt m en t of O rthop ed ics and T raum a tology,N anf ang H osp ita l,the F irst M ilita ry M ed ica l U n iversity.Guang z hou Guang d ong,P.R.Ch ina 510515 【Abstract】 Objective To investigate the effects of dexam ethasone on the p ro liferati on and differen tiati on of bone m arrow strom al cells(M SC).M ethods M SC w ere iso lated and cu ltu red in v itro.A fter treatm en t w ith differen t concen trati on s of dexam ethasone(0,10210,1029,1028,1027and1026mo l L),the p ro liferati on and alkaline pho sphatase(AL P)activity of M SC w ere m easu red to evaluate the effect of dexam ethasone on the b i o logical characteristics of M SC.Results D exam ethasone inh ib ited cell p ro liferati on.W ith the increase of concen trati on of dexam ethasone,the effect w as enhanced,w h ich w as mo re sign ifican t w hen the concen trati on of dexam ethasone w as over1028mo l L.A t the sam e ti m e,dexam ethasone p romo ted the activity of AL P.T h is effect w as enhanced w ith the increase of concen trati on of dexam ethasone,bu t the alterati on w as s m all w hen the concen trati on of dexam ethasone w as over1028mo l L.T he effects increased w ith the ti m e.T he activity of AL P w as enhanced2to4 ti m es w ith the dexam ethasone fo r6days.Conclusion D exam ethasone inhab it the p ro liferati on of M SC,w h ile induce them to differen tiate in to o steob lasts.T he app rop riate concen trati on of dexam ethasone w as10-8mo l L. 【Key words】 T issue Engineering Bone m arrow strom al cells D exam ethasone P ro liferati on D ifferen tiati on Founda tion ite m s:N ati onal Basic Science R esearch and D evelopm en t Gran ts(973)(G1999054308);N ati onal N atu ral Science Foundati on of Ch ina(39970743) 用骨组织工程的方法修复骨缺损克服了以往方法的一些不足[1]。骨组织工程中种子细胞的选择与培养是最基本的环节,其来源有骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。综合相比之下,以骨髓为最优[2]。但骨髓基质细胞(bone m arrow strom al cells,M SC)具有多向分化潜能,为了提高其成骨效率,有必要选择合适的培养条件,以促进M SC分裂增殖并定向分化为成骨细胞。为此设计进行实验,观察地塞米松对M SC增殖与分化特性的影响,以期建立一种理想的M SC体外培养体系。 1 材料与方法 111 主要仪器与试剂 基金项目:国家重点基础研究发展规划(973):组织工程的基本科学问题(G1999054308);国家自然科学基金资助项目(39970743)作者单位:第一军医大学南方医院创伤骨科(广州,510515) 倒置相差显微镜(O lym p u s),752紫外分光光度计(上海),B i o2rad450型酶联免疫检测仪(U SA),R PM I1640、96孔培养板(Gibco),胎牛血清(四季青生物制品公司),胰蛋白酶、T riton2100、M T T、二甲亚砜、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2250 (天象人生物制品公司),地塞米松、维生素C (Sigm a),碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)。 112 方法 11211 M SC的培养 取4～6周健康新西兰大白兔,双侧股部剪毛,碘酒、酒精消毒后,用16号骨穿针自股骨大转子部穿入骨髓腔,注射器抽吸双侧股骨骨髓共3m l,混入无血清的1640培养基反复抽吸吹打。离心、过滤网,经4号针头反复抽吸,制成单细胞悬液。加入315m l含15%FB S的培养基,以 ? 2 3 2 ?Ch inese J R eparative and R econstructive Surgery,2001,V o l15(4)
自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究 目的：探讨自体骨髓基质干细胞（MSCs）移植联合促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤（SCI）治疗的效果。方法：培养与纯化骨髓基质干细胞。80只SD大鼠制备脊髓损伤模型，随机分为4组：干细胞移植组、EPO组、联合组和对照组。采用BBB法进行运动能力评分和组织切片观察来评定修复情况。结果：三个实验组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），三个实验组均可明显促进大鼠运动功能和损伤后组织结构的恢复，其中联合组效果更显著。结论：骨髓基质干细胞移植联合EPO具有促进大鼠脊髓损伤后神经功能的修复。 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种常见的神经系统损伤，其致残率和病死率均较高。目前，脊髓损伤在临床治疗后神经功能的恢复效果不甚理想[1-5]，急需改进，所以，脊髓损伤的治疗一直是医学研究的热点问题[6-7]。骨髓基质干细胞（MSCs）具有高度增殖和向多种细胞分化的潜能，可分化为对神经递质敏感且具有神经电生理特性的细胞，还可以产生多种神经生长因子促进受损的神经纤维修复，移植后可促进脊髓损伤的修复[8]，而且可以自体移植，因此骨髓基质干细胞是治疗脊髓损伤的理想种子细胞[9-10]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种由肾脏产生的内分泌激素，一直作为治疗贫血的药物而应用于临床。随着人们对EPO研究的深入，EPO已被证实是一种新型的神经保护和营养因子，具有神经营养和神经保护作用[11]。本实验将骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用于脊髓损伤大鼠，探讨骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用是否有协同效应。 1 材料与方法 1.1 实验材料和设备成年雄性SD大鼠80只，体重200～240 g；8周龄雄性SD大鼠4只，体重约100 g（均由哈尔滨医科大学动物试验中心提供）。二氧化碳细胞培养箱（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（日本奥林帕斯公司），低温离心机（德国Heraeus公司），单人双面净化工作台（苏州净化）超纯水净化器（美国Millipore公司），DMEM培养基，Percoll分层液。 1.2 实验方法 1.2.1 建立脊髓损伤模型与分组8周龄的SD大鼠用于骨髓基质干细胞的分离、培养和纯化。成年SD大鼠水合氯醛麻醉后，俯卧位固定，找到T10棘突，向上和向下5 cm范围内进行剪毛消毒。沿正中线切一3 cm长的切口，暴露椎旁肌肉，用玻璃分针剥离肌肉，用骨钳咬除棘突和椎板，形成方形骨窗，暴露T10脊髓，用脊髓损伤打击器打击制成SCI模型。造模的标准是：脊髓出现出血、水肿、后肢迟缓性瘫痪和尾巴痉挛性摆动。冲洗切口后局部使用青霉素，以防感染，缝合后放回鼠笼喂养。按随机的方式将80只SCI模型的大鼠分为对照组、骨髓基质干细胞应用组、促红细胞生成素应用组和联合应用组，每组20只。对照组每只鼠在脊髓损伤前1 d经腹腔注射相同量的生理盐水。骨髓基质干细胞治疗组将每只鼠采取尾静脉注射的方法在脊髓损伤后给予第3代培养的骨髓基质干细
生理学报 Acta Physiologica Sinica , August 25, 2006, 58 (4): 370-376 https://www.doczj.com/doc/6d9279089.html, 370 研究论文 Received 2006-03-30 Accepted 2006-06-02 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30400251). * Corresponding author. Tel: +86-10-62179164; Fax: +86-10-62173457; E-mail: jmchun@https://www.doczj.com/doc/6d9279089.html, 人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选 刘美玲，石心泉，周万灏，刘洪文，李 东，贾孟春* 国家人口计划生育委员会科学技术研究所，北京 100081 摘 要：为了探讨人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)向成骨细胞分化过程中差异表达的基因，本实验采用体外培养人BMSCs ，诱导向成骨细胞分化。分别选取培养12和21 d 的细胞作为驱动方(driver)和实验方(tester)，进行抑制消减杂交，构建cDNA 消减文库，将挑选出的阳性克隆与GenBank 人基因库中已公布的核酸序列进行同源性比较分析。结果表明，从培养21 d 的BMSCs 中，筛查出5个差异基因，与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上。有兴趣的是，核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1在培养21 d 的BMSCs 中差异表达。RT-PCR 检测显示，核心蛋白聚糖基因在培养21d 的细胞中高表达，而在12 d 的细胞中未检测到表达；Bax inhibitor 1基因在培养21 d 细胞中的表达明显高于12 d 的细胞。关键词：骨髓基质细胞；成骨细胞；核心蛋白聚糖；基因中图分类号：R 329 Screening differentially expressed genes in human bone marrow stromal cells at defined stage of differentiation LIU Mei-Ling, SHI Xin-Quan, ZHOU Wan-Hao, LIU Hong-Wen, LI Dong, JIA Meng-Chun * National Population Research Institute for Family Planning, Beijing 100081, China. Abstract: To screen differentially expressed genes involved in osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (BMSCs)at defined stages, subtractive cDNA library was established by means of suppression subtractive hybridization. The BMSCs cultured for 12 and 21 d were used as driver and tester, respectively. A subtract library was successfully constructed and five positive clones were selected from the library. Sequencing analysis and homology comparison showed that the five clones differentially expressed in BMSCs cultured for 21 d were at least 90% homologous with the known genes in human GenBank. It was interestingly found that the osteogenic BMSCs cultured for 21 d differentially expressed decorin and Bax inhibitor 1. RT-PCR was performed to confirm the differentially expressed genes. The results showed that the expression of Bax inhibitor 1 was significantly higher in the cells of 21-day than that of 12-day, while the expression of decorin was only detected in the cells of 21-day.Key words: bone marrow stromal cells; osteoblast; decorin; gene 正常骨量的维持需要骨祖细胞不断提供足够的成骨细胞，而正常骨转换中所需要的成骨细胞来源于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs 是骨髓基质的一种间充质细胞，它能产生骨祖细胞系。BMSCs 具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可向脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞，甚至神经细胞等分化[1,2]。定向分化的骨祖细胞首先增 殖并分化为前成骨细胞，同时表达I 型胶原和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。I 型胶原的合成在细胞增殖期占主导地位，并与细胞的进一步分化有很大的关系。随后前成骨细胞分化为早期的成骨细胞并表达骨桥蛋白(osteopontin, OPN)，同时具有了骨基质形成的能力。最终，分化成熟的成骨细胞开始骨钙素(osteocalcin, OC)的表达，并进一步分化