Draft 起草人
设备工程师signature签名Date日期
Review审核人
工程设备部经理signature签名Date日期
Review审核人
生产部经理signature签名Date日期
Review审核人
QA经理signature签名Date日期
Approve批准人
副总经理signature签名Date日期
Index
目录
1. Purpose目的 (3)
2. Scope 范围 (3)
3. Responsibilities 职责 (3)
4. Regulation and Guidance 法规和指南 (3)
5. System Description 系统/设备描述 (3)
6. Production Capacity生产能力的要求 (4)
7. Quality Requirements质量要求 (4)
8. Structure and Component结构与组件要求 (5)
9. Control system requirement控制系统要求 (9)
10. Instruments and valves仪表与阀门 (12)
11. Material and Process材料与加工 (12)
12. Public Service公用系统要求 (13)
13. Installation安装要求 (13)
14. EHS环境保护、健康与安全要求 (14)
15. Supplier/User Responsibilities供应商/用户责任（安装、调试和验证） (14)
16. File and Certificate文件和证书要求 (16)
17. Abbreviation缩略语 (18)
18. Revision History修订历史 (19)
1 Purpose目的
提供书面文件证明拟购置的无菌检查隔离器与GMP和医药法规要求一致，并符合本公司生
产质量要求。本用户需求确定了重要部件、参数和必要的可选件，以便与供货商提供最实
用的无菌检查隔离器以满足xxxx制药有限公司的使用需求，本用户需求将提供给供货商，
以便于供货商提出报价、设备的设计和制造。
2 Scope 范围
本文档适用于为xxxx制药有限公司一期QC微生物检测室设计制造无菌检查隔离器。
3 Responsibilities 职责
3.1 工程设备部设备主管：负责用户需求的编写；
3.2 生产管理部经理、工程设备部经理、质量保证部经理：参与审核本用户需求；
3.3 质量总监：批准本用户需求。
4 Regulation and Guidance 法规和指南
4.1 GMP（2010年修订），2011年03月；
4.2 EU-cGMP2008版
4.3 FDA-cGMP2004版
4.4 ISPE指南5“调试和确认”，2001年第一版；
4.5 中国药典，2015版；
4.6 欧洲药典EP8.6
4.7 美国药典USP39 NF34
4.8 GAMP5良好自动化生产实践指南，2008年第5版。
4.9 GB/T2591
5.7-2010/ISO14644-7：2004
5 System Description 系统/设备描述
5.1 用途：
用于一期QC无菌检查操作。
5.2 安装位置：
该设备安装于一期生产车间1楼无菌检查室。
5.3 结构与组件：
该设备主要包括：1、满足无菌检查的各功能段；2、环境监测与保证系统；3、CIP&SIP
系统；4、整机控制系统以及其他辅助系统等。
5.4 设备工艺简介
1基本描述
无菌检查隔离器室一套能够创造并维持一个符合现行版中国药典无菌试验要求的无菌环境
的装置，本实验室的隔离器主要用于产品的无菌检测，能够有效地降低或消除无菌测试的
假阳性风险，保证无菌检验操作环境及检验结果的准确性、真实性。
2 工艺描述
将供试品及实验用品（全封闭集菌培养器、无菌培养基、无菌稀释液和无菌试验器具等）
表面处理后，放入传递舱，运行灭菌器，使用VHP进行灭菌，灭菌结束后通过RTPs或其
他快速传递系统将供试品及实验用品转移至实验舱。在实验舱进行无菌试验后，将废弃物
及培养物品转移至传递舱或利用隔离的袋出装置，从传递舱中取出实验用品和物品进行培
养，而实验舱内进行有效的清洁后能维持无菌环境至验证的运行时间。
6 Production Capacity生产能力的要求
7 Quality Requirements质量要求
8 Structure and Component结构与组件要求
9 Control system requirement控制系统要求
10 Instruments and valves仪表与阀门
11 Material and Process材料与加工
12 Public Service公用系统要求
13 Installation安装要求
14 EHS环境保护、健康与安全要求
15 Supplier/User Responsibilities供应商/用户责任（安装、调试和验证）
16 File and Certificate文件和证书要求
供应商应将设备的结构图、技术说明等相关的文件以电子版和纸版的形式提供给xxxx制药有限公司，文字部分应使用英文和中文。
17 Abbreviation缩略语
18 Revision History修订历史
无菌隔离器用户需求说明 User Requirement Specification for Sterile Isolator Review and Approval审核和批准 版本修订索引Revision History
目录 1.介绍 (3) 2.目的 (3) 3.范围 (3) 4.职责 ................................................................................................................. 错误！未定义书签。 5.术语和缩略语 (3) 6.法规和指南 (4) 7.参考文件.......................................................................................................... 错误！未定义书签。 8.系统和设备描述 (4) 9.URS内容 (5)
1. 介绍 本用户需求说明（URS）是为了规定XX公司XX的XX系统的建造、运输、自动化控制系统等的技术要求，为该系统的招标提供技术依据，并作为后续验证工作的基础。 本文件作为供应商编制设备设计说明、建造要求、调试和服务技术条款的基础，供应商应根据本文件需求逐条做出响应，提供其技术要求是否满足本文件需求标准，如有偏差和不符合项应列出，并详细说明或提供解决方案。 2. 目的 用户需求说明是一系列的技术说明中的第一个。它是用户对项目范围的预期情况进行的高层次说明，是用户对XXX系统具体输出要求的详述，是设备设计的依据，决定了该设备的性能，同时为该设备的设计、测试、验证提供了可接受标准依据。 3. 范围 本URS用于规定XXX的XXXX系统的用户需求说明。本URS不包括以下内容：无菌隔离器系统运行所需的洁净及公用工程安装相关的管道、管件及管道设计与安装要求将在另外的URS进行单独编制。 4. 术语和缩略语 在下面的表格中规定了本文件中使用的术语和缩略语。
消毒剂除菌过滤后检验方法验证方案
目录 1.0 概述 (3) 1.1 目的 (3) 1.2 范围 (3) 1.3 职责 (3) 2.0 可接受标准 (4) 3.0 确认前条件 (4) 1.1 人员确认 (4) 1.2 文件确认 (5) 4.0 文件记录要求 (5) 5.0 程序 (5) 5.1 仪器的确认 (5) 5.2 菌株、培养基及试剂 (5) 5.3 验证步骤 (7) 5.4 验证总结 (9) 6.0 再确认 (9) 7.0 偏差 (9) 8.0 变更 (10) 9.0 术语 (10) 10.0 参考文件 (10) 11.0 修订历史 (10) 12.0 附录列表 (10)
1.0概述 1.1目的 2010版GMP附录无菌第九章第四十四条A/B级洁净区应当使用无菌的或经无菌处理的消毒剂和清洁剂。本公司在A/B级洁净区使用的消毒剂有75%乙醇、过氧乙酸消毒液PAA，清洁剂为注射用水。 按2010版GMP第七章第一百四十条规定对该除菌方式进行验证。 1.2范围 本确认方案时应用于江苏复旦复华药业有限公司消毒剂除菌过滤后检验方法验证工作。 1.3职责 1.3.1QC检验员职责 QC检验员，同时作为验证实施部门，职责如下： 1.3.1.1起草验证草案，完成验证报告； 1.3.1.2负责对相关人员进行培训，确保验证工作按方案进行； 1.3.1.3负责本方案的实施，验证数据的收集及数据分析； 1.3.1.4协调进行验证中可能出现的偏差的调查、完成变更的书面记 录、完成验证报告； 1.3.1.5负责向QC部门经理及时报告验证中出现的问题。 1.3.2QC部门经理职责 1.3. 2.1QC经理审核本验证方案与验证报告； 1.3. 2.2负责指导验证中发生的偏差的调查及审核验证期间发生的 偏差； 1.3. 2.3负责安排具有资格的操作人员开展验证工作； 1.3. 2.4负责验证过程中的监督与指导等其它工作。 1.3.3QA职责 1.3.3.1负责确认工作实施的监督； 1.3.3.2协调进行验证中可能出现的偏差的调查、完成变更的书面记 录； 1.3.3.3为制定和实施本验证方案提供相关程序等必要文件、技术支 持；
9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
本指导原则是为药典要求无菌的药品、生物制品、原料、辅料、 及其他品种无菌检查用隔离系统的验证提供指导。 无菌检查用隔离器是为产品无菌检查试验提供无菌环境的一种 设备。封闭式隔离器不直接与外界环境相连，使用无菌接口或快速转 移通道进行物质传递，一般用于无菌检查；开放式隔离器允许材料通 过舱门进入，舱门内有一定的压力阻止微生物的进入。物品可通过无 菌传递进入隔离器， 整个传递过程中可保持隔离器内部空间和外部环 境完全隔离。 隔离器内部能够反复进行灭菌， 内壁可用杀孢子剂处理， 以去除所有的生物负载，灭菌完成后，隔离器通过高效空气过滤器 （HEPA）或更高级别的空气过滤器向其内部输送洁净空气来维持内 部的无菌环境。 隔离器的使用从根本上避免了操作人员与实验用物品 的直接接触，操作人员无需穿着专用洁净服，而是通过隔离器上的操 作手套或半身操作服对舱内物品、仪器进行操作。手套-袖套组件或 半身操作服是隔离器舱体不可分割的一部分， 它们由柔软的材料制成 且与所采用的灭菌剂兼容。因此，使用隔离器进行无菌检验，可以避 免实验用物品和辅助设备被污染，提高了无菌试验结果的准确性。 一．无菌检查用隔离器的结构 隔离器一般是由不锈钢、玻璃、硬质塑料或软质塑料（如聚氯乙 烯）建成。隔离器的结构一般包括： 1.空气处理系统 用于无菌检测的隔离器应配备可截留微生物的高效空气过滤系
统（或更高级别的过滤系统） 。静态时，隔离器内部环境的洁净度要 求应达到我国药品生产质量管理规范(GMP)现行版中 A 级空气洁净 度的要求。当隔离器与外界环境有直接开口时，内部应通过持续足够 的正压来维持隔离器内部的无菌环境。 2. 传递接口及传递门 灭菌后的培养基、 稀释液和实验用品可以通过带传递功能的灭菌 器直接无菌传递到隔离器内。此外，不同的隔离器也可以通过专门设 计的快速传递门（RTP）连接，以实现将实验物品在两个或多个隔离 器之间进行无菌传递。 RTP 上未经灭菌的表面通过互锁环或法兰互相 叠合，并通过密封圈封闭，从而防止微生物进入隔离器内。 3.灭菌设备 灭菌气体发生器与隔离器之间气体管路的连接，应确保其密封 性。在接近隔离器的部位，进气与排气管路上应分别安装有阀门，当 气体发生器与隔离器的连接、分离或隔离器进行无菌维持时，进、排 气管路阀门应予以关闭。灭菌气体或蒸汽应通过高效空气过滤器 （HEPA）进入隔离器内。灭菌结束后须对灭菌气体进行排空，保证 在进行无菌检测前，隔离器内部的灭菌气体浓度低于一定值，消除灭 菌气体对无菌检测的影响。 4.配套设备与辅助设施 隔离器内部安装无菌检查使用的配套设备与辅助设施， 如无菌检 查过程中使用的蠕动泵、真空泵及连续环境监控设备，其运行不得对 隔离器的内部环境造成影响， 配套设备上的电机等关键部件及排气口
dzprc 无菌隔离检测系统 技 术 文 件 苏州东中机械设备有限公司
1目的 1.1本文件参照2015版新药典要求设计，并且满足2015版药典规划标准。 我公司的用户需求说明为依据进行的设计、制造、安装、验证，为将 来设备的良好使用提供文件性的保证。 2范围 2.1该文件适用于无菌检测隔离系统的技术资料，最终解释权为苏州东中 机械设备有限公司。 3设备规范语录 3.1GAMP ：生产自动化管理规范。 3.2GMP：药品生产质量管理规范。 3.3IQ：安装确认。 3.4OQ：运行确认。 3.5PQ：性能确认。 3.6HDS：硬件设计标准。 3.7SDS：软件设计标准。 3.8FAT：工厂接收测试。 3.9SAT：现场接收测试。 3.10HEPA：高效空气过滤器 4、技术要求： 1.功率：2500W. 2.外形尺寸：实验舱：长1800mm*宽950mm*高1900mm,缓冲舱：500*600*600mm 3.系统运行时最大工作噪声<68dB；
*4.SIP：过氧化氢蒸气（VHP）） ，对嗜热脂肪芽孢杆菌达到6-log 的杀灭率； 5.CIP：人工擦拭，通过操作手套可实现对操作舱体人工冲洗。 6.通风排残：通风排残后舱体内VHP浓度<10ppm，此浓度条件对微生物检查结果无显著性影响； 7.洁净度：灭菌后，舱体内尘埃粒子，沉降菌，浮游菌测试结果符合静态A级标准； *8.舱体密封性（压降试验）：舱体在1.5倍的工作压力下，小时泄漏率<0.5%； 9.压力维持：0~80Pa可调节，无菌操作时保持40~60Pa，静态条件下压力维持至设定值±5Pa； 10.汽化过氧化氢分布均匀性测试； 10.1控制系统操作处设置急停按钮； 10.2设备外表面温度不高于45℃； 10.3控制系统能够抵抗手持无线电设备和设备周围1米范围内的手机信号干扰； *11.通风及空气过滤系统： 11.1隔离器内部为紊流式气流模型，送风与排风单元均位于隔离器的顶部； 11.2送风与排风均采用德国原装进口EBM风机，轴流风机（型号为12038B2）2只。均通过P LC 控制，在设定的舱内压力参数下，送风量与排风量均自动调节而无需任何人工干预； 11.3送风部分： 11.3.1采用室内取风，全新风并在经过H EPA 过滤前，通过初效过滤器预过滤； 11.3.2在风机与H EPA 之间安装一个由P LC 控制的电控蝶阀，无需人工干预； ； 11.3.3HEPA选用C amfil FARR，等级H14（过滤效率≥99.995%） 11.3.4HEPA 安装静压箱采用304 不锈钢制作，带有P AO/DOP 检测端口； 11.3.5系统含有送风H EPA 压差表，可提示用户H EPA 过滤效率； 11.4排风部分：舱内气体100%外排，在气体排出室外前，气体经过H EPA 过滤； 11.5西门子P LC 控制：运行参数实时显示；灭菌阶段联机控制；阶段之间自动切换；操作者权限控制；压力报警控制；工作状态下压力自动调节； *12.隔离器主要部件材质 12.1舱架非接触过氧化氢部位采用304不锈钢 12.2操作平台采用316L不锈钢，表面抛光小于0.8um Ra，所有焊接处均为满焊处理； 12.3舱体采用304 材质，采用高频焊接 12.4手套与袖套：袖套选用H ypalon 材质，手套选用丁腈橡胶材质。 12.3 门采用气密封方式进行密封 13.用户界面及数据接口 13.1触摸显示屏（SIEMNES，型号为smart 700）1套，可编程控制器（SIEMNES，型号为6ES7216-2BD23-OXB8）1套
浙江红雨医药用品有限公司 无菌检验方法 验证方案 验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日
1. 概述： 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2. 验证目的： 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 3. 验证范围： 适用于创可贴无菌检查法的验证。 4.验证人员及职责 5. 文件准备和培训 检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。 6. 验证条件 6.1. 仪表量器经过校验合格，且在有效期内。 6.2. 供试品：随机抽取浙江红雨医药有司生产的3个批次医用无菌创可贴
6.3. 培养基及试剂： 6.3.1. 试剂试液： 0.9%氯化钠、氯化钠—蛋白胨缓冲液，配制记录见附件1 6.3.2. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140221-00 改良马丁培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20131118-00 营养琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20150428-03 改良马丁琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140322-00 蛋白胨生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140417-00 培养基配制记录见附件2。 6.4. 验证用菌株： 金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】 铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】 枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】 生孢梭菌【CMCC（B）64941】 白色念珠菌【CMCC（F）98001】 黑曲霉【CMCC（F）98003】 标准菌株购自：浙江省食品药品检验研究中心 各验证用菌种传代记录见附件3。 6.5. 无菌检验仪器及相关设备： 压力蒸汽灭菌器 型号：YXQ-LS-50S11 生产厂家：上海博讯仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（细菌培养） 型号：SPX-250 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（霉菌培养） 型号：SPX-250B 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24
【手把手教你】验证（六）—无菌隔离器 隔离器：以下是对于使用以及这些系统适用性的简要介绍，环境控制系统的主要目标之一是通过防止可能会改变产品纯度、含量与安全性的污染来保证工艺的完整性和质量。使用内置或附加灭菌系统的隔离技术能够提供高度的无菌保证水平，因为其消除了微生物污。染的主要来源之一：人。为达到此目的，这些单元设计应当取得实际效果。考虑所有这些要素内部的相互作用，需要在设计阶段审慎研究。对于使用无菌工艺的大容量产品尤其如此。机械设备的整合，监控设备，产品与容器的传递装置、灭菌装置，清洁装置以及人员，都需要仔细考虑。 一般情况下，这些单元是预先焊接、自我密闭的仓室或手套箱，对其能够进行原位灭菌，以防止无菌产品直接暴露到人员与周围环境中。为了能提供适当隔离，这些装置配备微生物过滤器（高效过滤器或更高）来保持仓室的压力以及完整性。输送装置设计用来避免在无菌工艺需要的部件进人或传出时周围环境直接地接触仓室。 所使用的建筑材料应当与清洁和灭菌程序兼容。周围环境不应直接影响隔离器保持内部环境条件的效率。制造后以及在操作的连续监测中，仓室的完整性必须核实。这些系统通常已经安装有接收在线灭菌(S IP )或在线清洁（C IP )所需要的无菌气体或液体，以及内部部件进人的装置。 隔离器原位灭菌的验证与确认的注意事项： 所使用的灭菌系统作为屏障或隔离器的一部分要用特定的验证程序来证明其能 够有适当的安装、运行与性能。虽然安装与运行的验证程序类似于空调净化系统，但性能确认需要使用适当的微生物进行挑战试验。为此目的，生物指示剂在内部受控环境中应有足够的数量，来证明所有关键单元内部灭菌的有效性(致死性）及灭菌剂的穿透性，特别是那些被认为难以达到的部位。 隔离器完整性确认： 有各种方法来测试与证实手套箱或隔离器的部件完整性。验证程序应当考虑挑战试验来证明所保护的产品与周围环境“直接隔离” ，以及达到隔离器工艺活动与周围环境（生物危害工艺）“ 反向隔离” 。使用化学试剂，以仓室压力作为标准来测试完整性。 隔离器的在线清洁系统确认： 该验证程序应当考虑具体的挑战，以证明在线清洁系统在清洁周期实施后满足预先规定的清洁度水平能力。在这里适用典型的“ 清洁验证方法” 。 生物危害污染控制： 随着生物技术工艺出现，需要考虑工艺区域的隔离的重要性了。一些考虑在这些设施的设计以及运行中充分考虑安全性以及无菌工艺要求。在某些情况下，这些因素的相关性可能因为工艺不同而不同，但他们通常密切相关（例如，涉及病毒灭活工艺，要求与上游的病毒灭活前的完全无病毒的物料完全隔离）。
类别：编号: 部门：页码: 无菌检验方法验证 版次：□新订口替代: ________________ 制定人: ___________________ ____________ H H 日审批会签: _____________________________________________
1.1 确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2 确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整 性。 2. 验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3. 检验依据 《中国药典》附录无菌检查法 ISO11737-2: 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分: 确认灭菌过程的无菌试验 GB/T14233.2- 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分: 生物学试验方法 4. 验证器材 4.1 检验环境: 无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部100 级的单向流空气 区域内进行操作。 4.2 设备: 医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、 电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH 计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 4.3 培养基及稀释液: 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液、0.1% 蛋白胨水溶液、营养琼脂。 4.4其它实验材料：微孔滤膜（孔径w 0.45um,直径约50mm）、无菌过滤杯、无 菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。
5.1 原理: 活检钳的形状为不溶物, 为微生物转移更彻底, 特选用无菌检查法中的 薄膜过滤法。 5.2 设备器材: 验证中所用器材、设备已经过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 5.3 培养基: 验证中所用培养基以经过培养基灵敏度实验检测合格。 5.4 操作步骤: 5.4.1 供试品的取样按照GB/T 2828.1- 相关规定进行逐批取样。 5.4.2 将所需物品, 供试品表面消毒, 经过传递窗, 紫外线照射半小时. 无菌室紫 外线消毒半小时。 5.4.3 操作人员用洗手液、自来水清洗双手, 关闭紫外灯, 换拖鞋, 脱外衣放入衣 柜, 穿洁净白大衣, 进入缓冲间, 再用洗手液、纯化水清洗双手, 用75% 乙醇对手进行消毒, 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。 5.4.4 进入菌检室, 打开医用洁净工作台风机, 运行至少15分钟以上。 5.4.5 将所需物品由传递窗取出, 两只消毒液桶分别放置于菌检洁净工作台一侧, 其余物品放置于传递窗一侧的方形桌上, 剥去牛皮纸外包装。 5.4.6 医用洁净工作台内点燃酒精灯。打开3个养琼脂平板, 置于医用洁净工作 台的不同位置。 5.4.7 取供试品, 在医用洁净工作台内, 打开包装袋, 小心将供试品取出, 将其剪成 约10cm的小段，浸入500ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液中，充分振摇作为供 试液。 5.4.8 将供试液平均转入三个薄膜过滤器的滤杯中, 开启电动吸引器开关进 行过滤，用pH7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液每次100ml冲洗滤膜三次，用平口镊子夹取滤膜（过程保持滤膜的完整性） , 一张转移到100ml 改
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释：
无菌检验——隔离器系统验证 USP <1208>Sterility Testing—Validation of Isolator System/General informance 这部分是用于无菌检验隔离器系统的简明验证指南（注意：在这个章节中，“已灭菌”指的是物品或者表面的微生物被清除的状态）在19世纪80年代中期，建立一个无菌检验环境的隔离器就已经开始使用。隔离器可以通过密封的方法或者采用过滤除菌空气保持正压的方法，创造一个无菌的环境。当隔离器处于密闭状态时，仅仅能够在隔离器内部和快速传递仓传递物品；当隔离器打开时，允许通过一个特殊设计的并经过验证可以避免污染物进入的开口递出物品。隔离器采用柔软的塑料（例如聚氯乙烯）、硬塑料、玻璃或不锈钢制造。 由于隔离器系统从根本上避免了分析人员与物品的直接接触，因此在无菌检验操作时可以避免物品和辅助设备被污染。当隔离器内部与环境完全隔离时，隔离器内部的物品是无菌条件下的传递。操作者穿着半身衣在隔离器内部进行无菌操作，半身衣是连接在隔离器墙体上的柔软的部分，操作者穿着半身衣有足够的范围在隔离器内部进行操作，操作者也可以通过连接在隔离器墙体上的袖子和手套进行操作。在隔离器中，不要求操作者穿着特殊的无菌衣进行操作，允许操作者穿着标准的实验室服装进行操作。为确保隔离器内部无菌。使用杀孢子剂对隔离器内部进行灭菌处理。隔离器设计和建造 空气处理系统 用于无菌检验的隔离器需要配备除菌过滤器（HEPA过滤器是被要求的）。静态时，要求隔离器尘埃粒子符合美国联邦标准209E的100级空气质量要求（看洁净室微生物评价和其他环境控制《1116》）。动态时，不要
XXX无菌检验方法学验证方案 编号：VP.SV.039.00
目录 验证方案的审批 验证小组名单 验证实施进度 技术性文件 引言 1．概述 2．验证目的 3．职责 无菌检查方法学的确认 再验证周期
验证方案审批
验证小组名单 验证实施进度 技术性文件
引言 1.概述 1.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH规定，当建立药品的无菌检查方 法时，需进行方法学的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的检测。当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。 2.验证目的： 2.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH无菌检查方法要求，通过试验， 寻找合适的材料、条件和方法，最终确定氧氟沙星滴眼液的检验方法，并将其定为日常检测的正式方法。 3.职责 3.1验证办 3.1.1负责验证方案的审批。 3.1.2负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施。 3.1.3负责验证数据及结果的审核。 3.1.4负责验证报告的审核。 3.1.5负责再验证周期的确认。 3.2质量监控部 3.2.1负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。 3.2.2负责仪器、仪表、量具的校正。 3.2.3负责取样及样品检验。 3.2.4负责收集各项验证、试验记录，对结果进行分析，起草验证报告，报验证办。 3.2.5负责拟订验证方案。 3.2.6负责组织试验所需设备。 3.2.7负责按照验证方案里各项操作步骤进行操作。 3.2.8负责保证设备的正常运转。
无菌检查方法学的确认 1.验证环境、设备及实验前准备： 1.1无菌室内（无菌检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域或 隔离操作器内完成。由QA人员定期按国家相关要求进行环境监控。 1.2仪器和设备：①GSP-9080MBE型隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗 设备厂）；②生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；③AL204型电子天（梅 特勒—托利多仪器有限公司）；④GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实 业有限公司医疗设备厂）；⑤YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公 司医疗设备厂）；⑥HTY-2000A集菌仪、全封闭集菌培养器可重复使用集菌培养器（杭 州高得·泰林医疗器械有限公司）；⑦超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备 厂)；。⑧微孔滤膜（孔径0.45μm直径50mm）… 1.3供试品： 1.4所需培养基： 1.4.1硫乙醇酸盐流体培养基（细菌培养）；批号：050104；灵敏度：应符合定 厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁培养基（真菌培养）；批号：050106 ；灵敏度：应符合规定 厂家：北京三药科技开发公司； 营养琼脂培养基（分离单个菌落及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁琼脂培养基（培养真菌及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 1.5稀释液、缓冲液： 0.9%氯化钠溶液；PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (配制方法参照chp2005附录—90页) 1.6验证用菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44 102] 生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；黑曲霉[CMCC（F） 98 003]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]。（以上菌种均由湖北省药品检验所提供）1.7培养基的无菌检查：培养基配制好并采取验证合格的灭菌程序灭菌后随机取 5瓶 (管)，培养 14 天，结果应无菌生长。 2.方法学验证: 2.1简要方法说明：本品为喹诺酮类抗生素，通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
附件一无菌操作用隔离器 APPENDIX 1: ASEPTIC PROCESSING ISOLATORS 无菌操作用隔离器将无菌操作生产线和外部的洁净室环境隔离，并且将无菌生产过程中操作者直接接触（无菌生产线或产品）的可能性降到最低。一个设计良好的保持正压的隔离器，在有适宜的规程维持、监测、控制的情况下，与传统的无菌操作相比，有显著的优势。尤其在操作过程中微生物污染的机会极低。然而，使用者仍然需要注意操作中潜在的风险。应当意识到建立一个新的针对隔离器使用的规程是必须的。 A 维护 1.通则 与传统的非隔离器无菌操作相比，隔离器系统的维持在一些侧重点上是不同的。虽然隔离器在形式上没有绝对的密封，但一个设计良好的隔离器单元可以达到很高的完整性。然而，隔离器系统上的一个位置的泄露就能够破坏其完整性。除了手套、半身衣、衔接处的完整性应当通过全面的预防维护程序进行日常关注和记录之外。对于隔离器的各部位，要有一个定期更换的书面规定，以确保这些部位在破损或老化之前被更换。传递系统、垫圈和密封处以及其他部位的维护要包括在书面维护程序中。 2.手套完整性 一个有缺陷的手套或袖子（长手套）会形成污染的通道，也是隔离器完整性的一个关键的破损。手套完整性的预防性维护程序应当被建立。选择持久耐用的手套材料、进行周期性适宜的更换，是保持手套完整性，维持优良生产操作的关键。每次使用，应当对手套目视检查肉眼可见的破损。物理性的完整性测试也应当周期性进行。手套破损能够产生严重后果。合适的监控和维护程序能够识别手套的完整性，并且能够更换任何破损的手套，从而将无菌产品的风险降到最低。 由于手套上可能存在潜在的可以通过微生物的孔洞，同时缺乏高灵敏度的完整性检测方法。我们建议对于隔离器上安装的手套内表面消毒质量引起关注，同时配合使用第二副薄手套。 B．设计 1.气流 有两种类型的无菌操作隔离器：开放型和密闭型。密闭型隔离器使用辅助设备进行连接，解决材料的传递问题。开放型隔离器对周围环境有开放口，采用谨慎的技术通过正压的方式使隔离器内部环境和背景房间环境隔离。 对于密闭的隔离器系统，湍流是可以接受的，密闭隔离器通常尺寸紧凑并且没有大的房间类型的生产线。另一种无菌过程隔离器应用单向流吹扫和保护暴露的无菌材料，要避免暴露的无菌原材料、产品和密闭容器上出现乱流或者气流停滞情况。在大多数合理的设计中，无菌空气吹过关键区域一次，然后就被排除出（隔离器）系统之外。空气处理系统要有能力维持隔离器内部的环境条件要求。 2.建筑材料 象任何无菌过程设计一样，选用的材料要基于耐用性、容易清洁并且容易去除污染。例如：坚硬的一体化的不锈钢和玻璃材料被广泛使用于制造墙体结构。 3.压差 向外开口隔离器设计时应当能够确保隔离器和外界环境完全分离。一个合适的正的压差应当应用在隔离器上，实现对隔离器内部和外界环境的隔离，正的压差数值要有对隔离器运行状况研究的支持。正的压差范围一般从从17.5Pa到50Pa。最小微压差的制定依赖于系统设计和隔离器所用的出口舱门。隔离器和其他接口的分界面（例如干热隧道）的气流平衡应当被验证。
无菌检测风险控制 无菌检测的风险 假阳性：结果呈阳性，但污染不是产品所带来的，而是其他方面，比如测试环境、方法、人员、操作等方面所带来的污染。这种结果带来的后果往往是企业花费大量的人力、物力和财力去进行长时间的调查，调查后却找不到污染的根本原因，整批产品遭到报废，并且法规禁止不以发现造成污染的根本原因为目的而只是重复测试的行为。 假阴性：结果呈阴性，但产品本身是存在微生物污染的，是由于微生物受到抑制或伤害没有恢复出来才没有生长。这种情况下，厂家会释放产品，导致的后果有可能是，给药后，微生物在合适的环境下大量增殖，病人遭受严重的伤害甚至危害到患者的生命。而企业则会面临产品召回，品牌受损甚至工厂关闭风险。 无菌检测环境因素 关于环境因素，主要是防止在试验过程中的外来污染对于检测过程的影响，防止假阳性的出现。尤其是针对于直接接种法和开放式薄膜过滤法的无菌检测方法，外部环境的污染问题就成为无菌试验假阳性的最大可能。因此目前封闭式薄膜过滤法应用的越来越多。即便如此，外部环境的影响仍然对于样品检测是非常大的风险。目前对于环境控制的方法主要有两个：B级下的局部A级（万级下的局部百级——2010版）操作区域，或者隔离器中进行无菌操作。如果操作正确的话，两种方式均能够给我们的实验室实现“近似”无菌的操作环境。 洁净室中进行无菌检测 对于B级下的A级（国内通常是万级下的百级）操作区域，通常是由层流台来实现的，无论是垂直层流还是水平层流都能够满足我们的无菌检验需求。但是从工作原理上看，生物安全柜并不适合进行无菌试验。应该定期对于层流台进行检测，尘埃粒子、风速、沉降菌、浮游菌等关键技术指标以保证该系统处于正常的工作状态之中。对于万级设施，应该将其等同视为生产区洁净室进行控制，给局部百级一个较好的外部环绕环境，能够更好地保证局部百级的运行。 在实验过程中，无菌的保持也非常重要，特别是防止交叉污染，人员的操作和物品的位置移动都会造成这样的情况。这就对人员的要求非常高，特别是对于“无菌意识”的提高，通常是最容易讲但是也最难培训的技能和意识。整个检测过程中一定要注意几个原则：1．物品可以从洁净的“高级别”到“低级别”转移，但是不可以从“低级别”到“高级别”转移。进入洁净室的人员必须经过无菌穿衣验证，只有有资质的人员才可以进入洁净室。 2．手作为交叉污染的媒介，应该及时定期对手套使用消毒剂进行清洁，如果有微生物污染风险较高的操作，应该及时对手套和无菌衣进行更换。 3．所有需要进入实验操作区域的物品必须在经过适当处理后才进行操作。 4．试验过程中一定要注意人的操作对于气流和待试验物品的污染。所有物品的去污染化，主要指的是物品的灭菌处理和转移方式。对于可以进行高温高压进行过度灭菌的物品，应尽量采取使用这种方式（如果有双门消毒锅可以直接从无菌室将灭菌完毕的产品取出，如果没有双门消毒锅，则需要将灭完菌的物品再次通过传递窗传入洁净室），如果该物品无法
一次性使用无菌医疗器械无菌试验 方法验证方案 编制：日期： 审核：日期： 批准：日期：
1.验证目的 通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。 2.样品信息 3.实验设备及器材 3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。 4.验证组成员及职责 姓名部门职责 品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准 品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施 品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作 5.验证依据 《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005 6.验证步骤 6.1检测设备计量有效性验证 确认以下设备经过校量并在有效期内 设备名称是否校验是否在有效期内备注 灭菌锅 洁净工作台 生物安全柜 电子天平
电热恒温箱 霉菌培养箱 确认人/日期：审核/日期： 6.2培养基适用性检查 6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。 表1
6.2.2灵敏度检查 6.2.2.1菌液制备方法描述 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.2.2培养基接种 取每管将量为12ml的硫乙醇酸盐液体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 6.2.2.3结果判断，空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 6.2.2.4试验结果见表2 表2 培养基试验液是否长菌菌生长情况培养条件判定 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球 菌1ml 1. 30℃-35℃培 养3天 2. 铜绿假单胞菌 1ml 1. 2. 生饱杆菌1ml 1. 2. 空白对照 胰酪大豆胨枯草芽孢杆菌 1.20℃-25℃培
目录 1 概述 (1) 2 验证目的 (1) 3 适用范围 (1) 4 职责 (1) 5 验证人员 (1) 6 验证要求 (1) 7 验证工艺 (2) 8 工艺描述 (2) 9 取样计划及可接受标准 (5) 10 验证过程 (6) 11 验证结果与评价 (8) 12 偏差 (10) 13 稳定性试验 (10) 14 再验证[] (10)
1概述 1.1产品描述 1.2公司生产的*****为无菌原料药，其工艺验证主要为工艺过程的验证，包括 精制结晶、过滤洗涤烘干、包装和无菌生产验证，以及不溶性颗粒的控制。 1.3验证采用同步验证，取连续三批试生产批的数据利用制图（或表）统计分 析方法进行数据分析。 1.4本验证是在厂房设施验证、设备验证、设备清洗验证、工艺用水验证、无 菌生产验证已完成的基础上进行的。 2验证目的 通过验证证明*****无菌原料药的生产工艺处于控制状态，所有被定义为关 键工艺及控制参数范围已被验证，此工艺能恒定地生产出符合预先规定的质 量标准的产品。 3适用范围 适用于公司*****无菌原料药生产工艺的验证 4职责 4.1生产技术部负责验证方案和验证报告的起草、生产计划的安排（包括与各 部门的协调）。 4.2生产车间负责生产的进行和批生产记录的填写。 4.3质量管理部负责检验方法的验证和中间过程、产品的检测。 4.4验证工作组负责验证方案和验证报告的审核和批准。 5验证人员 姓名所在部门职务验证分工 6验证要求 6.1所有原辅料必须通过各个原辅料测试标准规定的所有项目 主要原辅料检测情况 原辅料名称产地批号质量标准检测结果检测报告编号结论备注 6.2所有仪器、仪表均校验合格，所有设备性能确认完好 6.2.1仪器、仪表校验情况
无菌检查方法的验证 无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法，是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要，而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础，因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2010版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是GMP检查中检查的重点和容易发现问题的区域。 验证要求与方法 无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。 前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。 再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。 通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。 这里，验证的重点环节包括： 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。 供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。 具体的验证方法如下： 菌种的选择 无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]代表霉菌。 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，