GM（曲霉菌抗原）实验操作规范
一、临床意义
曲霉菌感染通常由于吸入空气中曲霉菌孢子引起。侵入性曲霉菌感染是曲霉菌感染的主要形式，一般有以下易患因素：恶病质、肿瘤、使用皮质醇激素、以及由于器官移植而使用免疫抑制剂等。早期正确用药是治疗的关键，但是由于血培养中很少可以分离到曲霉菌，所以诊断曲霉菌感染较为困难。目前诊断曲霉菌感染主要依据非特异的临床症状和放射检查。
检测血清中可溶性曲霉菌抗原（半乳甘露聚糖galactromannan）已成为目前主要的血清学方法，这个方法有助于曲霉菌感染的早期诊断，提高检测特异性。本试剂盒是利用酶联免疫一步夹心法半定量测定血清中半乳甘露聚糖galactomannan抗原。
二、试剂盒组成：
R1 微孔板 1块（12 x 8 ）
R2 浓缩洗液 1 x 100ml（10倍浓缩）：
R3 阴性控制 2 x qs 1ml
R4 标准品 2 x qs 1ml（2.0 ng/ml）
R5 阳性质控 2 x qs 1ml
R6 酶 1 x 8 ml
R7处理液 1 x 10.5 ml
R8 TMB稀释液 1 x 60 ml
R9 TMB 1 x 1 ml
R10 终止液 1 x 12 ml
封板胶 6
三、实验步骤
实验前，将试剂平衡至室温（18-30℃）
1.样本采集：
用干燥管采集的血样（只能用干燥管采集的血清样品），离心后，吸取血清并保存在密闭的试管中。
样品离心前应完全凝结
2.试剂配制：
1）实验用洗液——用无菌蒸馏水将浓缩洗液（R2）按 1:10稀释，
2) 实验用阴性质控(R3)、阳性质控(R5)、标准血清（R4）——用1000μl超纯无菌水稀释配制成三等份，其中两份零下二十度冷冻。
3）实验用显色液——用底物稀释液（R8）将显色液（R9）按1:50稀释。
3.样品处理：
分别取阴性质控(R3)，阳性质控(R5)，标准血清（R4）和病人都样本放入1.5ml Eppendorf管。按3:1加入处理溶液(R7)，摇匀，密封管子。100℃水浴3分钟后，10000g离心10分钟。
取上清液用于检测可溶性曲霉菌抗原。处理好的血清，必须尽快使用。所有血清处理程序，可用于念珠菌抗原测试，这两种血清的处理程序是一样的。
4.加样
1）取实验所需数量的微孔板
2）每孔加入50μl酶反应液R6（使用前，颠倒R6小瓶以摇匀。）。
3）分别加入50μl处理过血清的上清液，阴性质控, 阳性质控，标准血清上清液
可以根据下面的计划放置：
-A1：阴性质控血清（R3）
-B1：标准血清（R4）
-C1：标准血清（R4）
-D1：阳性质控血清（R5）
3）用封板胶覆盖整个微孔板，按紧整个表面保证滴水不漏。
4）于37℃恒温温育90分钟
5）拿去粘合膜，弃去孔内的液体，用稀释后的洗液洗5次。反转板条放在吸水纸上轻拍，去掉所有洗液，把板条弄干。
9）每孔加200μl稀释显色液，室温（18-30℃）避光（不要使用封板胶）反应30分钟。
10）每孔加100μl终止液，
11）30分钟内于酶标仪450/620 nm读数。
四、结果解释
1. 检测CUT-OFF值。
Cut-off值 = 标准血清（R4）OD值。
2. 计算每个测试后血清的指数（I）：
I = OD 样品/cut-off 值
该计算限于内部测试和实验室测试不同酶免反应条件下的各种OD。
测试确定：
每次测试都要用质控血清。以下标准确保测试过程的有效性：
0.3≤cut-off值≤0.8
阳性质控血清（R5）指数>2.0
阴性质控血清（R3）指数<0.4
4）结果解释
. 阴性——指数I<0.5
. 阳性——指数I≥0.5
病人血清样品的指数>1,必须用同一样品（用未处理血清）再测和测试该病人的另一样品以确认，来排除收集样品后受污染导致的假阳性结果。
五、贮存
1.样品
24小时内完成试验的，可将样品储存在+2-8℃；不能在24小时内完成试验的，或要运输样品的，样品必须冰冻在-20℃以下。
样品血清只允许最多3次冻融。冰冻过的样品在使用前必须在溶解后彻底混合。
2.试剂
微孔板R1：打开真空包装待后，板条可在+2-8℃小心封好在原装袋中稳定保存5周。
浓缩洗液R2：稀释后，洗液可在+2-8℃存放2周。
显色液R9：用R8稀释后，可在避光情况下，室温（18-30℃）稳定保存6小时。
R3、R4、R5：配制后，不用必须立即冰冻在-20℃。
R6、R7、R8、R9、R10：打开后，试剂储存在+2-8℃，在无污染情况下，可保存至标签的有效期。
六、注意事项
1.不使用过期的试剂。
2.不要在一次试验中混用不同批号的试剂。
3.在配制或稀释试剂的过程中，不能有任何的污染。
4.不要在不洁净的环境中经行试验,如：酸性、碱性或有灰尘会改变酶的或性变化。
5.酶反应对金属离子十分敏感。因此，不要让任何金属元素接触到各种反应或底物溶液。
6.显色液必须是无色的。如果变蓝色表示该试剂不能使用必须更换。各种塑料容器、玻璃器具等用1N 盐
酸清洗，然后用蒸馏水冲洗；用干燥的器具配制显色液并避光储存。
7.用新吸管吸取每个样品。
8.在洗板后加试剂前不要让微孔板干。注意事项
9.不要用同一个容器配制抗体和显色液。
10.严格遵守规定的温度是试验成功的重要因素。不要依赖设备的温度显示，使用探热针检测温度：（100℃
水浴。）
11.结果的可靠性依赖于正确执行以下良好的实验室操作规范。
七、实验需要但试剂盒没提供的
1.震荡器
2.转速达1000g的离心机（可放置1.5ml锥型试管）
3.450/620nm双波长酶标仪
4.37℃恒温箱
5. 1.5ml Eppendorf试管
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