药物性肝损伤的发病机制
2012-12-12 13:01 来源：中华肝脏病杂志 作者：李 子俊等
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2005年，Kaplowitz 曾就药物性肝损伤（druginducedliver injury，DILl）的机制提出了一个概念，即药物特异性损伤的“上游”事件和非特异性的“下游”事件。“上游”事件是指环境因素和遗传危险因素共同作用引起的初始肝细胞损伤；“下游”事件泛指发生在线粒体中的细胞损伤途径和细胞保护途径间的平衡。最近Russmann等又提出“DILI发病的三步机制”学说，即首先药物及其代谢产物直接引起细胞应激，并抑制细胞内线粒体功能或活化机体特异性的免疫反应；继而最初的细胞损伤引起线粒体通透性转变（mitochondrial permeability transition，MPT）；最后MPT引起了肝细胞的凋亡或坏死。但是由于建立DILI动物模型和临床收集大宗病例的困难，以及DILl发病个体间差异性较大，至此对于DILI的发病机制研究举步维艰。临床上将DILl分为肝细胞坏死型、胆汁淤积型和混合型3类，其中又以肝细胞坏死型和胆汁淤积型的发病机制迥异，遗传因素是近年来研究的热点。
一、DILI发生的遗传因素
DILI的发生除了受个体的性别、年龄、营养状态、肝脏基础疾病、联合用药及饮酒等因素影响外，其中与遗传因素的关系最为关键。临床上DILl多是指特异性药物性肝病，仅发生在某些人或人群（特异性体质），即与患者的遗传背景或基因多态性有关。近年来，由于人类基因组计划的完成，Hapmap计划的发布以及高通量基因分型平台的发展，全基因组关联分析（genome-wide ass02ialioll study，GWAS）能够得以实施。GWAS可以对较低风险疾病的常见遗传变异进行稳定、有效的鉴别。使过去对单纯高风险变异引起的单基因病的基因研究转为多个低风险变异与环境因素相互作用共同决定的复杂疾病风险登记研究成为可能。目前，第一个有关DILl的全基因研究结果显示，HLA基因突变是氟氯西林和希美加曲导致肝毒性的风险因素。
由于DILl的发病机制复杂，且发病率低；而GWAS对初发疾病进行基因分型研究往往需要1000~2000个病例。这与一般疾病研究可在多中心协助下就可完成不同，对于稀发的DILl难度较大。不过，尽管病例数有限，但研究结果显示GWAS对预测药物不良反应的易感性效应强大，即使是小样本患者资料，通过GWAS进行显著相关基因鉴定，比值比多在5以上。而先前的候选基因关联研究（candidate gone association studies，CWAS），是根据药物生物学或已知疾病的发病机制来选择“显著”的基因进行研究，且因选择的基因多态性方法过于简陋，对于可能的疾病易感的“非显著”基因很难检测到。所以，过
去报道的阳性关系基因如今可能并不可靠。至今发现的DILI的易感基因类包括HLA类，代谢酶类、细胞色素（eytochrome P，CYP）450酶、免疫反应调节因子、氧应激、肝胆道转运体等。
希美家曲是第一代凝血酶抑制剂，调查结果显示应用后15%的人会发生DILl。Kindmark等进行病例对照研究发现该药引起肝损伤与HLA-DRBl*070l等位基因密切相关。CYP450家族是药物I相代谢的最重要的酶类。一项单独由异烟肼引起DILI的前瞻性研究结果显示CYP2E野生型异烟肼药物治疗个体发病风险增加了3.4倍。原因可能是服用异烟肼后，由野生型CYP2E1介导产生的活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）浓度较高，间接造成肝脏严重的损伤。氟氯西林是一种β内酰胺酶抗生素。Daly等发现氟氯西林导致的胆汁淤积型DILl与HLA-B*5701基因显著相关，带有这类等位基因的人发生DILI的概率是其他人的80倍。
谷胱甘肽S-转移酶（ghtathione S-Wansferase，Gsa3是药物Ⅱ相代谢中重要酶类，能够催化谷胱甘肽对亲电子底物的-攻击，降低毒物的毒性反应，在抵抗内源性氧应激以及外源性毒物如致癌物、有毒化学物和药物中起重要的作用。Huang等报道在中国台湾人种中如果存在GSTMl纯合子的缺失，接受抗结核药物治疗后较容易发生DILI，而如果是GSTTl纯合子的缺失则不会发生DILI。Lucern等发现在白色人种中，如果存在GSTTl-GSTMl双重缺失，应用曲格列酮、阿莫西林克拉维酸复合制剂等多种药物引起DILI的风险是对照组的2。7倍。
另外，多重耐药相关蛋白（multidrug resistanceassociatedprotein，MRP）-2和MRP-3在胆汁淤积型DILI的发病过程中起作用。Stapelbroek等的研究结果显示，编码这两种蛋白的基因发生变异，不仅破坏胆汁的分泌，还加速原有肝病的进展。
依据目前药物基因组学研究结果显示，HLA等位基因变异是引起DILI的一个独立最重要的危险因素，氧应激和另外一些机制也发挥重要作用。相比较，药物代谢酶的基因多态性作用有限。不过，DILI的发生是一个极其复杂且多步骤的损伤过程，也是一种与多基因和多种危险因素相关的疾病。因此，研究在特异性DILI的发病机制中的遗传因素的作用，为将来进一步在特定人群中进行筛查、确定高危险的患者、指导临床用药或预测DILI的发生都有价值。
二、肝细胞坏死型DILI的发病机制
1、线粒体损伤：线粒体主要参与细胞内三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等多项重要的生理和生物化学过程。药物及其代谢产物的直接毒性和诱发免疫反应引起线粒体损伤是肝细胞坏死型DILI的重要发病机制，包括线粒体膜通透性增加或MPT，严重时导致线粒体膜破裂，引起细胞能量供应障碍，肝细
胞坏死或凋亡，严重时导致暴发性肝炎。药物损伤线粒体具体机制主要表现为以下7个方面：（1）线粒体膜通透性增加或破裂：对乙酰氨基酚是西方国家DILI发生和引起急性药物性肝衰竭的主要病因。通常情况下，对乙酰氨基酚主要在肝内与硫酸盐和葡萄糖苷酸结合，只有少量被CYP2E1酶降解为高毒性的代谢物N-乙酰-对-苯醌亚胺（N-acctylbenzoqtfinoncimide，NAPQI），NAPQI再与线粒体内还原型谷胱甘肽结合为氧化型谷胱甘肽并解毒。但若对乙酰氨基酚的服用量12~15g或以上，则产生大量NAPQI及不能完全与谷胱甘肽结合。剩余的NAPQI就会与细胞内相关蛋白结合，扰乱了细胞内Ca2+浓度的稳态，导致Ca2+内流增加及胞质内Ca2+水平升高，并诱发线粒体发生氧化反应。被氧化的谷胱甘肽和过氧化亚硝酸盐堆积在线粒体表面，引起线粒体包膜通透性增加和MPT，最后线粒体包膜破裂。（2）干扰线粒体三磷酸腺苷（ATP）合成：一些非甾体类抗炎药，如双氯芬酸和尼美舒利，进入线粒体内外膜酸性间隙层内能以非带电形式（R-COOH）存在，并很容易地穿过线粒体内膜到达碱性的线粒体基质中，解离成阴离子形式（R-COO-），形成线粒体内膜电势。后者又促使基质中的阴离子药物分子通过内膜上离子运输体回到内外膜间隙层内。如此循环往复的运输使质子在呼吸链中释放出电子流，既增加耗氧量又绕过了ATP的合成，结果破坏了线粒体供能，导致肝细胞死亡。（3）损伤线粒体β氧化和呼吸链功能：线粒体呼吸链功能和β氧化在供给细胞能量中十分重要。抗心律失常药物胺碘酮在溶质中具有亲水和疏水特性及亲脂和亲氨的功能。它进入线粒体内外膜间隙内被质子化后带有正电，随后顺着电势进入线粒体基质中。在线粒体基质中胺碘酮积聚浓度过高，线粒体的脂肪酸β氧化就会受到抑制并出现线粒体脂肪变性。另外，带正电的胺碘酮还可以阻碍呼吸链中电子转运，电子不能传送到呼吸链中，将与氧结合形成超氧阴离子基团或ROS。后者浓度增加可以引起细胞膜脂质过氧化及在其他细胞因子协同作用下引起肝细胞坏死，严重时发生周围组织炎症和肝纤维化。还有一些药物如丙戊酸钠、四环素类抑制β氧化可引起肝细胞脂肪变，减少糖原异生，生成游离脂肪酸和脂质过氧化产物，并进一步加重线粒体损伤。轻、中度线粒体损伤引起脂肪肝，重症者可导致肝衰竭或患者死亡。（4）减少线粒体蛋白质的合成：部分抗菌素在抑制细菌蛋白质合成的同时，也减少了线粒体内的蛋白质合成。如利奈唑胺、氯霉素、甲砜霉素和红霉素等。氯霉素可以结合到核糖体亚单位上，进而抑制细菌和细胞线粒体
内蛋白合成。线粒体的功能异常与氯霉素引起骨髓抑制有关。至于发生再生障碍性贫血或胆汁淤积性肝炎则可能与其代谢产物有关。（5）降解线粒体DNA：服用大剂量对乙酰氨基酚生成过量的NAPQI，消耗线粒体内谷胱甘肽和蛋白硫醇，结果会引起MPT和产生大量ROS，并诱导一氧化氮合成酶合成过氧亚硝酸盐。ROS和过氧亚硝酸盐可以降解线粒体DNA。饮酒或乙醇也可以促进线粒体内ROS形成并通过减少线粒体谷胱甘肽输入而降低线粒体ROS解毒的能力。动物实验结果显示，在多次饮酒后，乙醇通过增加NADH/NAD+比值抑制线粒体D氧化和三羧酸循环，以及增加类固醇调节元件及结合蛋白的表达，促进脂肪酸合成和发生脂肪性肝病。（6）减少线粒体转录物的的合成：干扰素能够激活RNA酶-L，并从两个方面减少线粒体转录物的的合成。首先，RNA酶一L能够切割线粒体转录因子A，后者能在线粒体基质中增强线粒体DNA的转录；其次，活化的RNA酶L能结合到线粒体翻译启动因子上，降解线粒体mRNA。因此，干扰素α既能够减少线粒体转录物的合成，又能够降低线粒体转录物的稳定性。（7）抑制ATP合成酶：雌激素及几种植物提取物质，如白藜芦醇、姜黄素（祛痰止咳作用）等，超过一定浓度可以抑制线粒体内ATP合成酶活力，导致细胞供能障碍。此外，几种天然毒素，如金轮霉素、黄绿亲给素、寡霉素和黑星菌霉素等都是ATP合成酶抑制剂，损伤细胞ATP合成和线粒体供能。
三、免疫损伤机制
1、先天性免疫：肝内存在的巨噬细胞、多形核白细胞包括中性粒细胞、嗜酸性和嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞和携带有T淋巴细胞受体的自然杀伤性T淋巴细胞构成肝脏非特异性免疫系统。当药物应激及肝细胞损伤后，可激活先天性免疫反应。其中自然杀伤性T淋巴细胞占肝脏淋巴细胞的一半左右，在白细胞介素12和白细胞介素18的辅助下，加剧对肝细胞损伤。肝细胞坏死后还可释放一种高移动组合蛋白盒-1物质，可以进一步活化枯否细胞，释放肿瘤坏死因子α、干扰素γ和白细胞介素4等细胞因子，诱导肝细胞炎症反应和组织损伤加重。最近有研究结果显示肝细胞线粒体内含有一种细菌样分子结构，如甲酰基肽类及非甲基化cpG基序。该类细菌样物质释放后与甲酰基受体-1和Toll受体-9结合，也激活先天性免疫反应。
先天性免疫也存在着个体差别。如CD44基因能编码淋巴细胞表面的细胞黏附分子，参与细胞一基质的相互作用。在两个临床独立的患者队列研究中发现，注射对乙酰氨基酚后，人类CD44基因多态性与血清的ALT水平显著相关。动物实验结果显示，若敲除小鼠的CD44基因，与野生型的
小鼠相比，前者则更容易发生由对乙酰氨基酚引起的DILI。
2、获得性免疫：在部分DILI患者中，临床发现常伴有药物过敏反应，如发热（31%）、皮疹（26%）、血和活检肝组织内嗜酸性粒细胞增多（7%）；药物诱导肝毒性反应，均有一定的潜伏期（1~4周）；若再次暴露于同一药物，可诱导肝毒性症状，并在血液内检测到特异性抗体浓度增加。至此，人们提出两种特异性免疫损伤理论，一种是半抗原理论，另一种是P-i理论。半抗原理论：即药物或者其代谢产物因分子量少，无免疫原性，但与肝蛋白质或修饰蛋白质如CYP酶类共价结合后，形成新的蛋白。药物复合物。后者在药物损伤肝细胞死亡后释放出来，在MHCⅡ类分子协助下经过抗原呈递细胞（APC细胞）刺激淋巴细胞，诱导抗体的产生和激活特异性免疫反应。药物一蛋白复合物诱导的抗原抗体反应主要通过两种机制损伤肝细胞，一种是补体介导的细胞溶解；另一种是抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用。属于这类损伤机制的药物有非甾体类固醇抗炎药双氯芬酸、麻醉吸入剂氟烷等。
不过，单独的半抗原可能不足以激活免疫反应，需同时伴随其他“危险”事件，如轻微的肝损伤或。者伴发的感染或炎症反应。如小剂量的脂多糖可使肝脏对一些安全性的药物发生DILl的敏感性增加。在艾滋病患者，由于存在感染或炎症反应，也被证明是发生DILI或其他药物不良反应发生的高危人群。
p-i理论：某些药物能模拟配体的作用，与T淋巴细胞受体结合并以MHC依赖型的经典模式使T淋巴细胞活化，如磺胺甲基异恶唑刺激并致敏T淋巴细胞，不需要生成代谢产物亚硝基磺胺甲基异恶唑修饰肝蛋白质诱导免疫反应。类似药物还有拉莫三嗪、卡马西平等。临床研究中已发现在一些药物引起肝脏或全身性免疫反应的患者血内，能检测到药物特异性T淋巴细胞或T淋巴细胞克隆。
尽管DILI的免疫损伤机制在临床及实验中不断得以证明，但精确的发病机制还未能明确。原因是肝脏也属于免疫器官范畴，多数抗原包括药物及其代谢产物刺激肝脏，往往引起的是免疫耐受状态，而不是致病性免疫损伤反应。目前推测其原因是抗原递呈细胞包括肝窦内皮细胞、枯否细胞和肝树突状细胞，呈递抗原于T淋巴细胞刺激无效。这也可以解释多数人为什么不会发生DILl。然而，也正是因为这种普遍存在的免疫耐受状态，致使缺乏有效的动物模型来探讨环境因素和遗传因素在引起DILl中的作用机制。
3、胆汁淤积型DILl：胆汁淤积型DILl是一种少见的DILl，与常见的肝细胞坏死型DILl在发病机制上相差甚远。主要特征为胆汁流动的障碍导致胆汁酸
在肝内淤积。由于胆汁酸具有细胞毒性，因此胆汁淤积可进一步加重肝细胞损伤和胆管细胞损伤，并引起急或慢性肝病，最后致胆汁淤积型肝纤维化和肝硬化。
大部分引起胆汁淤积的药物都是ATP结合盒超家族成员的反应底物。ATP结合盒存在于肝内胆管细胞上皮。ATP结合盒超家族成员与这些底物性的药物反应后就可以损伤肝内胆管上皮细胞。如环孢素、利福平和雌二醇等都是直接或者间接抑制胆盐输出泵蛋白功能而破坏胆汁的分泌。
此外，胆盐的去垢作用在胆汁淤积中进一步损伤胆管上皮细胞和肝细胞膜。蛋白同化激素因影响微粒体药酶的羟化作用，使胆汁酸合成过程中的羟化作用发生障碍，引起毛细胆管内胆汁淤积。雌激素和避孕药物则是通过改变肝细胞内胆固醇的代谢而造成胆汁淤积。有一些药物还可引起胆小管周围的肌动蛋白纤维的断裂，阻止其正常的搏动收缩，导致胆汁不能正常由小管系统流入胆管。最近有研究结果显示在患者的肝内存有一种促胆汁淤积的淋巴因子，提示免疫因素可能在药源性胆汁淤积的发病中起作用。