光合细菌（Photosynthetic bacteria，简称PSB）是具有原始光能合成体系的原核生物的总称，它广泛存在于自然界的水田、湖泊、江河、海洋、活性污泥及土壤内，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。 第一节光合细菌的生物学和营养价值 一、光合细菌的生物学 光合细菌包括产氧光合细菌（蓝细菌）和不产氧光合细菌两大部分，在实际中应用的大部分是不产氧型光合细菌。不产氧光合细菌包括紫细菌、绿细菌和日光杆菌属、红色杆菌属等总共 27个属 66个种。不产氧光合细菌是代谢类型复杂、生理功能最为广泛的微生物类群。各种光合细菌获取能量和利用有机质的能力不同，它们的代谢途径随环境变化可以发生改变。光合细菌从营养类型看包括光能自养型、光能异养型及兼性营养类型；从呼吸类型看包括好氧、厌氧和兼性厌氧型。 光合细菌是革兰氏阴性菌，在10～45℃范围内均可生长繁殖，最佳温度在30～40℃。绝大多数光合细菌的最佳pH值范围在7～8.5之间。钠、钾、钙、钴、镁和铁等是光合细菌生理代谢中的必需元素。 二、光合细菌的营养价值 光合细菌的菌体无毒，营养丰富，蛋白质含量高达65%，而且氨基酸组成齐全，含有机体需要的8种必需氨基酸，各种氨基酸的比例也比较合理。PSB还含有丰富的B族维生素，尤其是B12、叶酸、生物素的含量相当高是啤酒酵母和小球藻的20到60多倍。PSB 菌体内含有较高浓度的类胡萝素，而且种类繁多，迄今已从光合细菌中分离出80种以上的类胡萝卜素。除此之外，细胞内还含有碳素储存物质糖原和聚β一羟基丁酸、辅酶Q、抗病毒物质和生长促进因子，具有很高的营养价值。 光合细菌在虾、贝类的幼体培育中应用非常广泛，其一方面能净化水质，改善幼体的环境条件，另一方面作为饵料被幼体摄食（贝类幼体相对虾幼体的蚤状阶段都能直接摄食光合细菌），对促进幼体生长、变态和提高成活率有明显效果。 第二节光合细菌的培养方法 一、培养方式 光合细菌的大量培养通常采用全封闭式厌气光照培养和开放式微气光照培养两种方式。 （一）全封闭式厌气光照培养 全封闭式厌气光照培养是采用无色透明的玻璃容器或塑料薄膜袋，消毒后装入消毒好的培养液，接入20％～50％的菌种母液，使整个容器均被液体充满，加盖（或扎紧接口）， 造成厌气的培养环境，置于有阳光的地方或用人工光源进行培养，定时搅动，在适宜的温度下，一般经过5～10天的培养，即可达到指数生长期高峰，此时可采收或进一步扩大培养。 （二）开放式微气光照培养 开放式微气光照培养一般采用容量为l00～200升的塑料桶为培养容器。在桶底部装一气石，培养时微充气、使桶内的光合细菌呈上下缓慢翻动。在桶的正上方距捅面30厘米左有装一有罩的白炽灯泡，使被面照度达2000 lx左右。培养前先把容器消毒，加入消毒好的培养液，接入20％～50％的菌种母液，照明，微充气培养。在适宜的温度下，一般经7～10天的培养，即可达到指数生长期高峰，此时，进行采收或近一步扩大培养。 两种培养方式相比，以厌气培养方式较为理想，微气培养方式虽然设备比较简单，易于大量培养，但杂菌污染程度大，培养达到的菌细胞密度低。 二、菌种分离、保藏 培养光合细菌首先要有菌种。目前，应用于水产养殖业的光合细菌，主要是红螺菌科即紫色非硫细菌中的一些种类。它们共同的特征是具鞭毛，能运动，不产生气泡，细胞内不积累硫磺。光合细菌分离成功的关键在于选择适宜的富集、分离培养基，和提供适于光合细菌生长需要的厌气环境及适宜的温度、光照条件。 （一）采样 红螺菌科细菌可用有机物作为光合作用的供氢体兼碳源，广泛分布在被有机物污染的地方，如河底、湖底、海底、水田、沟渠和污水塘的泥土以及豆制品厂、淀粉厂和食品工业 等废水排水沟处呈橙黄色或粉红色的泥土中。浅水处直接用杯舀取少量泥土作样品，深水处借用采水器和采泥器采样。 （二）富集培养 富集培养均采用液体培养基。将采回的样品(土壤或水)装入玻璃圆筒或大型试管或具塞的磨口玻璃瓶中，倒入配制好的培养液，充分搅拌。为造成厌气环境，在玻璃圆筒或大型
常见真菌的分离与鉴定 病原真菌的一般特性 真菌（Fungi）是微生物中的一个大类，是一群数目庞大的细胞生物，估计全世界已有记载的真菌有10万种以上。它们的子实体小者用显微镜才能见到，大者可达数十厘米，它们共同特征是具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性或无性繁殖，具有纤维素（或其他葡聚糖）或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。对人类和动物致病的真菌大约100余种，属于病原真菌。 一、基本性状 （一）形态结构 真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类，前者属于酵母菌（yeast）一般呈球形或卵圆形，后者称为霉菌（mold）或丝状真菌，呈丝状分枝，菌丝交织象绒球状，另有一些真菌可因寄生环境及培养条件（养料、温度、氧气等）的不同可交替出现两种形态，即在室温中呈霉菌型，在37℃或体内呈单细胞的酵母型，这类真菌有双相性，所以称之为双态真菌或二相真菌。 真菌的细胞结构与一般植物细胞相似，有定型的细胞核及完善的细胞器，但胞壁与细菌胞壁不同，不含粘肽而是由角质及葡聚糖组成，也含有脂多糖蛋白质，其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖，不生长真菌丝，革兰氏染色呈阳性，丝状真菌分菌丝及孢子两部分，形态多种多样，分述如下。 1．菌丝（Hypha）真菌在合适的环境中，由孢子生出嫩芽，称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状，称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝，增殖的菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生的物体或培养基中吸取养料，称为营养菌丝体。另一部分菌丝向空间生长，称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者，称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌的菌丝无明显分隔，称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式，如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝。 2．孢子生成孢子是真菌扩大繁殖的一种方式。真菌孢子的抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同，分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞的结合而形成的孢子叫无性孢子，这一繁殖过程称为无性繁殖。常见的无性孢子有5种：关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢和分生孢子。病原真菌属于不完全菌纲，很少产生有性孢子，大多数是无性孢子。 （1）厚壁孢子：当真菌在不利环境中，由菌丝内胞浆缩浓和胞壁增厚而成，呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。
光合细菌 绿硫细菌、红硫细菌（过去叫做紫硫细菌）和红螺细菌（过去叫做紫色非硫细菌）等，都是能够进行光合作用的细菌。这些细菌都是球状、杆状或弧状的小型细菌，并且大多数都不能够运动。这些细菌的菌体内含有类似于绿色植物体内叶绿素那样的光合色素，这种光合色素叫做细菌叶绿素。有的光合细菌还含有大量的类胡萝卜素，认而使菌体呈现出红色。 光合细菌和绿色值物都能够进行光合作用，但是，绿色植物的光合作用是以水作为二氧化碳的还原剂，同时释放出氧的，细菌光合作用则以硫化氢或有机物（如乙醇、琥珀酸等）为供氢体，即还原二氧化碳的还原剂，把二氧化碳还原为葡萄糖，同时析出硫磺或产生其它有机物（如乙醛等），下面写出的是绿硫细菌的光合作用反应式： 因此，细菌光合作用和绿色植物的光合作用，可以用下面的通式来概括（通式中的A对于绿色植物来说是氧，对于光合细菌来说则是硫或其他无机硫化物。 从光合细菌的代谢类型我们可看出，同化作用存在着不同的形式，下面就生物的同化类型进行一下分类。 根据生物的同化作用所需能源和碳源的不同，可把生物的代谢类型分为四大类型： （l）光能自养型：以光为能源，以二氧化碳为主要碳源的生物，通常具有光合色素 合成有机物。例如高等植物、藻类及某些具有光合色素的细菌均属于这一原CO 2 的方式可用以下通式表示： 类型。这类生物同化CO 2 （2）光能异养型：以光为能源，以有机物为主要碳源的生物，有些细菌具有光合色素能进行光合作用，但它们以有机物作为供氢体，同化有机物形成自身物质。如非硫紫菌以乙醇为碳源，使乙醇氧化为乙醛，二氧化碳还原成葡萄糖。
（3）化能自养型：以化学能为能源，以CO 2 为主要碳源。这类生物能氧化 某些无机物（如NH 3、H 2 S等）取得的化学能去还原CO 2 合成有机物。如硝化细菌、 硫细菌等。 （4）化能异养型：以有机物氧化所产生的化学能为能源，碳源也主要来自有机物。动物，动物、真菌和绝大多数细菌都属于这一类型。
《微生物学》复习思考题 第1章绪论 1.名词解释：微生物，微生物学 2.用具体事例说明人类与微生物的关系。 3.微生物包括哪些类群？它有哪些特点? 4.为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人? 5.试根据微生物的特点，谈谈为什么说微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友？ 6.简述21世纪微生物学发展的主要趋势。 第2章原核微生物 1.名词解释：肽聚糖、溶菌酶、核区、异形胞 2.根据革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌细胞壁通透性来说明革兰氏染色的机制。 3.什么是芽孢？它在什么时候形成？试从其特殊的结构与成分 说明芽孢的抗逆性。渗透调节皮层膨胀学说是如何解释芽孢耐热机制的？ 4.立克次氏体有哪些与专性活细胞内寄生有关的特性？它们有什么特殊的生活方式？衣 原体与立克次氏体都为专性活细胞内寄生，两者有何差别？ 5.螺旋体和螺旋菌有何不同？ 6.什么是缺壁细菌？试简述四类缺壁细菌的形成、特点和实践意义。 7.举例说明细菌的属名和种名。 8.试述古生菌和细菌的主要区别。 9.试根据细菌和古生菌细胞结构的特点，分析并举例说明为什么它们能在自然界中分布 泛。 10.细菌（狭义）、放线菌、霉菌、酵母在繁殖方式上各有什么特点？ 第三章真核微生物 1.名词解释：真菌、霉菌、酵母菌、真酵母、假酵母。 2.举例说明霉菌与酵母菌与人类的关系。 3.试列表说明真核微生物与原核微生物的主要区别。 4.试图示真核生物“9+2型”鞭毛的横切面构造，并简述其运动机理。 5.细菌(狭义)、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落有何不同？ 6.试比较细菌(狭义)、放线菌、酵母菌和霉菌细胞壁成分的异同，并讨论它们的原生 质体的制备方法。 7.丝状真菌的营养菌丝和气生菌丝各有何特点？它们可以分化出哪些特殊结构？ 8.试述真菌的孢子类型和特点。 第4章病毒 1. 名词解释：病毒粒子、烈性噬菌体、温和噬菌体、溶源性转变、前噬菌体、溶源性细菌、 裂解量、类病毒、朊病毒。 2. 病毒区别于其他生物的特点是什么? 根据你的理解，病毒应如何定义? 3. 试述病毒的主要化学组成及其功能。 4. 病毒壳体结构有哪几种对称形式? 毒粒的主要结构类型有哪些?
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
沼泽红假单胞菌的分类鉴定和生理特性 摘要采用改良的Hungate厌氧培养技术一滚管法,从淀粉厂的污泥中,分离得到一株革兰氏阴性,弯曲杆状,出芽繁殖,既能在光照厌氧,也能在黑暗好氧条件下生活的光能异养型Y6菌株.经形态观察、生理特性的测定,确证Y6菌株为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudpmonaspalustris). 关键词:紫色非硫光合细菌,沼泽红假单胞菌,厌氧培养技术 利用光合细菌净化高浓度有机废水,己是废水生物处理法中的一个重要方法.它具有 有机负荷高,占地面积小,投资费用少,动力消耗低,除氮效果好和耐盐能力强等优点. 同时,产生的菌体污泥是优质的饲料和肥料,可加以综合利用.因此,近几年来用光合细 菌法(PSB)净化废水正受到人们的广泛重视. 目前,用于有机废水净化的光合细菌,主要是紫色非硫细菌红螺菌科 (Rhodo‘Pi({llaceac)的一些菌株·这些菌一般均为兼性光合细菌·应用于有机废水净化的菌株,要求对有机质有较强的代谢能力和较高的耐受性,对不良环境因素,如温度、pH 和盐度等有较强的适应性. 为了进一步开展紫色非硫细菌在净化有机废水中的应用研究,我们从淀粉厂污泥中分 离到一株光能异养型Y6菌株.经初步测试,表明具有利用基质广泛、生长速度快、耐受 有机质浓度较高等特点.经鉴定确认,Y‘菌株为沼泽红假单胞菌 (Rhodo脾udomonas尸alustr哟.现将分离鉴定结果和某些生理特性报导如下. 材料和方法 . 1菌株来源 Y6菌株从济南市槐荫区淀粉厂污水排放沟污泥中分离获得. . 2培养基 vanNiel培养基〔‘〕 Molisch琼脂培养基〔2〕 YP琼脂培养基〔,〕 RCVBN培养基〔3〕 , 3菌种分离和纯化 *收稿口期:1990一l!一16第3期于温旭等:紫色非硫光合细菌的研究·345· 取污泥样品在VanNiel培养基中富集培养,30℃,Zo00Lx光照厌氧培养3一4天 后,培养基呈绛红色.再经4次连续转接培养,使光合细菌的生长在富集液中占绝对优 势,然后采用改良Hungat。厌氧培养技术一注滚管法闭进行分离纯化.待长出单个红色 菌落后挑取菌落穿刺接人Molish琼脂杜内保存,或再用YP培养基平板反复划线分离, 取得纯培养物. 1.4碳源和电子供体、氨基酸利用试验 在每支装有sml琼脂基础培养基试管中分别加人0.2%浓度的各种碳源和电子供 体:或在每支装有sml不含氮源的基础培养基试管中,分别加人0.01%浓度的各类氨基 酸.试验均采用穿刺法,并置于28℃,1000Lx厌氧光照培养3天. 1.5完整菌体和离体光合色素吸收光谱的检测 活细胞吸收光谱测定,用60%蔗糖溶液制成菌体悬液:离体光合色素吸收光谱测
红螺菌培养基： 1、富集培养基： 经典的紫色非硫细菌（红螺菌）的富集培养基的配方为：NH4Cl：0.1g；NaHCO3：0.1g；K2HPO4：0.02g；CH3COONa：0.1~0.5g；MgSO4·7H2O：0.02g；NaCl：0.05～0.2g；生长因子1ml，蒸馏水97ml，微量元素溶液 1ml，pH为7.0。 其中，①5％NaHCO 3 水溶液，过滤除菌取2m1加入无菌培养基中。②生长因子：维生素B10.001mg、乙尼克丁酸0.1mg、对氨基苯甲酸0.1mg、生物素0.001mg，以上药品溶于蒸馏水中，定容至10ml，然后过滤除菌。③ 微量元素溶液：FeCl 3·6H 2 O ：5mg；CuS0 4 ·5H 2 O：0.05mg；H 3 BO 4 lmg； MnCl 2·4H 2 O：0.05mg；ZnSO 4 ·7H 2 O：1mg；Co(NO 3 ) 2 ·6H 2 O： 0.5mg。以上药 品分别溶于蒸馏水中，并定容至1000m1。 除①、②、③外，各成分溶解后100 Pa灭菌20min。然后分别加入①、 ②、③，如加入0.1％～0.3％的蛋白胨则能促进该菌生长。 2、分离培养基： 传统的红螺科分离培养基的配方为：NH 4Cl：0.1g； MgCl 2 ：0.02g；酵 母膏：0.01g； K 2HPO 4 ：0.05g； NaCl： 0.2g；琼脂2g，蒸馏水90ml。 100Pa灭菌20min。 灭菌后，无菌操作加入经过滤除菌的0.5g/5mlNaHCO 3 ，再无菌加入过 滤除菌的0.1g或0.1mlNa 2S·9H 2 O（降低培养基的氧化还原值），最后再加 入5ml经过滤除菌的乙醇、戊醇或4％丙氨酸。用过滤灭菌的0.1mol/H 3PO 3 调pH至7.0。 摘自百度知道。 筛选富集培养基为: NH4Cl 1g/L, NaHCO3 1g/L, CH3COONa 3g/L, KH2PO4 0.3g/L, MgSO4 0.1g/L, 酵母膏0.5g/L, 微量元素母液1g, 自然pH值。扩大培养培养基以海水代替微量元素母液。1000~4000lx光照, (30±2)℃恒温培养。 参考文献：固定化海洋光合细菌处理生活污水的研究* 黄宝兴,李兰生,赵亮,张微,唐迎迎海洋湖沼通报 基础培养基:NH4Cl:1g; Na2HPO4: 0.5g; MgSO4: 0.2g; NaCl: 2g; NaHCO3: 5g; 酵母膏:2g ; 乙醇2ml，用0.1N H3PO4调至pH7.0。 划线培养基:采用固体琼脂培养基，即在基础培养基的基础上添加1.0%的琼脂。 以上培养基初始pH值均用H3PO4调至7.0，经121℃灭菌30分钟，NaHCO3过滤除 菌后加入。培养条件:光照培养箱温度控制在30℃、光照强度控制在3000uE.m-2s-1培养。光合细菌是一种兼性嫌气细菌，需要深层培养或在真空干燥器内达到嫌气或半嫌气状态，一般将混合菌放入培养液中先富集再分离。具体方法:将混合菌装入10ml试管中，加入培养
第一章绪论 本章要求 ●掌握微生物、微生物学的概念； ●掌握微生物与人类的关系； ●了解微生物学研究的基本内容； ●掌握微生物的共同特点； ●理解微生物学的发展历程及各阶段特点； ●掌握巴斯德、科赫对微生物学发展做出的重大贡献； ●了解微生物学发展中的重大事件。 1、微生物有哪五大共性？ 体积小、面积大；吸收多，转化快；生长旺，繁殖快；适应强，变异快；分布广，种类多。 2、用具体事例说明人类与微生物的关系。 微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中；微生物在人们的日常生活、工农业生产和医药、环保等方面有重要的应用；微生物也有可能引起毁灭性的灾害。人类很多食品都和微生物有关，如馒头、面包、酸奶、米酒、酸（泡）菜、啤酒、白酒等；还有很多药物，如抗生素是微生物代谢的产物，可帮助人们杀菌消炎；微生物还可以结合基因工程和发酵工程，快速生产人类需要的产物。也有很多微生物是致病菌，比如痢疾杆菌可以导致痢疾，结核杆菌是肺结核的罪魁祸首，一些新发疾病给人类带来威胁；食品的腐败也是微生物大量繁殖的结果。所以，微生物既是人类的敌人,更是人类的朋友。 3、微生物的最基本特性是什么？为什么？ 体积小，表面积大。有大的营养物质吸收面和代谢产物排除面，能迅速与外界进行物质交换，导致生长旺盛，繁殖速度快。 4、简述巴斯德对微生物学的主要贡献 1）、著名的曲颈瓶试验无可辩驳地证实，引起腐败的细菌是本身繁殖的，彻底否定了“自然发生”学说发现并证实发酵是由微生物引起的； 2)、钝化的鸡霍乱病原体预防霍乱、首次制成炭疽病、狂犬疫苗，开创免疫学，进行预防接种; 3）、证实发酵是微生物引起的，分离到许多引起发酵的微生物，为进一步研究微生物的生理和生化和工业微生物奠定了基础。 4）、其他贡献：巴斯德消毒法：60～65℃作短时间加热处理，杀死有害微生物。 5、简述科赫对微生物学的主要贡献。 答：a、在微生物病原学和免疫学的贡献：（1）具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌；（2）发现了肺结核病的病原菌，这是当时死亡率极高的传染性疾病，因此柯赫获得了诺贝尔奖；（3）提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则——柯赫原则。b、在细菌学研究技术学的贡献：（1）固体培养基分离和纯化微生物的技术；（2）培养基配制技术；（3）发明了一系列微生物染色和观察方法，包括显微摄影技术。 6、简述科赫法则的主要内容 ①一种病原微生物必然存在患病动物体内，但不应出现在健康动物内； ②此病原微生物可从患病动物分离得到纯培养物； ③将分离出的纯培养物人工接种敏感动物时，必定出现该疾病所特有的症状； ④从人工接种的动物可以再次分离出性状与有病原微生物相同的纯培养物。 7、为什么微生物学比动、植物学起步晚，但却发展非常迅速？ 答：由于微生物具有其他生物不具备的生物学特性：个体小、结构简单、生长周期短，易大量培养，容易变异，重复性强，容易操作等。动、植物由于结构的复杂性及技术方法的限制
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml
琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧
绪论 三、微生物的特点 （一）个体极小，比表面积大 （二）繁殖快、代谢速率快 （三）数量多 （四）易变异 （五）种类多、分布广、代谢类型多样 (一)个体极小，比表面积大 (二)代谢速率快、繁殖快 （三）数量多 (四)易变异 (五) 种类多、分布广、代谢类型多样 病毒 ?没有细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核以及各种细胞器 ?经典病毒 ?＝（包膜+）蛋白质衣壳+核酸+极少量(或没有)酶蛋白； ?螺旋对称型：烟草花叶病毒、狂犬病毒、流感病毒等 ?立体对称型：腺病毒、疱疹病毒、骨髓灰质炎病毒 ?复合对称型：大肠杆菌T系噬菌体 噬菌体只侵染细菌、真菌、放线菌等微生物 ?提问：溶源现象的生物意义是什么？ ?自我保护机制（反间计），细菌不仅获得了免疫特性，而且增多了自身的遗传类型，提高了进化程度，可谓一举而两得，化害为利。 ?病毒主要是通过食物、接触、空气传播的，但也可以通过饮用水传播， 细菌 细菌的分类 细菌：单细胞不分枝的原核微生物。 细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察 球菌 球菌就是球形的细菌，它是这类细菌的总称，细胞呈球形或椭圆形。 杆菌 细胞呈杆状或圆柱状，菌体直或稍弯，粗短或细长。末端钝圆、尖、膨大或平裁状。 弧菌 弧菌细胞呈弧形， 细菌的结构 1. 细胞壁
功能 提问：哪些功能？ ①固定细胞外形； ②保护细胞免受外力的损伤； ③阻拦大分子物质进人细胞④使某些细菌具有致病性及对噬菌体的敏感性。 两种最常见的细菌细胞壁结构 革兰氏染色法 1.涂片固定 2.单染—结晶紫染液第一次染色1min 3.媒染—碘-碘化钾溶液浸湿30S 4. 脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱 5.复染—红色的藩红染液第二次染色细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G＋）； 呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G -） 请对照两种细菌细胞壁的不同结构，说明为什么染色上会有区别？ 2. 细胞膜（原生质体） 紧贴在细胞壁的内侧而包围细胞质的一层柔软而富有弹性的半渗透膜。 化学组成脂质（20－30％）蛋白质（60－70％） 结构极性磷脂双分子层 提问：功能？ 3. 细胞质 细胞膜内除拟核以外的所有无色透明、呈粘胶状物质。 （1）核糖体 提问：功能？多肽和蛋白质的合成场所。 （2）细胞内含物 1．气泡（水生细菌）提问：功能？相当于鱼的鱼漂 2．异染颗粒 蓝色侵染呈紫红色。 化学本质——偏磷酸盐的聚合物。 功能？磷源和能源性贮藏物， 3．聚 -羟基丁酸（简称PHB）颗粒 功能？能量的贮存物;调节pH 4．糖原和淀粉粒 5．硫粒 某些化能自养型硫细菌，贮存的能源物质， 4. 核质体 ——原核生物所特有的原始细胞核。 细菌的核质体是一个大型环状的双链DNA分子，长度0．25mm~3mm，为细菌遗传物质，卷曲折叠于核区。 核区没有外膜（这是原核生物与真核生物一个主要的区别之处） 5. 荚膜 是某些细菌在新陈代谢过程中形成的，分泌于细胞壁外的粘液状物质。 —含水率在90％~98％，极难染色；—多糖、糖蛋白单染后墨汁背景衬托法观察
细菌分离纯化培养及鉴定protocol 样品菌株分离： 准备工作 1用报纸将平板包好（约12个一包）灭菌后放入烘箱烘干，最好隔夜； 2按照培养基的配方配制好液体培养基后，调pH值（注意灭菌后培养基pH会略有升高），其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼脂后，倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量不能超过锥形瓶的三分之二，约一半左右；剩余液体培养基加入试管中，每支5ml（其中3ml用于保种，2ml用于提取菌株基因组DNA），用胶塞封好，与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌； 3将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟，将灭好菌的培养基放置冷却到不烫手后，在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中，每块板中倒入约20ml，厚度约为培养皿的1/3~1/2之间。倒好后的培养皿叠放在超净台内，待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使用。暂时不用的，可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4在培养皿上写清样品名称，标注日期，姓名。用枪加入100uL液体样品到培养皿上，尽量把培养皿托平，将涂布玻棒插入酒精中取出在酒精灯外焰灼烧完全，待冷却后，在酒精灯下将液体涂布均匀（最好涂布至培养基将液体全部吸收）。 5将涂好的培养皿正置培养2小时后，用封口膜封好，倒置培养。
定时观察平板，描述菌落的颜色、形状，记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化： 1待涂布好的培养皿上长出单菌落后，用挑取同一培养皿中不同颜色、不同形状的菌落进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标出。 2将接种针在酒精灯外焰灼烧完全，稍冷却后，在平板上进行Z字形三个方向划线。 3若在新板上又长出新菌落，再次分离划线 4划线需做至少2－3次，直至菌落完全纯化（纯化步骤很关键） 保种： 1 将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内（注意要取单菌落），摇床150r/min， 28℃培养，直到其生长至指数期 2在2ml冻存管（预先灭菌并烘干）中加入1ml 30%甘油（甘油预先配置好灭菌后待用），再加入1ml上述1中的菌液，盖紧管盖，混匀后在管壁做好样品标记和日期，同时在实验记录本上做好记录3以上每个样做三管，做好记录，放入冷存盒，放入－80度冰箱内，记录存放位置。 4将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中待提取DNA。 DNA的提取：可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行
实验一动物病原细菌的分离与鉴定 一、实验目的 了解动物病原细菌的分离、鉴定的常规程序与基本方法 二、实验原理 初步分离鉴定：利用细菌在特定的选择培养基上的生长特性，观察细菌培养特征； 确定细菌的血清型、毒力因子：血清学检测或PCR检测技术 大肠杆菌的培养特征：37℃,培养24h,各种培养基生长特征： 普通营养琼脂平板：白色圆形，隆起，中等大小 麦康凯琼脂：红色、圆形、隆起、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小 糖铁琼脂斜面培养基：底层变黄，产酸产气 伊红美蓝培养基：黑色、金属光泽 革兰氏染色：革兰氏阴性、分散或成对排列、两端钝圆的短杆菌 血清学鉴定：玻片凝集实验：颗粒性抗原与相应抗体结合出现凝集沉淀。大肠杆菌中，为了避免K抗原对O抗原凝集的抑制作用，利用O抗原的耐热性高于K抗原，实验前进行、高压或煮沸处理。 三、实验材料 1）材料：可疑病料，需提前三天提供小鼠 2）菌株：致病性大肠杆菌菌株 3）试剂：营养肉汤、营养琼脂、CT-SMAC琼脂、TSI琼脂、伊红美蓝琼脂培养基、IMViC、大肠杆菌O157标准血清、生理盐水、吉姆萨染色液、酒精或棉球。 4）仪器：显微镜、37℃恒温培养箱、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、载玻片、记号笔、口罩、手套。 四、操作步骤 1.分离培养 第一天： 1.）处死小鼠，无菌解剖 2.）观察各脏器是否出现肉眼病理变化； 3.）无菌采集内脏病料，通过无菌操作划线接种于普通琼脂平板、改良山梨醇麦康凯（CT-MAC)琼脂平板各一块，37℃培养24h； 4.）同时无菌挑取一小块病料，直接涂片，吉姆萨染色，油镜观察组织中的细菌特征； 第二天 5.）挑取CT-SMAC典型单个菌落分别接种于TSI琼脂斜面、伊红美蓝琼脂和营养肉汤，37℃培养24h。挑取普通培养基上的菌落进行糖类发酵和IMViC生化实验。 糖（醇）类发酵实验：接种两只葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基，麦芽糖发酵培养基，一支接种，一支对照；接好后置于37℃温箱中培养24h。 吲哚（Indol）试验：接种到胰蛋白胨水（含色氨酸）培养基中，37℃培养24-48h。 甲基红（Methyl red)试验：将菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 VP(PVoges-Proskauer)试验：将菌种接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃培养48h。 硫化氢试验：将菌以接种针穿刺接种到醋酸铅或柠檬酸铁氨培养基中，37℃培养24h。 柠檬酸盐试验（Citrate utilization）：取少量菌种接种到柠檬酸盐培养基上，37℃培养24h。 第三天 １.观察现象，滴定检验
绪论 1 微生物、微生物学的概念 1.微生物：一群形态结构简单、肉眼看不见的低等生物的统称。 2 微生物学：研究微生物及其生命活动规律的科学。 2 微生物有哪些共性 1 个体小，形态简单； 2 分布广，种类多； 3 繁殖快，数量大； 4 比值大，代谢强（表面积与体积比值大）；5.适应强，易变异。 3 微生物在农业生产中有那些应用？ 土壤与土壤肥力的形成与发展；有机物的分解和生物固氮；引起病害并对植物病虫害的生物防治产生植物生长刺激素（赤霉素）有机肥料的腐熟 4 细胞生物的三界元系统？ 三元界系统：真细菌或称细菌 古细菌或称古菌 真核生物 5 微生物学的两个重要奠基人对微生物学科发展的主要贡献？ 1.微生物学的开山鼻祖——列文虎克 1673年用自己制造的显微镜观察到了被他称为“小动物”的微生物世界。 2.奠基人之一——法国的巴斯德 卓越贡献：彻底否定了“自生说”学说；免疫学——预防接种；证实了发酵是由微生物引起的；发明巴斯德消毒法 3.奠基人之二——德国的柯赫 ▲微生物基本操作技术： 配制培养基 用固体培养基分离纯化微生物技术 ▲病原细菌的研究： 证实炭疽病的病原菌是炭疽病菌。 发现了肺结核病的病原菌（获得诺贝尔奖） 提出了柯赫法则 第一章原核微生物 1 有哪些染色法可以用于细菌的染色？ 细菌是透明或半透明，染色后宜于观察。常用的染色法有： 1 简单染色：常用来观察细菌的形态、大小和排列方式。 用一种染液染色菌体。一般菌体被染上染料的颜色。 2 负染色法：用衬托的方法将无色的观察对象显现出来，如对荚膜的染色。 3 革兰氏染色法：细菌的鉴别性染色。是一种经验染色法。 2 为什么说细菌的形态并不是固定不变的？ 影响细菌形态的因素：培养时间、培养温度、培养基成分、浓度、pH值 细菌形态易受环境影响，如培养时间、温度、培养基成分、PH值等。但同一种菌：幼龄和条件适宜，细菌形态正常；老龄或有药物、抗生素等不正常条件存在，细菌出现畸形，如果转到合适新鲜的培养基中培养，又可恢复原有形态。 3 细菌的基本形态有哪几种？ 球状、杆状、螺旋状 G+菌细胞壁一层：20－80nm的肽聚糖层（含磷壁酸）【由肽聚糖和磷壁酸组成】
紫硫细菌和绿硫细菌的区别在哪里？它们的什么差异使我们把它们分成两类？紫硫细菌和绿硫细菌的区别主要有7点：形态特征，需氧类型，营养类型，硫颗粒沉积位置，细菌叶绿素类型，类胡萝卜素类型，水体分布位置。 紫硫细菌和绿硫细菌的分类主要依据于：细菌叶绿素，类胡萝卜素种类和光合结构；绿硫细菌中，含有水溶性的FMO蛋白,可以作为绿囊（光合结构）和反应中心之间能量传递的中介，该特殊的蛋白质是绿硫细菌区别于其它细菌的主要特征。另外，通过16SRNA测序也可以进行分类。 参考文献： [1]万云洋,赵国屏.原核微生物的硫功能菌[J].微生物学通报,2017,44(06):1471-1480 [2]赵江艳,傅英楠,赵春贵,杨素萍,曲音波,焦念志.一株高含玫红品的红树林海洋紫色硫细菌分离鉴定及特性[J].微生物学报,2011,51(10):1318-1325. [3] 郭伟,于仁成,亢振军,孔凡洲,周名江.绿硫细菌色素的高效液相色谱分析及其应用[J].海洋与湖 沼,2015,46(05):1001-1009. [4] 赵江艳. 红树林生境紫色硫细菌的分离鉴定、碳氮硫源物质利用与光合作用关系[D].华侨大学,2011. [5] Magdaong Nikki Cecil M,Niedzwiedzki Dariusz M,Saer Rafael G,Goodson Carrie,Blankenship Robert E. Excitation energy transfer kinetics and efficiency in phototrophic green sulfur bacteria.[J]. Biochimica et biophysica acta,2018. [6] Martin F. Hohmann-Marriott,Robert E. Blankenship. Variable fluorescence in green sulfur bacteria[J]. BBA -Bioenergetics,2006,1767(1). [7] 贾雅琼. 紫细菌光合色素的环境适应性调控及含奥氏酮菌株色素蛋白复合体分离条件初探[D].华侨大学,2014. [8] 崔小华. 嗜盐紫色硫细菌耐盐机制与光合色素研究[D].山西大学,2013. [9] Sandro Peduzzi,Mauro Tonolla,Dittmar Hahn. Isolation and characterization of aggregate-forming sulfate-reducing and purple sulfur bacteria from the chemocline of meromictic Lake Cadagno, Switzerland[J]. FEMS Microbiology Ecology,2003,45(1).
光合细菌 光合细菌概论 光合细菌（Photosynthetic bacteria，简称PSB）是广泛分布于水田、河川、海洋和土壤中的一大类细菌，为革兰氏阴性细菌。在厌气环境下可利用光能进行光合作用，以H2S和有机物作为供氢体，以CO2或有机物作为碳源。在不同的环境条件下，也可能有多样的异营功能（固氮、脱氮、固碳、氧化硫化物等），在自净过程中，有着不同的角色。 除了净化水质外，进一步的研究发现光合细菌对鱼、虾、蟹、贝类幼体具有促进生长，提高存活率的作用。这可能是因为光合细菌菌体富含营养物质，其蛋白质含量超过大豆，维生素B群种类与含量超过酵母，特别是维生素B12、叶酸和生物素等含量丰富。另外，重要生理活性物质的辅"酉每"Q在光合细菌中含量远超过其他生物。光合细菌应用在水产养殖上，主要在五个方面上 ?作为水质净化剂 ?作为饲料添加剂 ?用于水产动物幼体培育 ?作为动物性生物饵料的饵料 ?防治鱼病 光合细菌生物学
光合细菌是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物，光合细菌根据光合作用是否产氧，可分为不产氧光合细菌和产氧光合细菌；又可根据所利用碳源的不同，将其分为光能自养和光能异养型，前者是以硫化氢为光合作用供氢体的紫硫细菌和绿硫细菌，后者是以各种有机物为供氢体和主要碳源的紫色非硫细菌。目前根据光合细菌所具有的光合色素体系和光合作用中是否能以硫为电子供体将其划分为4个科： 1. Rhodospirillaceae（红螺菌科或称红色非硫菌科） 2. Chromatiaceae（红硫菌科） 3. Chlorobiaceae（绿硫菌科） 4. Chloroflexaceae（滑行丝状绿硫菌科） 绿硫细菌、红硫细菌（过去叫做紫硫细菌）和红螺细菌（过去叫做紫色非硫细菌）等，都是能够进行光合作用的细菌，大多数都不能够运动。这些细菌的菌体内含有类似于叶绿素的光合色素，这种光合色素叫做细菌叶绿素。有的光合细菌还含有大量的类胡萝卜素，而使菌体呈现出红色。 光合细菌中，目前生产的主要种类为红螺菌科的属、种，如荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomonas capsulatus）、球形红假单胞菌（Rps.globiformis）、沼泽红假单胞菌（Rps.palustris）、嗜硫红假单胞菌（Rps.sulfi-dophila）、深红红螺菌（Rhodospirillum. rubrum）、黄褐红螺菌（Rhodospirillum.fulvum）等。
病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可