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低氧条件下血红素加氧酶１过表达对
人肝癌细胞的保护作用
梁飞朱晓洁王秀宏
【摘要】目的探讨低氧条件下人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）中血红素加氧酶１（ＨＯ－１）过表达对细胞的保护作用，及其与低氧诱导因子ｌＱ（ＨＩＦ—ｌｅｔ）的关系。方法应用低氧气体（０．５％０：、９４．５％Ｎ２、５％Ｃ０２）和化学模拟低氧（２５０ｉｘｍｏＬ／ＬＣｏＣｌ２）方法刺激ＨｅｐＧ２细胞。采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ—ＰＣＲ）方法，从ｍＲＮＡ水平上检测低氧条件下ＨＯ－１和ＨＩＦ—ｌｄ的表达。采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｏｌｔ方法，从蛋白水平上检测低氧条件下ＨＯ－ｌ和ＨＩＦ．Ｉｄ的表达及其相关性。采用四甲基偶氮唑蓝（ＭＴｒ）方法，分析低氧刺激后细胞的存活率，以及低氧刺激同时抑制ＨＯ．１蛋白表达后细胞的存活率。采用超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）试剂盒，检测低氧刺激细胞后总ＳＯＤ的活性，以及抑制ＨＯ—ｌ蛋白表达后细胞中总ＳＯＤ的活性。结果低氧诱导的ＨｅｐＧ２细胞中，ＨＯ一１ｍＲＮＡ和蛋白过表达。用锌原卟啉ＩＸ（ＺｎＰＰＩＸ）抑制低氧条件下ＨＯ．１蛋白过表达，可导致ＨｅｐＧ２细胞在低氧应激条件下存活率明显降低（Ｐ＜０．０１）。低氧条件下，ＨｅｐＧ２细胞中总ＳＯＤ的活性显著升高（Ｐ＜０．０５）；而在抑制低氧条件下ＨＯ－１蛋白过表达后，ＨｅｐＧ２细胞中总ＳＯＤ活性明显降低（Ｐ＜０．０１）。低氧条件下，ＨＩＦ－ｌｅｔ蛋白表达显著升高，抑制ＨＩＦ—ｌａ蛋白表达后，ＨＯ．１蛋白表达明显降低；而抑制低氧条件下ＨＯ一１的过表达后，ＨＩＦ－Ｉａ蛋白表达没有明显改变。结论低氧诱导ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ－１蛋白的过表达依赖或部分依赖ＨＩＦ—ｌｅｔ；ＨＯ?１的过表达对ＨｅｐＧ２细胞抵抗低氧应激发挥保护作用；ＨＯ一１的过表达对处于低氧应激条件下细胞的保护作用可能源于ＳＯＤ。
【主题词】血红素加氧酶１；低氧诱导因子ｌｄ；ＨｅｐＧ２细胞；存活率；超氧化物歧化酶
ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆＨＩＦ．１ｄ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＨＯ．１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｉｌｈｙｐｏｘｉｃｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＨＡＮＧＦｅｉ，ｚＨＵＸ洒—洳。ＷＡＮＧＸｉｕ?ｈｏｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈ盯ｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｈａｒｂｉｎ１５００８６。Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧＸｉｕ一７易，Ｗ，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｈ７００４１７＠ｙａｈｏｏ．ＣＯｒｎ．ｃｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｅｌｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｅｉｎｅｏ孵ｎａｓｅ?ｌ（ＨＯ－１）ｉｎｈｙｐｏｘｉａａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＨ０．１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｏｉｎａｎｄｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ．１ｅｔ（ＨＩＦ－ｌｅｔ）ｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＨＯ．１ａｎｄＨＩＦ．１ｅｔｍＲＮＡ舳ｗｅｌｌ鹊ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ．ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＭＶＩ＂ａｓｓａｙＷ８８ｕｓｅｄｔｏｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ．ｎ圮ｔｏｔａｌｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ａｃｔｉｖｉｔｙＷａｓｅｘａｍｉｎｅｄｗｉｔｈａＳＯＤｋｉｔ．ＲｅｓｕｌｔｓＨｙｐｏｘｉａｊｎｄｕｃｅｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨ０．１ｇｅｎｅｉｎＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓａｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌｓ．噩ｌｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａＷａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｔｈｅＨ０－１ｐｒｏｔｅｉｎｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙ
ＺｎＰＰＩＸ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅｔｏｔａｌＳＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｅｌｌｓＷａＳｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａｆｏｒ１６ｈｏｕｒｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｂｙＨＯ—ｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒＺｎＰＰＩＸｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｐ＜０．０１）．ＨＩＦ．１Ｃｔｗ昭ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ。ｔｈｅＨＯ－１
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ｈｙｐｏｘｉａｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｈａｎｇｅｄａｆｔｅｒＨＯ．１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＷａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＺｎＰＰＩＸ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，１１砣ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＨＯ．１ｉｎｈｙｐｏｘｉｅＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｉｓＨＩＦ．１ａ－－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｒａｔｌｅａｓｔｐａｒｔｌｙＨＩＦ．１Ｑ．ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｕｒｖｉｖａｌｒｏｔｅｏｆｈｙｐｏｘｉｃｈｅｐａｔｏｍａｃｅＨｓＷａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙＨ０一ｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓＳｉｌｌｄｙｍａｙｏｆｆｅｒｎｅｗｔｈｏｕｇｈｔａｎｄｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｆｏｒｔｈｅｔｈｅｒａｐｙｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａｉｎｔｈｅｆｕｔＵｒｅ．
【ｓｕｂｊｅｃｔｗｏｒｄｓ】Ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ一１；Ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ—ｌａ；Ｈｅｐａｔｏｍａ．ＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓ；
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３－３７６６．２００９．０８．００６
基金项目：黑龙江省自然科学基金（０２００６０９）；黑龙江省博士后启动基金
作者单位：１５００８６哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室
通信作者：王秀宏，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｈ７００４１７＠ｙａｈｏｏ．ｃ啪．ｔ３ｎ
?５８７?．基础研究．
Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ；Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ
生堡鲑擅盘盍呈堂生§月筮≥！鲞筮！魍鱼丛！』Ｑ！型，丛趔！塑，！丛：！！，№：！
血红素加氧酶（ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＨＯ）是分解血红素的限速酶，有３种同功酶，ＨＯ－１属于诱导型，通常情况下表达量很少。有研究显示，ＨＯ—ｌ及其代谢产物在各种原因造成的机体损伤中发挥抗炎ｕＪ、抗氧化【２’和抗凋亡作用ｐ圳。肿瘤细胞的迅速、大量增殖，以及抗肿瘤治疗效应，使细胞处于低氧缺血状态，大部分肿瘤细胞可以通过各种途径来适应这种低氧缺血的状态，从而对治疗产生耐受，甚至侵袭力变强∞引。但是，关于ＨＯ－１在肿瘤对低氧耐受中的作用机制尚不清楚。
细胞对低氧应激的反应主要依赖低氧诱导因子１（ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ?ｌ，ＨＩＦ一１），它是一种重要的转录因子，由ＨＩＦ．１ｅｔ和ＨＩＦ—ｌＢ组成，其中ＨＩＦ一１ａ是主要的氧调节亚基。本实验中，我们探讨了ＨＯ．１对ＨｅｐＧ２细胞抵抗低氧应激的保护作用，以及ＨＯ．１过表达与ＨＩＦ—ｌ０Ｌ的相关性和对超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）活性的影响。
材料与方法
１．细胞培养和试剂：用含１０％胎牛血清的１６４０培养基培养ＨｅｐＧ２细胞，待细胞生长密度达７０％一９０％时，继续培养或给予不同刺激［低氧气体（０．５％Ｏ：，９４．５％Ｎ：，５％ＣＯ：）或化学模拟低氧（２５０仙ｍｏＬ／ＬＣｏＣｌ：）］，至指定时间后收集细胞。
２．ＲＮＡ提取和逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）：提取实验各组细胞的ＲＮＡ后，按照
ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ．ＰＣＲ试剂盒说明操作。
３．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测蛋白表达：提取实验各组细胞蛋白后，用ＢＣＡ法绘制蛋白浓度标准曲线，测定样品蛋白浓度。所用抗体为抗ＨＩＦ一１０ｔ单克隆抗体（１：５００）、抗ＨＯ．１多克隆抗体（１：５００）和抗Ｂ—ａｃｔｉｎ多克隆抗体（１：５００）。
４．四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＹ）法：将细胞接种于９６孔板中（每孔约６×１０２个细胞），放入３７℃孵箱，４８ｈ左右（细胞密度约７０％一９０％）吸尽培养基，按实验要求加入正常培养基以及含不同浓度的锌原卟啉ＩＸ（ＺｎＰＰＩＸ）培养基，通低氧混合气体或加入Ｏ．１ｍｏｌ／ＬＣｏＣｌ２，使ＣｏＣｌ２终浓度为２５０Ｉｘｍｏｌ／Ｌ。将９６孔板放入３７℃孵箱中培养１６ｈ后取出，吸净培养基，每孔加ＭＴｒ溶液（５ｍｓ／ｒｉｄ）２０出，放入３７℃孵箱，继续孵育４ｈ，弃上清，每孔加１５０一二甲基亚砜，振荡１０ｒａｉｎ，用酶标仪测定４９０ｎｎ］处吸光度（Ａ）值，计算细胞的相对存活率。
５．测定细胞总ＳＯＤ活性：用ＳＯＤ试剂盒测定实验各组细胞中总ＳＯＤ活性。
６．统计学方法：采用ＳＰＳＳ统计软件对数据进行统计分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结果
１．低氧对ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ一１表达的影响：与正常组比较，低氧气体刺激条件下，ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ－１ｍＲＮＡ和蛋白表达明显升高，其中以１６ｈ最为明显（图ｌａ、ｌｂ）。ＣｏＣｌ：刺激ＨｅｐＧ２细胞６ｈ后，ＨＯ－ｌｍＲＮＡ的表达明显升高（图ｌｃ）；１６ｈ后，ＨＯ一１蛋白过表达最为明显（图ｌｄ）。
Ｎ：正常组；Ｈ：低氧气体组；Ｃ：ＣｏＣｌ２组；ｌａ：低氧气体刺
激不同时间后ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ－ｌｍＲＮＡ表达；ｌｂ：低氧
气体刺激不同时间后ｎｅｐＧ２细胞中ＨＯ－ｌ蛋白表达；ｌｃ：
ＣｏＣｈ刺激不同时间后ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ－１ｍＲＮＡ表达；
ｌｄ：ＣｏＣｌ２刺激不同时间后ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ—ｌ蛋白表达
田１低氧对ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ一１表达的影响
２．低氧对ＨｅｐＧ２细胞中总ＳＯＤ活性的影响以及抑制低氧条件下ＨＯ一１蛋白高表达后细胞中总ＳＯＤ活性的变化：与正常组相比，低氧气体和ＣｏＣｌ：刺激ＨｅｐＧ２细胞１６ｈ后，细胞中总ＳＯＤ活性明显升高（Ｐ＜０．０５，图２ａ）。利用ＨＯ一１抑制剂ＺｎＰＰＩＸ（２．０Ｉ－Ｌｍｏｌ／Ｌ）处理低氧条件下的ＨｅｐＧ２细胞，可以显著抑制低氧气体和ＣｏＣＩ：刺激条件下ＨＯ．１蛋白的过表达（Ｐ＜０．Ｏｌ，图２ｂ）。实验结果显示，ＨＯ一１蛋白的表达被抑制后，ＨｅｐＧ２细胞中总ＳＯＤ活性明显降低（Ｐ＜０．０１，图２ｃ）。
３．低氧对ＨｅｐＧ２细胞中ＨＩＦ．１ａｍＲＮＡ和蛋白表达的影响：在低氧气体刺激和ＣｏＣＩ：刺激条件下，ＨｅｐＧ２细胞中ＨＩＦ．１仅ｍＲＮＡ的表达水平没有明显改变（图３ａ、３ｂ）；而蛋白的表达水平显著升高，其中以低氧气体刺激１６ｈ和ＣｏＣｌ：刺激１６
ｈ后最为明
显（图３ｃ、３ｄ）。
Ｎ：正常组；Ｈ：低氧气体组；Ｃ：ＣｏＣｈ组；Ｈ＋ｚ：低氧
气体加ＺｎＰＰＩＸ组；Ｃ＋Ｚ：ＣｏＣｌ２加ＺｎＰＰＩＸ组；２ａ：低
氧气体和ＣｏＣｌ２刺激１６ｈ后Ｈｅｐ（；２细胞中总ＳＯＤ活性
变化；２ｂ：ＺｎＰＰＩＸ对低氧气体和ＣｏＣｈ刺激条件下
ｒｈｐＧ２细胞中ＨＯ一１蛋白表达的抑制效应；２ｅ：抑制低
氧应激条件下ＨＯ－Ｉ蛋白表达后，｝姊晓细胞总ＳＯＤ活性
的变化
圈２低氧对ｒｌｃｐＧ２细胞中总ＳＯＤ活性的影响
Ｎ：正常组；Ｈ：低氧气体组；ｃ：ＣｏＣｌ２组；３ａ：低氧气体刺激不同时间后ＨｅｐＧ２细胞中ＨＩＦ—ｌｏｔｍＲＮＡ表达；
３ｂ：ＣｏＣＩｚ刺激不同时间后ＨｅｐＧ２细胞中ＨＩＦ－ｌａｍＲＮＡ
表达；３ｃ：低氧气体刺激不同时间后ＨｅｐＧ２细胞中
ⅢＦ．１ｅｔ蛋白表达；３ｄ：ＣｏＣｈ刺激不同时间后ＨｅｐＧ２细胞中ＨＩＦ—ｌａ蛋白表达
图３低氧对ＨｅｐＧ２细胞中ｍＦ．１ｄ表达的影响
?５８９?
４．抑制ＨＩＦ—ｌｏｔ蛋白表达对ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ．１蛋白表达的影响：采用ＨＩＦ－ｌｅｔ的抑制剂ＹＣ．１处理低氧条件下的ＨｅｐＧ２细胞，可以显著抑制低氧气体刺激条件下和ＣｏＣｌ：刺激条件下ＨｅｐＧ２细胞中ＨＩＦ—ｌｏｔ蛋白的表达（图４ａ、４ｂ）。ＨＩＦ－ｌａ蛋白的表达被抑制的同时，ＨＯ—ｌ蛋白的表达水平也相应地下降（图４ｃ、４ｄ）。
Ｎ：正常组；Ｈ：低氧气体组；Ｈ＋Ｙ：低氧气体加ＹＣ－１
组；ｃ：ＣｏＣｈ组；ｃ＋Ｙ：ｃｏｃｈ加Ｙｃ－１组；４ａ：低氧气
体刺激条件下ＹＣ—ｌ对ＨＩＦ－１０ｔ蛋白的抑制效应；４ｂ：
ＣｏＣｌ２刺激条件下ＹＣ－１对ＨＩＦ—ｌｏｔ蛋白的抑制效应；
４ｃ：抑制低氧气体刺激条件下ＨＩＦ—ｌｅｔ蛋白表达后
ｒＩｅｐＧ２细胞中ＨＯ－１蛋白的表达；４ｄ：抑制ＣｏＣｈ刺激
条件下ＨＩＦ?ｌｅｔ蛋白表达后ＨｅｐＧ２细胞中Ｈ０?１蛋白的
表达
圈４抑制ＨＩＦ－ｌｏｔ蛋白表达对ＨＯ一１蛋白表达的影响
５．抑制低氧条件下ＨＯ．１蛋白表达对ＨＩＦ—ｌｅｔ蛋白表达的影响：采用Ｚｎ＿ＰＰＩＸ抑制低氧条件下ＨＯ一１蛋白表达后，在低氧气体刺激条件下和ＣｏＣＩ：刺激条件下ＨＩＦ—ｌａ蛋白的表达并没有明显改变（图５）。
Ｎ：正常组；Ｈ：低氧气体作用１６ｈ组；Ｈ＋ｚ：低氧气体
加ＺｎＰＰＩＸ组；Ｃ：ｃｏｃｈ作用１６ｈ组；Ｃ＋ｚ：ＣｏＣｈ加
ＺｎＰＰＩＸ组；５ａ：抑制低氧气体刺激条件下ＨＯ．１蛋白表
达后ＳｅｐＣ２细胞中ＨＩＦ－ｌａ蛋白的表达；５ｂ：抑制
ＣｏＣｈ刺激条件下ＨＯ－１蛋白表达后ＨｅｐＧ２细胞中ＨＩＦ．
１理蛋白的表达
图５抑制ＨＯ?１蛋白表达对ＨＩＦ．１ａ蛋白表达的影响
６．抑制低氧条件下ＨＯ－ｌ蛋白表达对ＨｅｐＧ２细胞存活率的影响：采用不同浓度的ＺｎＰＰＩＸ抑制低氧条件下ＨＯ－ｌ的过表达后，在低氧气体刺激条件下和ＣｏＣｌ：刺激条件下ＨｅｐＧ２细胞的存活率明显
降低（尸＜０．０１），而且呈ＺｎＰＰＩＸ浓度依赖性（图６）。
１．２
１．０璧ｏ．８社
靛０．６星０．４崭
０．２
Ｏ
１．２
１．０孔ｓ妊
霞０．６蓉０．４
Ｏ．２
Ｏ一低氧气体
生堡鲑擅盘圭！Ｑ塑堡！旦筮！！鲞箜！朗鱼也』Ｑ！型：△！脞！！Ｑ鲤：！！！：≥！，丛！：！
●ＣｏＣＩ
２
ｌ：低氧单独作用与联合０．８ｐ，ｍｏＬ／ＬＺｎＰＰＩＸ作用的
比较；２：低氧单独作用与联合２．０ｐ。ｍｏｌ／ＬＺｎＰＰＩＸ
作用的比较；３：低氧单独作用与联合６．０ｐ。ｍｏｌ／Ｌ
ＺｎＰＰＩＸ作用的比较；６ａ：抑制低氧气体刺激条件下
ＨＯ－ｌ蛋白表达后ＨｅｐＧ２细胞的存活率；６ｂ：抑制
ＣｏＣｌ２刺激条件下ＨＯ－ｌ蛋白表达后ＨｅｐＧ２细胞的
存活率
图６抑制低氧条件下ＨＯ－ｌ蛋白表达对ＨｅｐＧ２细
胞存活率的影响
讨论
众所周知，一些肿瘤对化疗和（或）放射治疗耐受，易发生转移，预后差，这与肿瘤对应激环境的适应密切相关。肿瘤细胞快速、大量增殖，以及抗肿瘤治疗，使肿瘤处于一种低氧状态。在本研究中，我们采用低氧气体以及模拟造成低氧状态的ＣｏＣＩ：刺激ＨｅｐＧ２细胞，证实了在低氧条件下ＨｅｐＧ２细胞中ＨＯ一１ｍＲＮＡ和蛋白的表达显著升高。
ＨＯ－１不仅可以保护有害刺激条件下的正常细胞，而且还可以保护肿瘤细胞。近年来的研究发现，ＨＯ－ｌ在很多实体肿瘤中表达上调，这有利于促进肿瘤转移和增殖。但是在对乳腺癌的研究中，王波等＂’发现，ＨＯ－ｌ表达上调会抑制乳腺癌细胞生长。由此可见，ＨＯ一１对肿瘤细胞的保护作用存在细胞类型特异性。ＨＯ－１与实体肿瘤的关系还有待进一步研究。
我们应用不同浓度的ＨＯ—ｌ抑制剂ＺｎＰＰＩＸ来抑制ＨＯ一１的表达及其活性，结果显示，抑制低氧应
激条件下细胞中高表达的ＨＯ一１后，ＨｅｐＧ２细胞的存活率明显降低，而且呈ＺｎＰＰＩＸ浓度依赖性。这说明过表达的ＨＯ一１可以保护ＨｅｐＧ２细胞，减少低氧应激对细胞的损伤。
细胞对低氧的反应主要依赖ＨＩＦ．１。ＨＩＦ．１ｅｔ是主要的氧调节亚基，低氧主要通过调节ＨＩＦ．１仅蛋白的表达水平从而影响ＨＩＦ一１的转录调节作用。越来越多的研究把ＨＩＦ－１Ｏｔ列入肿瘤耐受及抗肿瘤治疗的重点…０Ｊ。
我们的研究结果显示，在低氧应激条件下，ＨＩＦ—ｌｏｔｍＲＮＡ的表达水平无明显变化，但是ＨＩＦ－１０ｔ蛋白表达显著升高。由此可见，低氧并没有在转录水平上诱导ＨＩＦ一１ａ升高，而Ｈ１Ｆ一１０ｔ蛋白的升高可能是由于其降解减少造成的。本研究中，我们还应用ＹＣ－１抑制ＨＩＦ?１０ｔ蛋白表达后，检测ＨＯ．１蛋白的表达，结果显示，在低氧条件下ＨＩＦ—ｌａ蛋白被抑制后，ＨＯ一１蛋白表达也显著下降。这说明低氧诱导ＨＯ－ｌ是依赖或者说至少部分依赖ＨＩＦ一１占蛋白。另外，我们采用ＺｎＰＰＩＸ抑制低氧条件下ＨＯ一１过表达后，ＨＩＦ－１０ｔ蛋白的表达并没有明显改变。这说明ＨＩＦ—ｌ仅可以调节低氧条件下ＨＯ．１蛋白的表达，而在低氧条件下ＨＯ?１的高表达并不影响ＨＩＦ－１０ｔ蛋白的表达。
有研究证实，在肝癌细胞中抑制细胞凋亡的基因明显上调，这使得肿瘤细胞生存时间延长，肿瘤细胞数目增多，使肿瘤细胞逃避凋亡，得以迅速增殖ｌｌ¨。本研究结果显示，抑制低氧诱导的ＨＯ一１过表达后，细胞存活率明显降低。而且，采用ＺｎＰＰＩＸ抑制低氧条件下ＨＯ一１高表达后，细胞中总ＳＯＤ活性明显降低。由此可见，在低氧应激条件下，ＨＯ．１对肿瘤细胞的保护作用可能源于ＳＯＤ。
本研究探索了ＨＯ一１在低氧应激条件下对肝癌细胞的保护作用，但由于ＨＯ—ｌ在各种肿瘤中的作用不完全一致，因此，我们还应对不同实体肿瘤中ＨＯ．１的变化对于肿瘤的影响进行深入研究。如果能够成功地将ＨＯ－１作为抗肿瘤治疗的一个靶点，。锵为临床抗肿瘤治疗提供新的思路。．
参考文献
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ｒｅｄｕｃｅｄ
ｎｅｃｒｏｓｉｓｉｎｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ’ｌｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｍｇｐｕｌｍｏｎａｒｙ
空垡艘擅苤圭！Ｑ盟生！旦筮！！鲞筮！翅￡塾垫！Ｑ些生：叁！＆堕！Ｑ塑：∑垫：！！：堕！：！
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（收稿日期：２００８?１２－２９）
本刊２００９年部分医学词汇使用缩略语的有关规定
为节约版面，本刊自２００９年第７期起对一些ｌ临床医师
较熟且常用的医学词汇作如下规定。以下词汇在正文中（摘
要除外）首次出现时给出中文全称和英文缩略语即可，不再
要求给出英文全称，再次出现时可直接用缩略语。
世界卫生组织（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ＷＨＯ）
国际抗癌联盟（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅＵｎｉｏｎＡｇａｉｎｓｔＣａｎｃｅｒ，
ｗｃｃ）
５－氟尿嘧啶（５－ｆｌｕｏｍｕｒａｅｉｌ，５一ｒｕ）
３－磷酸甘油醛脱氢酶（幽硼讪蛐３－ｐｌｌ嗍）Ｉｌａｌｅｄｅｈｙ?
ｄｌ＿ｏＩ驴ｌ删豫，ＧＡＰＤＨ）
干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＩＦＮ）
白细胞介素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ）
肿瘤坏死因子（ｔｕｎｌｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）
人乳头状瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）
转化生长因子８（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１３，ＴＧＦ?ｐ）
血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，
ＶＥＧＦ）
表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）
ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）
小干扰ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｉｍｅｆｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）
互补ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ，ｅＤＮＡ）
聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）
逆转录聚合酶链反应（ｒｅｖｅｌ＇￥ｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ?ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）
酶联免疫吸附试验（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ，
ＥＬＩＳＡ）．读者?作者?编者．
四甲基偶氮唑蓝［３一（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２，５一
ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２Ｈ—ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＭＴｒ）］
二氨基联苯胺（ｄｉａｍｉｏｎｂｅｎｚｉｄｅｎｅ，ＤＡＢ）
乙二胺四乙酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）
牛血清白蛋白（ｂｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＢＳＡ）
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｅｓｉｓ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）１－氨基丁酸（ｇａｍｍａ－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ，ＧＡＢＡ）
磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）
环磷酸腺苷（ｃｙｃｌｉｃａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｃＡＭＰ）
总生存期（ｏｖｅｒａｌｌｓｕｒｖｉｖａｌ，ＯＳ）
无病生存期（ｄｉｓｅａｓｅ—ｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌ，ＤＦＳ）
树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ，ＤＣ）
计算机体层成像（ｃｏｍｐｕｔｅｄｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，ＣＴ）
心电图（ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ，ＥＣＧ）
磁共振血管成像（ｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅａｎｇｉｏｐｒａｐｈｙ，ＭＲＡ）磁共振成像（ｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ，ＭＲＩ）
多层螺旋ｃＴ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ－ｓｌｉｃｅ８ｐｉ瑚ＣＴ，ＭＳＣＴ）
灌注加权成像（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎｗｅｉｇｈｔｅｄｉｍａｇｉｎｇ，ＰＷＩ）
感兴趣区（ｒｅｇｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＲＯｔ）
Ｔｌ加权像（Ｔ１ｗｅｉｇｈｔｅｄｉｍａｇｅ，Ｔ１ＷＩ）
ｆ１２加权像（ａ－２ｗｅｉｇｈｔｅｄｉｍａｇｅ，Ｔ２ＷＤ
本刊编辑部
低氧条件下血红素加氧酶1过表达对人肝癌细胞的保护作用
作者：梁飞， 朱晓洁， 王秀宏， LIANG Fei， ZHU Xiao-jie， WANG Xiu-hong
作者单位：哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室,150086
刊名：
中华肿瘤杂志
英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ONCOLOGY
年，卷(期)：2009，31(8)
被引用次数：0次
参考文献(11条)
1.Min KJ.Yang MS.Kim SU Astrocytes induce heine oxygenase 1 expression in microglia:a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation 2006
2.Chen-Roefling J.Regan RF Effect of heine oxygenase-1 on the vulnerability of astrocytes and neurons to hemoglobin 2006
3.Reiter TA.Pang B.Dedon P Resistance to nitric oxideinduced necrosis in heine oxygenase-1 overexpressing pulmonary epithelial cells associated with decreased lipid peroxidation 2006
4.Kweon MH.Adhami VM.Lee JS Constitutive overexpression of Nrf2-dependent heine oxygenase-1 in A549 cells contributes to resistance to apoptosis induced by epigallatechin 3-gallate 2006
5.Anelli V.Ganlt CR.Cheng AB Sphingusine kinase 1 is up-regulated during hypoxia in U87MG glioma cells:role of hypoxia-inducible factors 1 and 2 2007
6.高勇.王杰军.王革芳缺氧对肿瘤细胞产生和分泌基质金属蛋白酶的影响[期刊论文]-癌症 2005
7.王波.于景翠.周虹血红素加氧酶-Ⅰ与实体肿瘤[期刊论文]-医学分子生物学杂志 2008
8.Fujita M.Yasuda M.Kitatani K An up-to-date anti-cancer treatment strategy focusing on HIF-1αsuppression:its application for refractory ovarian cancer 2007
9.Yeo Ej.Chun YS.Cho YS YC-1:a potential anticancer drug targeting hypoxia-inducible factor 1 2003
10.Maher JC.Wangpaichitr M.Savaraj N Hypoxia-inducible factor-1 confers resistance to the glycolytic inhibitor 2-deoxy-D-glucose 2007
11.刘连新.周津.王秀琴凋亡相关基因在肝癌及正常肝组织表达概况[期刊论文]-中华肿瘤杂志 2001
相似文献(9条)
1.期刊论文马利.杨艳.姚尚龙.MA Li.YANG Yan.YAO Shang-long乙酰半胱氨酸对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后
低氧诱导因子-1α和血红素加氧酶-1基因表达的影响-实用医学杂志2009,25(14)
目的:观察乙酰半胱氨酸(NAC)对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)后低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA表达变化的影响.方法:用链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病大鼠模型,动物分为正常假手术组(Cs组)、正常I/R组(CI/R组)、正常I/R+NAC组(CN组)、糖尿病假手术组(Ds组)、糖尿病I/R组(DI/R组)、糖尿病I/R+NAC组(DN组),每组12只,共72只.检测各组心肌梗死范围(IS/AAR)、HI-1α和HO-1 mRNA表达.结果:Cs组检测不到HIF-1α和HO-1 mRNA表达,Ds组检测到少量HIF-1α和HO-1 mRNA表达;DI/R组HIF-1α和HO-1 mRNA表达低于CI/R组(P＜0.05),IS/AAR大于CI/R组(P＜0.05);DN组HIF-1α和HO-1 mRNA表达高于DI/R组,但低于CN组(P＜0.05);IS/AAR小于DI/RR组,但大于CN组(P＜0.05).结论:NAC可部分恢复糖尿病大鼠心肌I/R后HIF-1α和HO-1 mRNA表达,减小心梗面积,有一定的治疗效果.
2.学位论文陈波低氧诱导因子1诱导血红素加氧酶1过表达在大鼠肾移植缺血再灌注损伤中的保护性作用研究
2005
随着更多特异性免疫抑制药物应用于临床，急性排斥反应发生率已经大大减低，但移植物长期存活状况并无明显改善。非免疫因素因而更加受到人们重视，而缺血再灌注损伤(IRI)无疑是其中极为重要的一环。本实验中我们设想通过预处理使HIF-1稳定表达并诱导内源性HO-1过表达，探讨它们在体内和体外试验中对缺血再灌注及缺氧再复氧损伤的保护作用及其机制。
第一部分
肾微血管内皮细胞的原代培养及低温缺氧再复氧损伤细胞模型的建立。目的：在体外原代培养肾微血管内皮细胞；建立肾微血管内皮细胞低温缺氧再复氧损伤模型，在体外试验中模拟临床肾移植过程中的缺血再灌注损伤。结论：应用这种方法体外成功培养出纯度较高的肾微血管内皮细胞，传代后内皮细胞性状稳定；建立了细胞低温缺氧再复氧损伤模型。
第二部分
目的：在肾微血管内皮细胞低温缺氧再复氧(HR)损伤模型中探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)稳定表达对血红素加氧酶-1(HO-1)表达的诱导作用。在此基础上进一步研究HIF-1和HO-1在肾微血管内皮细胞低温HR损伤中的抗凋亡和免疫调节作用并初步探讨其机制。结论：在肾微血管内皮细胞低温HR损伤
中干预HIF-1α稳定表达能显著上调内源性HO-1表达。HIF-1α稳定表达在肾微血管内皮细胞低温HR损伤中有显著的抗凋亡和免疫保护作用，其作用机制可能与其诱导HO-1过表达有关。
第三部分
目的：模拟临床缺血再灌注损伤病理变化；探讨3,4-DHB和NS-398在体内是否同样能够稳定和减低HIF-1α蛋白的表达，发挥对HO-1mRNA和蛋白表达的转录调节作用。进一步评价HIF-1α、HO-1的表达水平和大鼠肾移植IRI损伤程度间的关系，讨论两者的保护性作用及机制。结论：HIF-1稳定表达能在转录水平诱导HO-1内源性过表达；两者对同基因大鼠肾移植缺血再灌注损伤有显著的保护作用。
3.期刊论文马利.杨艳.姚尚龙.李克忠糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后低氧诱导因子-1α和血红素加氧酶-1基因表
达的变化-中国急救医学2007,27(1)
目的 观察糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血红素氧合酶-1(HO-1)mRAN表达的变化.方法 以链脲佐菌素复制糖尿病模型.48只大鼠随机分成非糖尿病假手术(CS)组、非糖尿病缺血/再灌注(CI/R)组、糖尿病假手术(DS)组和糖尿病缺血/再灌注(DI/R)组.检测各组心肌梗死范围、HIF-1α和HO-1 mRAN表达变化.结果 Cs组检测不到HIF-1α和HO-1 mRAN表达,Ds组检测到少量HIF-1α和HO-1 mRAN表达;但是糖尿病组心肌缺血/再灌注后HIF-1α和HO-1 mRAN表达低于非糖尿病组(P＜0.01),心肌梗死范围大于非糖尿病组(P＜0.01).结论 糖尿病加重心肌缺血/再灌注损伤,其机制可能与糖尿病心肌缺血/再灌注后HIF-1α和HO-1 mRAN表达相对降低有关.
4.学位论文裴静娴重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α对人微血管内皮细胞增殖及VEGF表达的影响2009
目前冠心病的发病率逐年增加，已成为严重威胁人类健康的主要疾病之一。尽管冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass
grafting，CABG）和冠脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）治疗进展迅速，但仍有一部分患者由于弥漫性或完全性血管闭塞不适于常规血管成形术，或因为术后出现再狭窄、微小血管功能障碍等问题必须再寻求其他新的治疗途径。近年来研究发现，血管生长因子经安全有效的载体导入或直接注入缺血心肌，可以促进血管新生，为缺血性心脏病的治疗提供了新的策略。目前已知可能参与血管生成过程的调节因子包括：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血管生成素
（angiopoietin，Ang）、血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth
factor，IGF）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等。大量动物实验和临床研究显示VEGF、FGF蛋白和基因可增加缺血心肌灌注、减小梗死面积、改善心功能，具备安全性、可行性。然而两者的Ⅱ期临床试验并没有取得预期的效果。血管新生是一个复杂的过程，需要多种生长因子和调节蛋白的参与，而且在血管新生的不同阶段，各种生长因子发挥的作用也有所不同。单个生长因子治疗不足以诱导成熟的血管新生。低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作为细胞对缺氧适应性反应的上游关键性转录因子，通过对VEGF、PDGF、Ang、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）等多种靶基因的转录调控参与了血管新生、红细胞生成等病理生理过程。临床前期研究表明，应用具有组成型表达活性的HIF-1α基因治疗可诱导生理功能完整的血管新生。HIF-1α诱导的新生血管具有无明显炎症反应、不渗漏、不引起组织水肿的特点。因此HIF-1α被认为是最具有前景的促血管新生治疗的基因之一。缺血性心脏病HIF-1α基因治疗的优势在于：HIF-1α可以促进VEGF、Ang-1、Ang-2、Ang-4、PDGF、胎盘生长因子（placenta growth factor，PIGF）等多种基因转录促进血管新生，这些因子相互协调、相互拮抗，促进生理功能完整的血管新生，避免血管的过度增殖。其中VEGF是明确的受HIF-1直接调控的下游靶基因，可促进内皮细胞生长、增殖，增加血管通透性，使内皮细胞接受刺激因子的作用增加，血浆蛋白外渗，提供血管生成的最初环境并形成原始血管，对维持新生血管的存活具有重要作用；而Ang-1、PDGF能够招募血管周细胞、促进新生血管的成熟和稳定；Ang-4在血管成熟期对维持血管完整性、稳定性方面也可能起重要作用；Ang-2通过拮抗Ang-1而防止血管过度增殖。PIGF与VEGF具有协同效应，可减少新生血管的渗透。
目的:
为了深入研究HIF-1α基因在血管新生中的作用及Ad-HIF-1α564/402/803的生物学效应，本课题观察Ad-HIF-1α564/402/803是否能在体外培养的hMVECs稳定高效表达，内皮细胞增殖是血管新生的必要条件，通过研究Ad-HIF-1α564/402/803对hMVECs增殖及VEGF蛋白表达的影响，进一步了解HIF-
1α对血管新生的影响。
方法:
1、将本课题组构建的重组腺病毒载体Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1α nature、Ad-LacZ及空载腺病毒载体Ad-Null，在HEK293A细胞内大量扩增，经氯化铯梯度离心法纯化，用终点稀释法测定病毒滴度；提取纯化后病毒DNA，采用PCR法对三突变型HIF-1α基因进行鉴定。
2、对hMVECsⅧ因子及CD31相关抗原进行免疫荧光检测；Ad-LacZ以不同转染复数（multiplicity of infection，MOI）转染hMVECs，X-gal染色测定转染效率；96孔板培养hMVECs，Ad-HIF-1α564/402/80
3、Ad-HIF-1α nature、Ad-Null以最佳MOI转染细胞，分别在转染后第1，2，3，4，5天用MTS方法检测不同病毒载体对细胞增殖的影响。
3、Ad-HIF-1α564/402/803、Ad-HIF-1α nature、Ad-Null以最佳MOI转染hMVECs，分别在48h、72h、96h提取细胞总蛋白，Western blot方法测定不同时间HIF-1α蛋白及72h各组VEGF蛋白表达量。
4、按MOI为2
5、75、100、150、300 pfu/cell，Ad-HIF-1α564/402/803转染hMVECs，72h后提取细胞总蛋白，Western blot方法测定HIF-1α及VEGF蛋白表达量。
结果:
第一部分：在HEK293A细胞内扩增后获得重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-Null、Ad-HIF-1α nature、Ad-HIF-1α564/402/803，纯化后终点稀释法测得的滴度分别为2．0×1013，2．5×1014，1．6×1012，2．0×1021pfu/ml。重组腺病毒载体转染HEK293A细胞后24h即出现病变效应（cytopathic
effect，CPE）。提取Ad-HIF-1α564/402/803 DNA，PCR检测HIF-1α基因得到预期的380bp、460bp、214bp的目的片段，且DNA测序结果符合预期。
第二部分：hMVECsⅧ因子及CD31相关抗原免疫荧光染色均为阳性；Ad-LacZ以不同MOI转染hMVECs，X-gal染色显示MOI为75 pfu/cell时，转染效率趋于稳定。Ad-Null、Ad．HIF-1α nature、Ad-HIF-1α564/402/803转染hMVECs MTS检测不同病毒载体及时间均有显著性差异（P值分别为0．000），且病毒载体与时间之间存在交互效应（F=13．956，P=0．000），各组在第1天吸光度无显著性差异（F=2．151，P=0．134）；第2、3、4、5天各组均有显著性差异（P值均为0．000）；在3、4、5天，Ad-Null组吸光度与control组比较无显著性差异（P值分别为0．610，0．175，0．514）：Ad-HIF-1αnature组吸光度均显著高于control组（P值分别为0．001，0．000，0．001，0．000）：Ad-HIF-1α564/402/803组在不同时间点吸光度均显著高于Ad-HIF-1α nature组（P值分别为0．000，0．000，0．001，0．000）。
各组在不同时间点HIF-1α蛋白表达不同病毒载体与转染时间均有显著性差异（P值均为0．000），且两者存在交互效应（F=3．990，P=0．012）。不同组在同一时间点均存在显著性差异（P值分别为0．003，0．000，0．001）；在不同时间点Ad-HIF-1α564/402/803组HIF-1α蛋白表达水平均显著高于空白组及Ad-Null组（P均<0．05），Ad-HIF-1α564/402/803组与Ad-HIF-1α nature组在48h、96h蛋白表达无显著性差异（P=0．092，0．197），Ad-HIF-1α564/402/803组在72h HIF-1α蛋白表达显著高于Ad-HIF-1α nature组（P=0．017），且VEGF蛋白表达量高于其他组。随着MOI值的升高，HIF-
1α和VEGF蛋白的表达水平呈逐渐增加的趋势，当MOI为300 pfu/cell时，蛋白表达水平较前下降。
结论:
第一部分：本课题组构建的重组腺病毒载体Ad-LacZ、Ad-Null、Ad-HIF-1α nature、Ad-HIF-1α564/402/803扩增后能获得较高的滴度，且转染效率高，为下一步实验提供了保证。
第二部分：Ad-HIF-1α564/402/803对hMVECs增殖效应较Ad-HIF-1α nature强，且HIF-1α蛋白表达水平高，可上调VEGF蛋白表达。
5.期刊论文何祥虎.王焱林.王成天.张宗泽.饶艳.颜学滔.李卉缺血预处理对大鼠缺血再灌注心肌HIF-1α和HO-
1的影响-中华麻醉学杂志2010,30(2)
目的 探讨缺血预处理对大鼠缺血再灌注心肌低氧诱导因子1α(HIF-1α)和血红素加氧酶1(HO-1)的影响.方法 健康雄性SD大鼠48只,体重220～280 g,随机分为4组(n=12):假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血预处理+缺血再灌注组(IP组)和缺血预处理+缺血再灌注+HO-1抑制剂组(HI组).采用结扎左冠状动脉前降支30 min再灌注120 min的方法建立心肌缺血再灌注模型.S组仅在冠状动脉下穿线;IP组于缺血前采用结扎/放松左冠状动脉前降支各5 min,重复3次的方法行缺血预处理;HI组于缺血预处理前1 d腹腔注射锌原卟啉Ⅸ 10 ms/ks,其余同IP组.于再灌注结束时测定心肌HIF-1α、HO-1的mRNA和蛋白表达、HO-1活性、SOD活性及MDA含量,计算心肌梗死面积,取动脉血样测定血清TNF-α和IL-6的浓度.结果 与S组比较,IR组、IP组和HI组心肌SOD活性
1α和HO-1的mRNA和蛋白表达上调,HO-1活性升高,心肌梗死面积减小(P＜0.01);与IP组比较,HI组心肌SOD活性降低,MDA含量升高,血清TNF-α和IL6浓度升高,心肌HO-1的mRNA和蛋白表达下调,HO-1活性降低,心肌梗死面积增加(P＜0.05或0.01),心肌HIF-1α的mBNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 缺血预处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制与HIF-1α诱导HO-1活性增强有关.
6.期刊论文刘婷.武明虎.方敬爱.刘文媛.韩秀芳去铁胺对缺血性急性肾衰竭大鼠的保护作用-中国中西医结合肾
病杂志2008,9(4)
目的:探讨去铁胺(DFO)对缺血性急性肾衰竭(iARF)大鼠的保护作用及其作用机制.方法:雄性Wistar大鼠.随机分成3组:假手术组、手术组、DFO+手术组,每组各12只.用钳夹大鼠双侧肾蒂45 min制成iARF动物模型,DFO+手术组:缺血前24 h给予DFO(200mg/kg)腹腔注射,其余处理同手术组.于缺血再灌注24 h后检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量以及进行肾组织光镜形态学观察和采用免疫组织化学法测定低氧诱导因子-1α(HI-1α)及血红素加氧酶(HO-1)蛋白的表达水平.结果:手术组BUN、Scr升高,SOD下降,MDA升高,HIF-1α、HO-1中度提高,肾组织结构紊乱.DFO+手术组除HIF-1α、HO-1含量大幅提高外,尚能显著逆转上述改变,两组间比较具有统计学意义(P＜0.01).结论:DFO预处理可通过自由基清除和诱导HIF-l及下游基因HO-l过表达从而对iARF大鼠发挥保护作用.
7.学位论文梁飞依赖HIF-1α的HO-1过表达对肝癌细胞系抵抗低氧应激的保护作用2009
目的：探讨低氧条件下人类肝癌细胞(human hepatoma，HepG2)中血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)过表达对细胞的保护作用及其与低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的相关性。
方法：利用低氧气体(0.5%02，94.5%N2，5%CO2)和化学模拟低氧(250μmol/L COCl2)两种方法刺激HepG2细胞，用RT-PCR方法从mRNA水平上检测低氧条件下HO-1和HIF-1α基因表达，用Western Bolt方法从蛋白水平上检测低氧条件下HO-1和HIF-1α基因表达，从而探讨二者之间的相关性。用MTT方法分析低氧刺激后细胞的存活率以及低氧刺激的同时抑制HO-1蛋白表达后细胞的存活率。用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒检测低氧刺激细胞后总SOD的活性以及抑制HO-1蛋白表达后细胞中总SOD的活性。
结果：低氧诱导HepG2细胞中HO-1基因在转录和翻译水平上过表达。利用锌原卟啉IX(ZnPPIX)可抑制低氧条件下HO-1蛋白过表达，并导致细胞在低氧应激条件下存活率明显降低(P<0.01)。在低氧条件下，细胞中总SOD的活性显著升高(P<0.05)；而在低氧条件下抑制HO-1蛋白过表达后，细胞中总SOD活性明显降低(P<0.01)。低氧条件下HIF-1α蛋白表达显著升高，抑制HIF-1α蛋白表达后HO-1蛋白表达明显降低。
结论：低氧刺激可诱导HepG2细胞中HO-1蛋白的过表达；抑制HO-1蛋白过表达后，细胞在低氧条件下的存活率明显降低，说明过表达的HO-1蛋白与HepG2细胞对低氧耐受有关；低氧条件下HO-1蛋白的过表达是依赖或者说是部分依赖HIF-1α的，这将为今后肝癌的治疗提供新的思路和药物靶点。
8.期刊论文陈波.赵鸿.郑景存.王翔.瞿连喜.丁强.张元芳缺氧诱导因子-1对肾微血管内皮细胞缺氧再复氧损伤免
疫调节作用-中华实验外科杂志2005,22(9)
目的探讨低氧诱导因子-1(HIF-1)在肾微血管内皮细胞(HGMECs)缺氧再复氧损伤中的免疫调节作用.方法建立HGMECs缺氧再复氧模型,应用特异性脯氨酰羟化酶抑制剂3,4-DHB和环氧酶-2阻断药物NS-398预处理HGMECs,设对照、缺氧复氧、3,4-DHB和NS-398四组.采用逆转录-聚合酶链反应、免疫印记和酶联免疫吸附试验等方法检测各组细胞HIF-1α、血红素氧合酶-1(HO-1)的mRNA和蛋白的表达及上清中可溶性细胞间黏附因子-1(sICAM-1)的水平;将各组HGMECs与异体淋巴细胞混合培养(MELR),检测淋巴细胞增殖程度和MELR上清中白细胞介素-2(IL-2)的表达水平.结果与对照组相比,HGMECs经缺氧复氧损伤后HIF-1α蛋白和HO-1 mRNA表达水平显著增高(P<0.01),上清中sICAM-1(14.55±1.13 vs 7.90±1.61) ng、异体淋巴细胞增殖率(0.191±0.053 vs
0.069±0.032)和MELR上清中IL-2(40.0±5.0 vs 18.0±3.0) pg水平均有显著增高(P<0.01).与缺氧复氧组比较,3,4-DHB干预组HIF-1α蛋白和HO-1 mRNA表达水平显著增高(P<0.05),而淋巴细胞增殖率(0.079±0.038,P<0.01)及IL-2(25.7±6.1 pg,P<0.01)和sICAM-1(8.71±1.32 ng,P<0.01)水平则显著下调.与缺氧复氧组比较,NS-398干预组HIF-1α蛋白和HO-1 mRNA表达水平显著减低(P<0.01),而淋巴细胞增殖率(0.268±0.079)及IL-2(51.0±11.0)
pg和sICAM-1(20.33±3.05) ng表达水平则显著增高(P<0.05).结论缺氧复氧会对HGMECs造成免疫学损伤,HIF-1α稳定表达可起到保护性作用.
9.学位论文刘婷去铁胺对缺血性急性肾衰竭大鼠的保护作用2008
目的：探讨去铁胺(DFO)对缺血性急性肾衰竭(iARF)大鼠的保护作用及其作用机制，为DFO更好地应用于临床认证提供实验性理论依据。
方法：
1、iARF大鼠模型的制备用钳夹大鼠双侧肾蒂45min的方法制成iARF动物模型。
2、雄性Wistar大鼠，随机分成3组：假手术组、手术组、DFO+手术组，每组各12只。手术组：用无损伤动脉夹钳夹大鼠双侧肾蒂45min，然后松开动脉夹，实行再灌注。肉眼见肾脏由暗红变为鲜红，表明再灌注成功(实验过程中动物体温维持在37℃左右)，关闭腹腔后继续饲养，缺血前24小时给予等体积生理盐水腹腔注射。假手术组同法打开腹腔并找到肾蒂，但不夹闭肾蒂，后关闭腹腔，打开腹腔前24h给予等体积生理盐水腹腔注射。DFO+手术组
：缺血前24小时给予DFO(200mg/kg)腹腔注射，其余处理同手术组。于缺血再灌注24h后检测血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr、超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量以及进行肾组织光镜形态学观察和采用免疫组织化学法测定低氧诱导因子-1α(HIF-1 α)及血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白的表达水平。
结果：
1、肾组织形态学改变大体：假手术组为正常肾组织；手术组肾脏外形肿大，剖面见皮质肿胀，色苍白，髓质呈暗红色；DFO干预组肾脏外观与正常接近。HE染色：假手术组肾小球、肾小管结构大致正常；手术组肾小管上皮细胞均有不同程度的坏死，间质水肿，大量炎细胞浸润，血管渗透性增加
，红细胞溢出；DFO干预组病理改变明显减轻，仅肾小管上皮轻度肿胀.
2、手术组大鼠于缺血再灌注后24h的BUN、SeT值显著高于假手术组(P<0.01)，但DFO+手术组与手术组比，BUN、Scr值却明显降低(P<0.01)。
3、手术组大鼠肾组织MDA含量显著高于假手术组(P<0.01)，但DFO+手术组MDA含量与手术组比却明显降低(P<0.01)。手术组大鼠肾组织SOD活力显著低于假手术组(P<0.01)，但DFO+手术组SOD活力明显高于手术组(P<0.01)。
4、HIF-1α阳性表达为肾小管上皮细胞胞核及部分胞浆内出现棕黄色颗粒，HO-1阳性表达为细胞胞浆出现棕黄色颗粒。假手术组未见阳性细胞，手术组、DFO+手术组显示HIF-1 α、HO-1有不同程度的阳性表达，手术组大鼠肾小管上皮细胞HIF-1α、HO-1的阳性表达呈弱阳性，但DFO+手术组HIF-1α、HO-1的表达呈强阳性，各组均未发现肾小球及间质细胞染色阳性。图像分析表明：手术组、DFO+手术组大鼠肾小管上皮细胞HIF-1α、HO-1灰度值水平明显低于假手术组(P<0.01)，DFO+手术组与手术组比灰度值明显降低(P均<0.01)。
结论：
1、DFO预处理能显著减轻iARF大鼠肾功能损害程度，在病理上明显减轻肾小管损伤程度。
2、DFO预处理可通过自由基清除和诱导HIF-1α及下游基因HO-1过表达从而对iARF大鼠发挥保护作用。
本文链接：https://www.doczj.com/doc/638008068.html,/Periodical_zhzl200908006.aspx
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下载时间：2010年8月29日