新基因克隆技术原理的概述
摘要：新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一，为能快速而准确地克隆目的基因, 本文综述了一些基因克隆常用技
术,包括功能性克隆，表型克隆，图位克隆，转座子标签
技术，电子克隆等；通过从技术原理、适应性及使用例证
等方面进行综述和评价，以便在实际研究中可以选用较为
可行的方案。
关键词：新基因克隆技术原理
从上世纪70年代, 由于以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、逆转录酶的发现和应用及外源性DNA转化感受态E. coli.实验成功为标志的基因工程的出现, 使人们可以在分子水平对目的基因进行克隆。根据“中心法则”遗传信息的流向,克隆新基因的途径主要分为正向遗传学途径和反向遗传学途径:前者主要通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行,而后者则是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。正向遗传学途径常见的方法如传统的功能克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)包括递减杂交(substractive hybridization)、差异显示PCR (DD-RT PCR)、代表性差示分析法(RDA)、抑制性扣除杂交(SSH) 等; 而反向遗传学途径则以图位克隆(map-based cloning)与转座子标签(transposon tagging )技术较为常见, 在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,上述两
种方法较为常用; 同时随着现代生物信息学的发展, 电子克隆(silicon cloning)出现, 更为研究者提供了方便、迅捷的方法。
1功能性克隆(functional cloning)
1.1纯化后克隆
若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时,可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法, 筛选阳性克隆获取其目的基因(1),除了免疫筛选方法外, 也可根据目的蛋白的生物学功能,利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得, 但纯度较高时, 可利用其中的一段氨基酸序列, 反推出其基因序列, 据此合成寡核苷酸用cDNA文库的筛选;或根据所获得的基因序列,指导5′端的引物合成,根据mRNA3′端poly-A 序列指导合成poly-T的3′端引物, 用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物物中合成相应cDNA, 将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。
1. 2同源性克隆
生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列,基于此原理,在其它种属同源基因被克隆的前提下, 构建cDNA文库或基因组文库,然后用已知分子高保守序列制备同源探针,经标记后从相应的文章中筛选阳性克隆,并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因,当然在没有全同源探针的情况下,可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。
2表型克隆( phonetypical cloning)
细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下(如癌变、异常增生),常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高,而另一些基因可能表达降低或缺失,以下方法用来发现分化表达差异性基因: 2. 1交互差减差异RNA显示( substractive hybridization) 由Lamar 和Palmer(2)在1984 年提出,作为较早运用研究差异性表达基因的手段, 其主要思路如下: 主要过程如下:
●交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A、B的mRNA ,
反转录为cDNA, 并构建cDNA文库。将这2个文库进行交互差减得到A减B和B减A的2个差减cDNA文库,由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构,载体进入宿主后,其上质粒载体被切下, 得质粒cDNA文库；
●差异显示。用3′锚定引物和5′随机引物对2个差减文库提取的
DNA 分别进行PCR扩增, 将扩增产物用5%序列胶电泳, 显示并分离差异条带,回收差异DNA,再次扩增后,获得富集的差异表达片段；
●表达分析。采用反向Northern分析和Northern分析鉴定经再次扩
增的差异DNA片段的真伪。反向Northern分析是将差异显示得到的扩增后DNA片段转膜,分别与来自A、B细胞系的总mRNA 经反转录制备的32P标记的cDNA第一条链探针进行杂交,只与亲本来源细胞系杂交,而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因；
●对差异片段克隆、测序, 并进一步分离获得差异表达的基因。
2. 2差异显示PCR( DD- RT PCR)
1992年由PengLiang和A. B. Pardee等( 3, 4)率先使用, 在核酸分子水平上显示了mRNA 表达水平的差异。其主要原理是:以某组织或细胞的全部RN A或mRNA为模板,利用以3′端PolyA 设计的锚定引物以及5′端任意引物进行逆转录反应和多聚酶链式反应(RT- PCR),PCR扩增产物可在Sequence胶上显示该组织或细胞中的mRNA 组成。被证实有差别表达的mRNA被回收, 并重新扩增, 扩增产物经克隆、测序后作为一个标记可被收入基因库并与基因库中的其他序列比较。该方法简便、灵敏, 它能够快速地显示细胞mRNA 的组成, 可对各样本mRNA的差异同时进行比较和展示,并可立即进行cDNA 测序、亚克隆、探针标记及文库筛选等工作; 其缺点是假阳性条带多、对低丰度表达基因不易检测、基因克隆受mRNA表达时效影响、其扩增出来的条带常在基因3′端的UTR区,所提供的信息比较少。2. 3代表性差示分析法( RDA )
由Lisit syn等1993年发明(5), 快速有效, 可特异放大分化差异基因片段, 达的基因, 具体过程个如下:
●制备扩增子。提取TS和RS的mRNA并反转录制备双链cDNA
即tester cDNA和driver cDNA。然后用限制性内切酶切,将酶切片段装上接头,末端补平后,加入接头引物进行PCR扩增；
●扣除杂交。去除接头后仅对tester片段加上新的接头,用过量的
driver cDNA与之杂交退火,将形成三种产物:tester/tester、tester/driver、driver /driver；
●特异性片段的扩增。末端补平后,加入新接头引物进行PCR。3种
产物中仅自身退火形成的tester/ tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增, tester/driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增, Driver/driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA分子, 再进行PCR富集特异表达cDNA片段；
●对特异片段进行克隆, 通过FISH等技术进一步分离特异表达基
因。
2. 4抑制性扣除杂交( SSH)
其依据的技术主要有两点( 7, 8):消减杂交和抑制性PCR,利用链内退火优于链间退火, 比链间退火更稳定, 从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似于“平底锅”的结构,无法与引物配对, 选择性地抑制了非目的基因片段的扩增; 同时根据复性动力学原理, 即浓度高的单链cDNA 在退火时产生同源杂交的速度要快于浓度低的单链cDNA, 从而使原来在浓度上有差别的单链cDNA 相对含量达到基本一致。其特点是: 速度快、效率高, 可同时分离几十或上百个差异表达的基因; 假阳性率低,其阳性率高达94%; 敏感程度较DD和RDA高,一些低丰度表达的cDNA可被检出; 并可以大量特异扩增那些代表了有差别表达的cDNA 片段,减少了实验结果的复杂性。
2. 5 扩增的片段长度多态性技术(AFLP,Amplified fragment length polymorphisms )
在1992年, 由Zabeau发明( 9, 10), 基本原理是基因组DNA双酶
切的限制性片段的选择性扩增, 主要程序是基因组DNA先用限制性内切酶切割,然后将所产生的限制性片段两侧分别连接一双DNA 接头,接头与基因组DNA 的酶切片段相连接作为引物结合位点, 据此设计一系列3′末端含数个选择性碱基PCR引物, 引物由核心序列(与人工接头互补) ,内切酶位点特异序列和选择性核苷酸序列3′部分组成,PCR 方法选择性扩增成套的限制性片段,可使目的序列扩增到0. 5～1g 后,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增的DNA片段。AFLP 技术作为一种功能强大的DNA指纹技术, 与BSA(分群分析法)结合, 可以找到与目的基因紧密连锁的分子标记, 以AFLP所产生的整个基因组的标记为起点,通过染色体步行或更新的技术,定位克隆某些重要基因。而cDNA-AFLP( AFLP 基础上的RNA 指纹)则常用于从基因家族中分离高度同源性的基因而无需知道基因的序列,以及真核基因亚种间的不同基因和基因表达的时空性。AFLP可靠、灵敏,设计的专用引物3′端延伸出的1～10 个不等的随要核苷酸碱基,研究者可以通过选用不同数量的碱基调节AFLP产物的条带特异性和数量,获得更多的基因组多态性信息。
2.6基因表达系列分析(Serial Analysis of GeneExpression,
SAGE) 技术〔11, 12〕
细胞或组织的RNA逆转录为cDNA, 分别使用锚酶及标签酶酶切,分离出每个cDNA上的标签( tag ) , 经连接成双标签(ditag) ,分析其组成, 去除变形体后,经PCR 扩增、酶切后, 串联ditag, 对照基因文库, 查出不同tag 代表的不同基因及可能的基因产物, 如果在文
库中无匹配的序列,就有可能发现了新的基因;同时还可利用SAGE tag 的丰度确定基因表达丰度(13)。但是由于SAGE 技术所得到的标签信息量少,对未搜索到的匹配序列的标签鉴定存在困难, 因此该技术主要局限于GeneBank、EST 数据丰富的生物,如人类、小鼠、大鼠等。
2. 7cDNA 微阵列或芯片(DNA microarray or chip)技术
近年发展起来的又一新的分子生物学研究技术,其实验包括6个步骤:
●将cDNA克隆加工为可供点印的材料;
●将cDNA克隆(或寡核苷酸) 点印到载体上;
●样品RNA 的分离(总RNA 或mRNA ) ;
●探针的制备(例如cDNA的合成和标记) ;
●标记的探针DNA与载体上的DNA杂交;
●杂交结果的成像和图象分析。
主要应用于:基因表达水平的检测(14);通过比较组织细胞基因的表达谱差异,可以发现新的可能致病基因或疾病相关基因(15); 可进行基因点突变、多态性检测及染色体结构研究(16)。其最为主要的优点是: 可自动、高效、同时检测目的材料中大量基因的表达情况; 并几乎可用于所有核酸杂交技术的领域。
3图位克隆( map- based cloning )
上世纪90年代初期图位克隆应运而生, 成功的完成了诸如人NPCI 等基因(17)的克隆, 其大致原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座,在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位
的基础上, 用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN文库(如YAC、BAC或Cosmid文库) ,构建出目的基因区域的物理图谱, 再通过染色体步行(chromo some walking) 逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chromosome landing)的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。定位克隆理论上适用于一切基因, 但也存在应用上的一些不足:构建叠跨克隆群可能存在着困难;精细作图成本很高;定位克隆不能提供基因功能的相关信息,需借助其他手段。
4转座子标签( transposon tagging) 技术(18)
这是染色体上一段可以移动的DNA序列,它可以从一个基因座位转移到另一个基因座位,当转座子插入到某个功能基因内部或邻近位点时,就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型, 通过遗传分析可以确定某基因的突变是否由转座子引起,由转座子引起的突变可用转座子DNA为探针,从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA片段, 获得含有部分突变株DNA 序列的克隆, 然后以该DNA 序列为探针,筛选野生型植株的基因组文库,最终得到完整的目的基因。该技术主要用于植物基因的克隆(19),由于可供利用的转座子的种类太少,而转座子在不同的植物中转座的频率和活性相差很大,并且需要筛选大量的个体来鉴定转座子突变个体,限制了转座子标签法的应用范围。
5 电子克隆(silicon cloning)
早在1991年, M. D. Adams(20)首先运用表达序列标记(Expressed sequence Tag , EST)以发现新基因,随着基因组计划的进展及EST 数据库的迅速扩展,在克隆基因的全长cDNA 序列以前,很有必要首先采用生物信息学的方法进行“电子”cDNA文库筛选(21 , 22) ,以指导下一步的实验策略。对于已纯化的目的蛋白,首先可以经测定N -端相应的氨基酸序列,从氨基酸序列出发(23), 证实dbEST中是否存在与待查询项完全相同或相似的ESTs,当查询到某一EST后,以该EST所在克隆的克隆编号作为查询项, 以期获取对应于该EST的cDNA克隆的另一端的EST信息, 为了进行电子cDNA库筛选, 可以把通过以上方法获得的EST序列作为查询项通过BLAST N 软件对dbEST进行搜寻,寻找EST重叠群,进而通过计算机程序获得基因的部分乃至全长cDNA 序列并通过电子PCR 的方法对其进行了染色体定位,而且可通过IMAGE 协议索取相应的免费克隆,避免或减轻筛选全长基因的麻烦, 以集中精力进行基因的功能研究。
6 前景展望
基因克隆的技术发展很快,种类也越来越多,但每一种方法都有它的优势和劣势及适用范围和限制因素。综合来看, 不同的克隆策略, 虽主导思路不同,但常常是相互联系相互补充的, 有些过程也是共通的,因而实验者必须根据所克隆基因的类型和实际条件选择最佳的方案。随着各种知识的积累,克隆基因的技术也逐步完善,速度效率也不断提高,相信人类终将掌握大规模、快捷、经济基因克隆的技术,并很
快将基因的研究安全地应用到实践中去。
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（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 姓名：刘会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α(pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ100 mL NaOH 0.2 mol/L
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
新基因克隆技术原理的概述 摘要：新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一，为能快速而准确地克隆目的基因, 本文综述了一些基因克隆常用技 术,包括功能性克隆，表型克隆，图位克隆，转座子标签 技术，电子克隆等；通过从技术原理、适应性及使用例证 等方面进行综述和评价，以便在实际研究中可以选用较为 可行的方案。 关键词：新基因克隆技术原理 从上世纪70年代, 由于以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、逆转录酶的发现和应用及外源性DNA转化感受态E. coli.实验成功为标志的基因工程的出现, 使人们可以在分子水平对目的基因进行克隆。根据“中心法则”遗传信息的流向,克隆新基因的途径主要分为正向遗传学途径和反向遗传学途径:前者主要通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行,而后者则是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。正向遗传学途径常见的方法如传统的功能克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)包括递减杂交(substractive hybridization)、差异显示PCR (DD-RT PCR)、代表性差示分析法(RDA)、抑制性扣除杂交(SSH) 等; 而反向遗传学途径则以图位克隆(map-based cloning)与转座子标签(transposon tagging )技术较为常见, 在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,上述两
种方法较为常用; 同时随着现代生物信息学的发展, 电子克隆(silicon cloning)出现, 更为研究者提供了方便、迅捷的方法。 1功能性克隆(functional cloning) 1.1纯化后克隆 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时,可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法, 筛选阳性克隆获取其目的基因(1),除了免疫筛选方法外, 也可根据目的蛋白的生物学功能,利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得, 但纯度较高时, 可利用其中的一段氨基酸序列, 反推出其基因序列, 据此合成寡核苷酸用cDNA文库的筛选;或根据所获得的基因序列,指导5′端的引物合成,根据mRNA3′端poly-A 序列指导合成poly-T的3′端引物, 用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物物中合成相应cDNA, 将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。 1. 2同源性克隆 生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列,基于此原理,在其它种属同源基因被克隆的前提下, 构建cDNA文库或基因组文库,然后用已知分子高保守序列制备同源探针,经标记后从相应的文章中筛选阳性克隆,并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因,当然在没有全同源探针的情况下,可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。 2表型克隆( phonetypical cloning)
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为： 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
全长基因的克隆 王闵霞 马欣荣 代富英 谭 红 (中国科学院成都生物研究所,成都610041) 摘 要:新基因全长cDNA序列、全长DNA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。本文就克隆全长基因的各种技术如文库筛选法、各种PCR技术及新发展起来的电子克隆法等方法作一简单综述。 关键词:全长基因 克隆 文库筛选法 PCR 电子克隆 The Cloning of Entire G ene WANG Minxia MA Xinrong DAI Fuying TAN H ong (Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu610041) Abstract:To obtai n the enti re DN A or cDN A sequence of a new gene is a problem f or researchers.The article described the techniques that are used to clone the enti re gene,f or ex am ple:screeni ng li2 braries,a great variety of PCR techniques and new developed silico cloni ng. K ey w ords:enti re gene,cloni ng,screeni ng libraries,PCR techniques,silico cloni ng 研究一个基因的结构、功能及其表达产物的特性,完整的基因信息是必需的,但是新基因全长cD2 NA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用,对基因进行克隆的技术在原有的基础上也有了许多新的发展,例如差别显示杂交、抑制性差减杂交、RAP2PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cD2 NA直接捕捉法等。本文就克隆全长基因的各种技术作一简单介绍。 1 文库筛选法 文库筛选法是克隆基因最经典的方法,至今仍广泛应用。构建文库主要有两种类型:基因组文库和cDNA文库。 1.1 从DNA入手,建立基因组文库 作为遗传学科研究的重要内容,基因组文库的概念早在七十年代就已提出,Maniatis于1978年设计了随机片段克隆的方案。选择含有目的基因的基因组DNA,应用物理或酶学方法打断,再选择合适的载体与DNA片段连接,然后转化至受体细胞,培养得到基因组文库。然后选择合适的方法,如Southern杂交筛选法、HDR(高密度影印膜)杂交筛选或者PCR法等,对基因组文库进行筛选、测序。Shuichi等使用的两步PCR鉴定技术可在一天内找到所需的克隆。王瑛等以λ噬菌体EMBL23为基因载体,构建大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)的基因组文库,并从中分离出了全长3361bp的生长激素(cs2 GH)基因的克隆[1]。 然而有时候筛选的结果得到的仅仅是基因片段,这时有必要进行染色体步行以得到基因片段旁边的序列。染色体步行(Chromosome Walking)是指由基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的 制备 (作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ ) 作者：史群芳杨世蕊，雷陈，孟祥勋，黄超群，王明华 【摘要】目的：PCR扩增得到新基因ZNFD( Znf doma in con tai ning protein )，构建pET32a-ZNFD原核表达载体，诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法：通过PCR的方法克隆新基因ZNFD，选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列，克隆到原核表达载体pET32a 上，利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果：经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD，在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达，得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔，制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论：得到纯化的ZNFD蛋白，制备的多克隆抗体达到了一定的效价，且具有高特异性，为进一步研究ZNFD的功能
奠定了实验基础。 【关键词】ZNFD基因；锌指；原核表达；免疫抗原；多克隆抗体； 聚合酶链反应 [Abstract] Objective : To clo ne ZNFD ge ne by PCR , con struct expressi on vector ZNFD-pET32a, prepare and obta in its polycl onal antibody. Methods : The ORF fragment of ZNFD was amplified by PCR and seque need. Part of ORF was cloned in to pET32a prokaryotic expressing vector to form pET32a-ZNFD plasmid. His-ZNFD was expressed in E. coli Rosetta-gami(DE3) in duced by IPTG and purified by using affinity chromatography. Purified His-ZNFD was used to immunize rabbits to prepare polyclonal antibody. Rabbit serum specificity and its titer were detected by double diffusi on and Wester n blot. Results : The ZNFD gene was cloned and seque need , and the n pET32a-ZNFD was con structed successfully. His-ZNFD protein, 45 kD molecular weight, can be expressed in E. coli Rosetta-gami(DE3) with high efficiency. Its corresp onding an tibody was obta ined by immunizing rabbit with the purified protein. The data of double diffusion and Western blot dem on strated that the purified an tige n had high an tige ni city. Conclusions : ZNFD gene was cloned and the purified fusion protein ZNFD was obtained, it had high antigenicity. Polyclonal antibody was prepared, which provided reliable tools for the future
中国科学: 生命科学 2011年 第41卷 第9期: 722 ~ 729 SCIENTIA SINICA Vitae https://www.doczj.com/doc/655489928.html, https://www.doczj.com/doc/655489928.html, 英文引用格式: Huang Y, Tao Y, Zhang W L, et al. A new method for DNA molecular cloning. SCIENTIA SINICA Vitae, 2011, 41: 722–729, doi: 10.1360/052011-309 《中国科学》杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 论 文 一种新的DNA 分子克隆方法 黄媛, 陶颖, 张文露, 黄爱龙, 胡接力* 重庆医科大学, 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室, 重庆 400016 * 联系人, E-mail: hujieli1977@https://www.doczj.com/doc/655489928.html, 收稿日期: 2011-05-13; 接受日期: 2011-08-25 国家自然科学基金(批准号: 81000732)资助项目 doi: 10.1360/052011-309 摘要 DNA 分子克隆是基本的分子生物学实验技术, 传统的分子克隆方法大多需经过酶切链接过程, 但在某些情况下, 没有合适的酶切位点往往会成为阻碍克隆进行的障碍. 本文描述了一种新的分子克隆方法, 称为不依赖酶切和链接的分子克隆(RLIC). 利用RLIC, 将3种不同大小的DNA 片段克隆到3种不同载体, 证明了这种方法的有效性和可靠性. 由于该方法不受限制性酶切序列限制, 省去了酶切连接步骤, 因此具有很大的灵活性和简便性, 在分子生物学研究方面有广泛应用前景. 关键词 DNA 分子克隆 方法 DNA 分子克隆是指将一段目的DNA 分子片段与特定载体DNA 分子连接, 形成重组DNA 分子. DNA 分子克隆是基本的分子生物学实验技术, 广泛用于生物学、医学等各个领域. 传统的DNA 分子克隆方法主要包含以下步骤: 目标DNA 分子制备、目标分子与载体酶切、连接、转化及筛选. 从分子克隆技术建立之初起, 针对传统DNA 分子克隆方法的改进就一直在进行, 其中很多技术改进已转化为商品化克隆试剂盒, 如T-A Cloning [1], TOPO Cloning, Gateway [2,3]技术等. 这些新技术在不同程度上简化了克隆过程, 提高了克隆效率, 也能满足大部分研究需求. 但是对于一些问题, 传统克隆方法和新技术仍不能很好地解决. 例如, 可能希望在已克隆了一个基因(以gene 1指代)的真核表达载体上再克隆另一个基因(如检测标记EGFP 或筛选抗性标记等, 以gene 2指代), 且gene 2需使用独立启动子来单独表达而非融合表达. 此时, 不能再选择该载体的多克隆位点来克隆gene 2. 因为, 第一, 可能已经没 有合适的酶切位点; 第二, 即使有合适的酶切位点, 在该部位插入gene 2将扰乱gene 1的表达. 理想的情况是, 在第一个基因表达框架之外(如polyA 序列下游)的载体骨架上, 找到合适的酶切位点, 插入gene 2表达片段(包括启动子、基因及转录终止信号). 然而, 在大多数商业化载体中, 往往很难找到合适的位点来进行这类操作. 如果有一种克隆方法, 可以不受插入部位的序列限制, 即不用限制性切割, 便可以解决上述问题. Aslanidis 和de Jong [4]建立过一种非连接依赖性克隆方法(ligation-independent cloning of PCR products, LIC-PCR), 基本原理是: 在PCR 片段末端及PCR 扩增的线性载体末端分别加上12 bp 核苷酸, 利用T4 DNA 聚合酶的外切活性, 产生末端为单链的上述两种分子, 由于这两种分子末端互补, 退火后转化可得到重组分子. Rashtchian 等人[5]将此方法进行了改进, 使末端12 bp 核苷酸含dUMP, 从而可以用尿嘧啶DNA 糖基化酶(UDG)进行特异切割, 便于产生单链
1总RNA提取 (1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1mlTrizol加到离心管中待用 (2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷 (3) 加200 μL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层； (4) 4o C，12,000g，离心15 min； (5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min； (6) 4o C，12,000g，离心10 min； (7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗 (8) 4o C，7,500g，离心5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。 此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（μg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成 纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 1μg 5×gDNA Eraser Buffer 2μL gDNA Eraser 1μL RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42o C，2min； RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为： 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL 上一步的反应液10μL RNase Free dH2O 补齐至20μL 操作条件为： (1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。 3 PCR 按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，，PCR反应体系如下： Premix Taq25μL 模板5μL 引物1 (10 μM) 1μL 引物2 (10 μM) 1μL ddH2O 18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。 PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。