细胞毒性
细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法：MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等细胞增殖能力分析试剂盒原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态荧光素发光法细胞生存能力检测原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。LDH法细胞毒性检测原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外；LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度。
抗肿瘤药物的用药顺序及溶媒选择 原则 （1）药物相互作用原则 有的化疗药物之间会发生相互作用，从而改变药物的体内过程，可能影响疗效或毒性。 如顺铂影响紫杉醇的清除率，先用紫杉醇再用顺铂。 （2）刺激性原则 使用非顺序依赖性化疗药物时，应先用对组织刺激性较强的药物，后用刺激性小的药物。由于治疗开始时静脉尚未损伤，结构稳定性好，药业渗出机会少，药物对静脉引起的不良 反应较小如长春瑞滨和顺铂合用时，长春瑞滨刺激性强，宜先给药。 （3）细胞动力学原则 生长较慢的实体瘤处于增殖期的细胞较少，G0期细胞较多，先用周期非特异性药物杀 灭一部分肿瘤细胞，使肿瘤细胞进入增殖期再用周期特异性药物。顺铂和依托泊苷合用时，先用顺铂后用VP-16。 生长快的肿瘤先用周期特异性药物大量杀灭处于增殖周期的细胞，减少肿瘤负荷，随后用周期非特异性药物杀灭残存的肿瘤细胞。 用药顺序 1、联用顺铂化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 GP 吉西他滨先用GEM 顺铂会影响吉西他滨的体内过程，加重骨髓抑制。TP 紫杉醇先用PTX 顺铂对细胞色素P450酶有调节作用，可使PTX清除 率大约降低33%,产生更为严重的骨髓抑制 FP 5-FU 先用DDP 小剂量DDP能够增加细胞内蛋氨酸, 使细胞内活性叶酸生成增加, 从而增加5-FU的抗肿瘤作用。 PP 培美曲塞先用Alimta，30min后用顺铂说明书 2、联合长春新碱化疗 化疗方案联用药物用药顺序原因 CHOP 环磷酰胺先用VCR，6-8小时后在给CTX VCR具有同步化作用，使细胞停滞在M期，约6~8h后细胞同步进入G1期，再用CTX可增效 VCM 甲氨蝶呤先用VCR VCR阻止甲氨蝶呤从细 胞内渗出而提高细胞内浓度 VDLP 门冬酰胺酶先用VCR 合用加重神经系统血液系统毒性，先于门冬12~24小时给药 3、甲氨蝶呤 化疗方案联用药物用药顺序原因 CMF 5-FU 用MTX4～6h后用5-FU 序贯抑制 MTX----二氢叶酸还原酶抑制 剂 5-FU-----胸腺嘧啶合成酶抑制剂
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
细胞毒性检测方法总结！ 细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。 细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法： MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测 一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等 细胞增殖能力分析试剂 原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态 优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。 二.荧光素发光法细胞生存能力检测 原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。 特点： 1）简单、快速。2）板式检测，可进行高通量 。 三.LDH法细胞毒性检测 原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度 特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测
浅谈医护人员对细胞毒性药物的防护“征文” 马晓艳（宁夏医科大学总院心脑血管病医院药剂科，宁夏750001） ［摘要］：随着肿瘤疾病的发展，越来越多的细胞毒性药物被用于临床治疗，由于缺乏规范的管理，配置药物的设备不齐全，操作人员缺乏必要的防护措施，对发药的药师、执行治疗的护士、负责清洁的卫生人员和周边环境造成了潜在的危险。所以，必须预防细胞毒性药物的危害，提高操作技术和防护意识，做好职业防护。 ［关键词］：细胞毒性药物；危害；防护措施 ［中图分类号］R979.1 ［文献标志码］B ［文章标号］ ［Abstract］:With the development of neoplastic disease s,more and more cytotoxic medicines are used to clinic tre atment.The reasons why there are so many potential risks f or the pharmacist who takes charge of sending medicines a re the lack of normative management,defective equipment f or medicine disposition and operating staff are short of nec essary safeguard measures,so do the nurse who performs tr eatment and the health personnel.Therefore,we must prevent the risks of cytotoxic medicines,improve operating techniq
第四章 细胞毒性T 细胞作用的分子机制 免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病原体的体液免疫反应和以细胞毒性T 细胞（CTL ）为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的细胞免疫反应。其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自身细胞显得尤为重要。细胞免疫反应包括NK 细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和CTL 为主、Th 细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。CTL 对于被感染细胞的MHC I 类分子限制特异性的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型疫苗的分子设计都有重要意义。 第一节 CTL 作用概述 CTL 即杀伤性T 细胞，是一类具有CD8+表面标志、受MHC I 类分子限制性杀伤功能的T 细胞。CTL 的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。CTL 介导的靶细胞杀伤的特点是：杀伤受TCR 以及MHC I 类分子的严格限制。CTL 对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性和快速性的特点。另外，IL-2和其它一些细胞因子在CTL 前体的体外培养和效应CTL 的分化诱导中也起着重要作用。 一、CTL 的主要生物学功能 CTL 对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。CTL 在识别“改变”了的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作用。由于人体所有的有核细胞都表达I 类MHC 分子，因此，CTL 原则上可以识别和清除几乎所有改变了的自身细胞。 二、CTL 作用的MHC 限制性 CTL 的杀伤作用受MHC 严格限制。CTL 在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可溶性抗原或者与非自身MHC I 类分子结合的抗原，而只能识别与自身MHC I 类分子相联系的特异性抗原多肽。 三、CTL 的组成 CTL 的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这一功能来确定的。因此，CTL 不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的T 细胞群体。在组成上，它包括CD8+T 细胞和CD4+T 细胞。 1、CD8+ T 细胞 主要有αβTCR 型CD8+T 细胞和γδTCR 型CD8+T 细胞。前者以αβTCR 识别靶细胞表面上的MHC I 类分子-肽复合物（图4- ）；后者则以γδTCR 识别靶细胞表面的 HLA-I HLA-II 图4-1 TCR-抗原肽-HLA 三分子复合物 αβ TCR αβ TCR
第26卷 第3期2014年3月V ol. 26, No. 3Mar., 2014 生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 文章编号：1004-0374(2014)03-0319-06 DOI: 10.13376/j.cbls/2014047 收稿日期：2013-07-11；修回日期：2013-08-11 基金项目：北京市教委科技发展计划重点项目(KZ2012-11417041) *通信作者：E-mail: xiaohong@https://www.doczj.com/doc/666297982.html, 毒理学研究中的体外细胞毒性评价 刘 涛1，郭 辰2，赵晓红2* (1 首都师范大学生命科学学院，北京 100048；2 北京联合大学功能食品研究院，北京 100191) 摘 要： 体外细胞毒性评价作为传统动物模型毒性评价的替代方法正在得到越来越多的研究和应用，而其向高通量阶段的迈进则为新毒物和新药物的检测与目的物的筛选提供了更加快捷、高效的手段。将对体外细胞毒性评价常用细胞类型、体外细胞毒性评价的指标，及其检测技术方法的研究现状、进展和存在问题进行阐述，希望能为相关的研究提供一定的参考。关键词：毒理学；体外试验；细胞毒性评价；高通量筛选 中图分类号：Q256；R99 文献标志码：A In vitro cytotoxicity evaluation in toxicology LIU Tao 1, GUO Chen 2, ZHAO Xiao-Hong 2* (1 School of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China; 2 Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China) Abstract: In vitro cytotoxicity evaluation, as an alternative of traditional toxicity evaluation using animal models, has been widely studied and applied. The development of cell-based high-throughput detecting and screening assays will provide fast and efficient means for detecting new toxic substances and drugs and screening target ingredients. The current research status, scientific progress, and existing problems of commonly used cell types, different test indexes and methods for in vitro cytotoxicity assessments are reviewed, which will provide some reference for related research. Key words: toxicology; in vitro assay; cytotoxicity evaluation; high-throughput screening 毒性评价的传统方法主要是动物体内实验，通过解剖检查、称量重量、计算脏器指数、血液生化学检查及病理形态学检查等来发现受试物的器官毒性，即利用啮齿类动物和非啮齿类动物进行不同时间段的生物测定。虽然这种方法在评估化学物对人类潜在危害的实际应用中发挥了重要的作用，但随着科学技术的发展，其局限性也逐渐显露出来。细胞试验正是在这一基础上发展起来的。近年来，体外细胞毒性评价由于其周期短、成本低和作用机制易于探明等优势得到快速的发展。目前在体外试验很难监控全身生理效应的前提下，大多数试验都是测定细胞水平的效应，即体外细胞毒性。在限定条件下，可根据药物代谢动力学模型将体外细胞毒性 检测的结果外推并应用到体内研究中[1] 。相对于复 杂的体内反应，所有体外细胞毒性试验都是简化了 的监测事件，但由于其经济、快速、易于量化和可重复性好，且符合替代(replacement )、减少(reduction )和优化(refinement )，即3R 的原则[2]，它不仅提高了毒理学检测的效率，减少了动物的使用，而且将会使基于人类细胞或细胞系的体外毒理学检测途径的定量自动化高通量检测与筛选得到更广泛 的应用[1]。 随着社会科学技术的发展和人类需求的不断扩大，新的药品、化学佐剂、食品添加剂、化工原料以及环境污染物等化学物不断地被发现和制造出来，并且要求快速得到实际的检测和应用，以满足 ? 技术与应用 ?
87 BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VITRO The following tests are designed to determine the biological reactivity of mammalia n cell cultures followi ng con tact with the elastomeric plastics and other polymeric materials with direct or in direct patie nt con tact or of specific extracts prepared from the materials under test. It is essential that the tests be performed on the specified surface area. When the surface area of the specime n cannot be determ in ed, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Exercise care in the preparation of the materials to preve nt con tam in ati on with microorga nisms and other foreign matter. Three tests are described (i.e., the Agar Diffusi on Test , the Direct Con tact Test and the Elution Test ).1 The decision as to which type of test or the number of tests to be performed to assess the potential biological response of a specific sample or extract depends upon the material, the final product, and its inten ded use. Other factors that may also affect the suitability of sample for a specific use are the polymeric composition; processing and cleaning procedures; con tact ing media; in ks; adhesives; absorptio n, adsorptio n, and permeability of preservatives; and con diti ons of storage. Evaluatio n of such factors should be made by appropriate additi onal specific tests before determining that a product made from a specific material is suitable for its in ten ded use. Materials that fail the in vitro tests are can didates for the in vivo tests described in Biological Reactivity Tests, In Vivo 88 . USP R EFERENCE S TANDARDS 11 —USP High-Density Polyethylene RS. USP Positive Bioreaction RS. Cell Culture Preparation —Prepare multiple cultures of L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929; alternative cell lines obtained from a standard repository may be used with suitable validation) mammalian fibroblast cells in serum-suppleme nted minimum esse ntial medium hav ing a seedi ng den sity of about 10 5 cells per mL. Incubate the cultures at 37 1 一in a h±midified
医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验 1 范围 GB/T 16886 的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。 这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育； a）用器械的浸提液，和／或 b）与器械接触。 这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T 16886 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T 16886.1-2001,idt ISO 10993- 1:1997）CB/ T 16886. 12-2000 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idt ISO 10993- 12 :1996） 3 术语与定义 GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。 3.1 阴性对照材料negative control material 按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。 注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。 3.2 阳性对照材料 pos itive control material 按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。 注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。 _____________________________________ 1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie, Maryland, USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。 2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMS Portex Ltd,Hythe, Kent,CT21 6JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC 聚氨甲酸乙酯可从Hatano 研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 , Hanagawa257-Japan) 获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO 对使用该产品不提供担保。
细胞毒性实验设计方案 1. 准备材料：DMEM高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素)DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4% 多聚甲醛指甲油6 孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45 pm滤膜 灭菌：50mL , 10mL 5mL离心管两种枪头 2. 实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 (SiO^SS-HA/DOX ,在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅(SiO2-SS-HA/DOX 的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX SQ2-SS-HA、DOX空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v) FBS和1%(w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SQ2-SS-HA/DOX SiO2、HA DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型： 培养基的配置：双抗1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37°C温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，力卩5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。(每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。) ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL冻存于-20 C，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%勺酒精放入超净台。
如有侵权请联系网站删除 细胞增殖-毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、 15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1、倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）； 4）加入含10%FBS勺培养液1?1.5ml［培养液：胰酶=（2?3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清 液； 7）加入含10%FBS ffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液； 8）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养 24-72 小时（37 C，5%CO2,使细胞贴壁； 10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）； 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。 当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10让（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）； 13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）； 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 精品资料
细胞毒理学及其研究方法 公共卫生学院劳动卫生教研室金亚平 定义: 毒理学(Toxicology)是研究外源性物质对生命有机体损伤作用规律及其机制的一门学科。 细胞毒理学(Cytotoxicology): 是研究外源性物质对生命细胞损伤作用规律及其机制的一门毒理学分支学科。 研究内容 细胞毒理学是以培养细胞为研究对象进行毒理学研究的一门科学，它主要是应用体外模型对外界环境中有害因子(物理、化学和生物)进行监测，评价其对人体可能产生的危害。 研究有害因子的一般毒性作用 判断外源性有害因子对细胞的一般毒性及评价可能引起的潜在毒性作用。 可通过光学显微镜/电镜及其他方法，直接观察体外培养细胞受损的性质与程度，如细胞的形态学改变、贴壁性差、生长速度减弱、细胞退化、死亡及完整性受损等。 已知对人类有毒性作用的大多数药物或毒物，在体内与体外的毒性效应是一致的。 研究有害因子的特异毒性作用 从哺乳动物或人体的不同组织器官分离出不同类型的细胞。用以筛检不同毒物对不同细胞的毒性。有害因子诱变作用及致癌作用: 体外培养细胞，特别是哺乳动物的离体细胞已广泛应用于体外测试诱变和致癌的试验中，其包括基因点突变、染色体畸变、姊妹染色单体互换、染色体显带、DNA 损伤、程序外DNA合成和细胞恶性转化等。如砷的致癌作用。 研究有害因子在细胞内的代谢 体外培养细胞可能是研究毒物代谢最合适的体外试验模型。体外细胞培养避免了体内复杂因素(如神经-内分泌、营养物质等)的干扰，可以按研究者预先设计的需要，来严格控制有害因子的剂量及与细胞接触的时间。可以直接检测、分析细胞内代谢的改变，容易了解毒物代谢与毒性之间的量-效关系。如砷体内代谢等。 研究有害因子的毒作用机制 也是研究有害因子毒性作用机制的最合适的材料。如用已建立的体外细胞转化系统研究辐射及化学致癌物诱发细胞癌变的机制，用血管上皮细胞和星形胶质细胞的体外培养系统研究毒物对血脑屏障的损伤，用巨噬细胞和成纤维细胞组成的体外培养系统，研究二氧化硅致矽肺纤维发生、发展过程及其作用机制。 用于药物的筛选、进行药效学评价 可用于研究药物的作用、毒副反应及其作用机制，为选择疗效好、毒副反应小的药物提供资料，在此研究基础上，对疗效好、毒性小的初筛药物，再用动物实验模型加以验证。 细胞毒理学发展简史 细胞毒理学作为毒理学的一个分支学科出现是近10多年的事。因此，它是一门较新的学科。 其优点: (1) 可以按实验要求控制实验条件，把整个实验安排在体外进行，在体外直接观察到细胞形态发生的改变，便于了解毒物与毒性作用之间的关系。 (2) 实验条件易于控制，可严格控制作用物的剂量和作用时间，排除体内复杂的神经-内分泌因素的干扰，实验结果稳定，重复性好。 (3) 操作简便，不需要复杂的大型仪器设备，实验经济。 (4) 可同时提供大量的生物学性状相同的细胞系(株)作为研究对象，避免了动物间的个体差异，实验易重复。 局限性： 因为细胞是在离开机体整体环境下，独立生长在体外环境中，其生物学性状多少会发生某些改变，
实验方案 繁殖障碍类病毒病(PR、PP、PRRS)弱毒疫苗的研制 1. 病毒的克隆 1.1 细胞制备原种细胞系（MARC－145，IBRS－2）复苏、传代 1.1.1复苏 （a）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即置37℃水浴中不断摇晃，待融化后，将细胞倒入25mL的克氏瓶中，加入含10％BCS的MEM生长液，37℃培养，5－6h后换液以倾去死亡细胞, 37℃培养。待长成单层后，进行传代培养。 （b）取液氮冻存的Marc-145(34代)细胞1支，立即投入37－38℃水浴中，待融化后（约1min），室温下在5min内用25℃左右的血清营养液稀释至原体积的4倍，500r/min离心10min，弃上清，加新鲜营养液悬浮细胞，并将细胞转入25mL的克氏瓶中补足营养液，37℃培养。 1.1.2传代 取长满单层后的细胞（约72h），倾去原来的营养液，用Hank’s液冲洗一次，加入0.25%的胰酶(或是0.5%的胰酶和0.04%EDTA的等量混合液)，其加入量以能在细胞上形成1mm 厚的液层为宜。置室温或37℃温度中消化，当细胞层开始由瓶壁脱离时（眼观可见细胞面呈毛玻璃样，镜下观察可见细胞圆缩，间隙增大，即将脱落），将消化液倾出，加入少量营养液，轻晃冲洗细胞层后倾弃，再加入相同于原营养液量的新营养液，以大口径吸管充分吹打，直到细胞完全分散，再加同量营养液，吹打数次后即可分瓶。（为便于吹打和分散细胞，开始时可以少加一些营养液，吹打分散后再逐步追加营养液至需量。）其分种率为1：2或1：3，37℃培养。 1.2 病毒培养种毒（PRRSV[欧美株]、PRV、PPV）复壮、病毒增殖 1.2.1种毒复壮（PRRSV[欧美株]、PRV） (1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液[1％Gln，2％NaHCO3(7.5%),1%双抗的MEM]，洗2－3遍，倾弃清洗营养液； (2) 接毒冻干毒种（原装量为2mL，湿毒1mL，保护剂1mL），以无血清MEM恢复为原装量，每瓶（100mL瓶）接毒1mL； (3) 吸附37℃吸附1h，其中每20min轻轻晃一次，以使接种毒液能与细胞层更好地接触以利病毒吸附。吸附1h后，倒出接种病毒液，再加入含3％BCS的维持液，置37℃培养。 (4) 收获每日观察细胞的CPE。接毒后24h、36h、48h各观察一次CPE，或根据CPE 的形成情况，适当缩短观察间隔时间，待细胞形成80％的CPE时，冻融三次后－20℃冻存。 1.2.2 病毒增殖 (1) 取刚长成单层的Marc-145细胞，倾弃营养液后，加入不含血清的维持液，洗2－3
细胞毒性实验方案 Prepared on 22 November 2020
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖)胰酶双抗(青霉素/链霉素） DAPIMTT(5mg/mL)DMSOPBS4%多聚甲醛指甲油6孔培养板96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL)一包μm滤膜 灭菌：50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅（SiO2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO2-SS-HA/DOX、SiO2-SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10%(v/v)FBS和1%(w/v)双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO2-SS-HA/DOX、SiO2、HA、DOX药物载体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗1%血清12%DMEM87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代：
（一）实验前应明确的问题 1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。 4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 （二）实验步骤 贴壁细胞： 1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 一、实验目的 了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。 二、常用细胞的种类 BHK-21:仓鼠肾传代细胞 PK-15:猪肾传代细胞 IBRS-2:猪肾传代细胞 Hela :人的子宫瘤细胞 Vero：非洲绿猴肾细胞 Marc-145:来源于Vero细胞 TK-143:人的胸苷激酶阴性细胞 Sf9 :昆虫细胞 三、材料 1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头 2、BHK-21 (baby hamster kidney )细胞 3、0.25%胰酶 4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM 5、伪狂犬病病毒液(PRV
四、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2-3 x 105个/ml 2）p H范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37C 昆虫细胞28-30 C 五、常用细胞分散剂与作用原理 1 、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质 水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。 2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA :与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。 3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。 六、营养液 1 、人工综合营养液 氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。 2、血清 1 ）血清的种类 胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。 2）血清的处理 无菌采集，过滤除菌。用前56°C灭活30min 3）血清的作用
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
病毒感染细胞的实验整体流程和原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。