一、感受态细胞XL-1转化实验
（1）5ng DNA+100μl感受态细胞XL-1于1.5ml离心管中,混匀，冰浴30min。
（2）42o C, 45s。
（3）冰浴2min。
（4）涂布于固体LB平板上(含50mg/ml 氨苄青霉素, 37 o C预热)。
（5）放入37 o C恒温孵育箱，待液体吸收完全后，倒置孵育16-18h。（6）保鲜袋密封后，倒置放于4o C冰箱保存。
二、菌液的培养与质粒的提取
1.每个样本挑取5个细菌，进行摇菌，提取质粒。（一个细菌一支管）
在50ml离心管里加入5ml液体LB和5μl 50mg/ml氨苄青霉素，用200μl枪头挑取过夜培养LB平板上的单克隆，枪头打入离心管中，置于37o C摇床，250r/min培养16～18h，质粒提取。（老师，这里要先挑取一个细菌进行摇菌后再分成五支离心管重新摇菌，还是直接挑取5个菌落直接摇菌）
质粒提取(采用天根质粒小量多次提取试剂盒提取，步骤如下)：
（1）吸附柱中加入500μl平衡液BL，13000rpm离心1min。倒掉收集管中废液，吸附柱放回收集管，备用。
（2）收集5ml菌液，13000rpm/min, 离心10min，收集沉淀。
（3）加入500μl溶液P1(含RNase A), 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（4）加入500μl溶液P2, 温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解。
（5）加入700μl溶液P3, 立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色沉淀。
（6）13000rpm/min离心10min，收集上清分次加入过滤柱中
(800μl/次)。
（7）13000rpm离心2min后将上一步得到的滤液分次加入吸附柱中(800μl)。
（8）13000rpm离心1min，弃掉滤液。
（9）加入500μl去蛋白液PD, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。（10）加入600μl漂洗液PW, 静置5min, 13000rpm/min离心1min后弃滤液。
（11）重复步骤10。
（12）13000rpm/min离心2min，彻底去除柱子中残留废液。
（13）将DNA吸附柱放入新的离心管，悬空滴加100μl无菌双蒸水，静置5min。13000rpm/min离心1min，所得到的液体即为高纯度的DNA
溶液，置于-20o C保存。
七．定点突变的鉴定
质粒提取后用限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.1.6亚克隆
对成功突变的突变体和质粒载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒步骤回收载体和目的片段，用T4连接酶进行目的片段和表达载体的连接，产物转化细菌感受态细胞，挑取阳性克隆，按照质粒试剂盒说明书提取质粒，用限制性内切酶进行酶切鉴定，送质粒进行测序鉴定。
无菌技术操作原则 概念：无菌技术是指在执行医疗护理操作的过程中，防止一切医微生物侵入机体和保持无菌物 品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 1.无菌技术：指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌 物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 2.无菌物品：经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品 3.无菌区域：经过灭菌处理而未被污染的区域 4.非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌物品或区域。2操作原则 1.环境清洁 进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，减少人员走动，以降低室内空气中的尘埃。防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次，时间20~30分钟即可，也可适当延长消毒时间。 2.无菌操作 衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。必要时穿好无菌衣，带好无菌手套。 3.物品管理 无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4.无菌物品 无菌物品必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，有效期一周为宜，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7天，过期应重新灭菌。无菌物品一经使用或过期，潮湿应重新进行灭菌处理。 5.取无菌物 操作者身距无菌区20cm，取无菌物品时须用无菌持物钳（镊），不可触及无菌物品或跨越无菌区域，手臂应保持在腰部以上。无菌物品取出后，不可过久暴露，若未使用，也不可放回无菌包或无菌容器内。疑有污染，不得使用。未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6.无菌操作 如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 一物一人，一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。
菌种保存大家谈。甘油的浓度。 2009-08-15 01:13 大家好！ 我是保藏中心，最近发现基因酷保藏中心的共享菌株的保存出现了较严重的问题，06年07年酷友共享的菌株很多都活化不了，好些酷友想要，保藏中心却不能应助，对此我们很抱歉！ 因此，在此向大家赐教，菌株应如何保存呢？ 望大家能分享经验，多提出建议（保藏中心如何保藏菌株和管理菌株为佳），一起努力搭建好这个平台，让它能帮到更多酷友！ 作者: 保藏中心时间: 09-2-19 10:55 有人说，冷冻干燥保藏法是菌种保藏最有效的方法之一。因为没有做过，所以请教做过这方面的酷友，大肠杆菌的冷冻保藏应该注意的事项? 甘油冷冻保藏及穿刺菌的保藏一般能保藏多久呢？ 作者: 我是好人时间: 09-2-19 21:34 冷冻干燥法是国内外一致认为比较理想的菌种保藏方法。冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。 由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。不适合酷友频繁的求助菌种。我们实验室保藏菌种，不管是细菌，放线菌还是霉菌和酵母，我们都是用的甘油管保藏。就是划斜面得到单菌落，将单菌落置于液体培养基培养至对数期，在EP管中保存，菌液与甘油体积比为1：1，甘油要灭菌的。-20摄氏度保存即可。我们的菌种有保存七八年的依然能用。方便快捷。管理员不妨试试。 作者: 保藏中心时间: 09-2-20 23:03 :'终于有酷友理我了！感动ing 十分感谢您的指教！为了表达谢意，加两点威望
无菌技术操作规程 一、无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，必须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗是每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7 天，过期应重新灭菌。 4、工作人员面向无菌区域，用无菌取无菌物品，手臂须保持在腰部水平以上，不可触及无菌物或跨越无菌区，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 5 进行无菌操作时不可面对无菌区讲话、打喷嚏。怀疑无菌物品被污染，不可使用。 6 进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用可，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病人用，以免发生交叉感染
二、准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。 3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒液溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75％酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套好。 5 用物排放有序，符合无菌操作要求。 三、操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2 无菌持物钳使用法： 无菌持物钳须置于无菌容器内，有效期限 4 小时；取、放无菌持物钳时，应将盖打开，钳端闭合，不可在盖孔中取、放；如需取远处物品时，应连同容器一起搬移，就地取出无菌物品。 3、无菌包使用法： 1）、查看无菌包的名称、灭菌日期，查看化学指示胶带粘贴。 2）、将无菌包放在清洁、干燥处，撕开粘贴。 3）、用拇指和食指先揭开左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内
益生菌——有益的活性微生物 益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产 品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。 一、目录 1. 适合人群 2.益生菌分类 3. 起源 4. 好坏辨别 5 .分类 6. 安全性 7. 过敏 8. 立法 9 .如何选择 10 .作用功效 11. 适合人群 12. 注意事项 13 .政府规定 14. 科学饮用 15 .区别：益生元、益生菌 16. 组合应用 17 .区别：主要区别、注意事项、作用原理 18 .代表食品 19. 益生菌制剂 20. 最新分析 二、益生菌分类 迄今为止，科学家已发现的益生菌大体上可分成三大类，其中包括： ①乳杆菌类（如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌等）； ②双歧杆菌类（如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等）； ③革兰氏阳性球菌（如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等）。 此外，还有一些酵母菌与酶亦可归入益生菌的范畴。 当人体住满足够的益生菌时，人就会处于健康的状态，但是一旦体内菌群失去平衡，比如菌种间比例发生大幅变化或者超出正常数值时，那么腹泻、过敏、胃口不佳、疲倦、免疫力低等一系列病症就会随之而来，人体的健康就会亮红灯，而这时适当添加复合菌发酵饮品，协助体内菌群平衡，才能让人重现健康状态。 宝宝由于自身免疫系统发育尚未成熟，母传抗体在出生后逐渐消失，在出生后最初六年都处于易感期，这段时间很多宝宝都会出现胃肠功能、免疫功能不完善，机体抵抗力较弱，消化功能紊乱，肠吸收不良及感染性疾病等，这些小状态不但阻碍了宝宝体格的生长和发育，对宝宝智力认知的发育、情感社交能力的发育都带来不同程度的影响，对于治疗性的化学药物，妈妈们势必会担心对宝宝带来的伤害，而益生菌，这种以菌制菌的独特天然生态疗法，通过维持肠道菌丛平衡，保持益生菌优势地位。改善宝宝免疫力、促进肠胃消化吸收，预防各种疾病，守护每个宝宝健康均衡成长。 三、益生菌的作用 1）人体作用 国外一些学者认为，其作用可以概括为： ①预防或改善腹泻：饮食习惯不良或服用抗生素均会打破肠道菌群平衡，从而导致腹泻。补充益生菌有助于平衡肠道菌群及恢复正常的肠道pH值，缓解腹泻症状。 ②缓解不耐乳糖症状：乳杆菌可帮助人体分解乳糖，缓解腹泻、胀气等不适症状，可与牛奶同食。
无菌技术的原则和注意事项-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
无菌技术操作原则 概念：无菌技术是指在执行医疗护理操作的过程中，防止一切医微生物侵入机体和保持无菌 物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 1.无菌技术：指在执行医疗、护理技术过程中，防止一切微生物侵入机体 和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。 2.无菌物品：经过物理或化学方法灭菌后，未被污染的物品 3.无菌区域：经过灭菌处理而未被污染的区域 4.非无菌物品或区域未经灭菌或经灭菌后被污染的物品或区域，称非无菌 物品或区域。 2操作原则 1.环境清洁 进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，减少人员走动，以降低室内空气中的尘埃。防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次，时间20~30分钟即可，也可适当延长消毒时间。 2.无菌操作 衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。必要时穿好无菌衣，带好无菌手套。 3.物品管理 无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4.无菌物品 无菌物品必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，有效期一周为宜，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7天，过期应重新灭菌。无菌物品一经使用或过期，潮湿应重新进行灭菌处理。 5.取无菌物 操作者身距无菌区20cm，取无菌物品时须用无菌持物钳（镊），不可触及无菌物品或跨越无菌区域，手臂应保持在腰部以上。无菌物品取出后，不可过久暴露，若未使用，也不可放回无菌包或无菌容器内。疑有污染，不得使用。 未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6.无菌操作 如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 一物一人，一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。
农杆菌感受态细胞制备 第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。 注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。 第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。 注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。 第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。 注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。 摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。 4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。 6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。 7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。 注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。 8) 4℃，5000rpm 离心5min 。 9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。 10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。 注意：要用1ml 枪轻轻抽打。 11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
护士岗位技能训练和竞赛活动护理技术项目考核要点 目录 一、手卫生 (4) 二、无菌技术 (6) 三、生命体征监测技术 (10) 四、口腔护理技术 (15) 五、鼻饲技术 (16) 六、导尿技术及护理 (17) 七、胃肠减压技术 (19) 八、灌肠技术 (21) 九、氧气吸入技术 (22) 十、换药技术 (23) 十一、雾化吸入疗法 (25) 十二、血糖监测 (26) 十三、口服给药法 (27) 十四、密闭式输液技术 (28) 十五、密闭式静脉输血技术 (29) 十六、静脉留置针技术 (31) 十七、静脉采血技术 (32) 十八、静脉注射法 (33) 十九、经外周插管的中心静脉导管（PICC）护理技术 (35) 二十、动脉血标本的采集技术 (38) 二十一、肌内注射技术 (40) 二十二、皮内注射技术 (41) 二十三、皮下注射技术 (42) 二十四、物理降温法 (43) 二十五、心肺复苏基本生命支持术 (45) 二十六、经鼻/口腔吸痰法 (47) 二十七、经气管插管/气管切开吸痰法 (49) 二十八、心电监测技术 (51) 二十九、血氧饱和度监测技术 (52) 三十、输液泵／微量输注泵的使用技术 (53) 三十一、除颤技术 (55) 三十二、轴线翻身法 (56) 三十三、患者搬运法 (57) 三十四、患者约束法 (61) 三十五、痰标本采集法 (63) 三十六、咽拭子标本采集法 (64) 三十七、洗胃技术 (65) 三十八、"T"管引流护理 (67) 三十九、造口护理技术 (68) 四十、膀胱冲洗的护理 (70) 四十一、脑室引流的护理 (72) 四十二、胸腔闭式引流的护理 (73)
1目的 菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。规范菌种原始菌液的制备及长期保存。 2内容 2.1定义 原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。 工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。 2.2 总则 微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。 经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2 ～8℃）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。 生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。 原始菌种的传代次数最多传至第五代。 2.3 培养基 2.4 冻干菌制备原始菌液 2.4.1 由甘油冷冻菌制备原始菌液 2.4.1.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。 2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化； 2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中； 2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间； 2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。 2.4.2 由集菌平板制备原始菌液 2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h（或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml，无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。不同培养基适用于不同菌种。 2.4.2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。 2.4.2.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。
无菌技术 目的： 是保持无菌物品不被污染；防止一切微生物侵入或传播；预防医院感染的发生 无菌技术操作原则： 1.环境清洁宽敞并定期消毒，操作前半小时需停止清扫工作，减少走动，避免尘埃飞扬 2.工作人员着装符合无菌操作要求，无菌操作前操作者应衣帽整洁，修剪指甲并洗手，戴口 罩，口罩须盖住口鼻，最好用一次性口罩，一般情况下口罩应每4～8小时更换，一经潮湿细菌易于穿透，应及时更换 3.物品放置有序，标志明显，无菌物品是经过物理或化学方法灭菌后未被污染的物品，无菌 物品必须与非无菌物品分开放置且有明显标志，无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌容器中，无菌包外需标明物品名称，灭菌日期按失效期先后顺序摆放。无菌包有效期为7～14天，取用无菌物品时应使用无菌持物钳，无菌物品一经取出，虽未使用也不得放回无菌容器内。物品已有或已被污染即不可使用，应予更换并重新灭菌。明确无菌区与非无菌区 4.无菌区是经过物理或化学方法灭菌处理而未被污染的区域；非无菌区是未经灭菌处理或经 灭菌处理后被污染的区域。操作者的身体应与无菌区保持一定距离，取放无菌物品时，应面向无菌区，手臂应保持在腰部或操作台面以上，不可跨越无菌区，手不可接触无菌物品，避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏，未经消毒的物品不可触及无菌物品或跨越无菌区域5.一套无菌物品只供一位患者使用，以防交叉感染 无菌持物钳的使用操作中的注意事项： 1.无菌持物钳只能用于夹取无菌物品，不能用于夹取油纱布或换药 2.使用无菌持物钳时，钳端不可高举，手不可触及无菌持物钳的浸泡部分，无菌持物钳使用 后，应立即放回容器内，不得在空气中暴露过久 3.如到远处夹取物品应将持物钳放入容器内，一同搬移 4.无菌持物钳一经污染或已有污染时不得再放回容器内，应重新消毒 5.无菌持物钳和存放容器要定期消毒 无菌容器的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则：打开包布时手只能接触包布四角的外面，不可触及包布内面，不 可跨越无菌面 2.包内物品未用完应按原折痕包好，注明开包日期及时间，限24小时内使用 3.如包布内物品超过有效期，被污染或包布受潮，则需重新灭菌 无菌溶液的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则，不可跨越无菌区 2.不能将无菌物品或非无菌物品伸入瓶内蘸取溶液或直接接触 3.已倒出的溶液虽未使用也不得倒回瓶内 铺无菌盘的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则，非无菌物品及身体应与无菌盘保持适当的距离，身体部位不可跨 越无菌区 2.无菌盘应保持干燥，避免潮湿污染 3.已铺好的无菌盘应尽早使用，有效期不超过4小时 无菌手套的使用操作中的注意事项： 1.严格遵循无菌操作原则 2.注意修剪指甲以防刺破手套，选择合适手掌大小的手套 3.未带手套的手不可触及无菌手套的外面，已戴手套的手不可触及未戴手套的手及手套的内 面。戴手套后如发现手套破损或不慎污染，应立即更换。戴手套后手臂不可下垂，应保持在腰部或操作台面以上视线范围内活动 4.脱手套时应翻转脱下
一、甘油菌活化 1.LB培养基制备： 胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl10g 加去离子水至800mL搅拌，使溶质完全溶解，用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节PH至7.4，加入去离子水至1000ml，高压蒸汽灭菌20min。 ●灭菌后注意密封，4℃能存放1个月。 ●含琼脂的LB培养基： 上述液体培养基高压灭菌前加入15g/L（铺制平板用）或7g/L（配制顶层琼脂糖用）琼脂糖，高压灭菌20min。 2.倒平板 2.1 超净台，接种环，灭菌培养皿，酒精灯等紫外灭菌30min。 2.2 培养基高压后放在60℃水浴锅中保温。溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂或琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中。小心培养基过热，旋动液体产生暴沸。 2.3 冷却至50℃，在超净台中加入抗生素等不耐热的物质（现用现加），为避免产生气泡，混匀培养基时应采用旋动的方式，然后直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。 2.4 从冰箱中取出甘油菌冻存管放在冰上，不要等到融化（反复冻溶不利于长期保存），直接用（枪头）接种环在冻存管内的冰碴上蘸一下，然后马上涂平板即可。 37℃培养12-16h。第二天挑单克隆大量培养。 3.大量培养 3.1 冷藏的液态培养基重新高温高压湿热灭菌，待冷却至50℃左右加入抗生素。 3.2 在无菌操作台中将菌落挑至已加抗生素的液态培养基中（2-5mL），37℃，200rpm培养8h。 3.3 按1:500至1:1000的比例，用加抗生素的液态LB培养基稀释3.2所得菌液。
（25-50uL菌液+25mL液态含抗生素LB培养基）。37℃，200rpm培养12-16小时。 ●使密度达到3-4 10^9/mL。 ●OD600在0.5左右。（在可见分光光度计600nm处测菌液的光密度值，OD600在0.5左右时可判断细胞处于对数生长期，活力最佳。）
婴幼儿益生菌选择禁忌及摄取注意事项 益生菌属于有益菌，但只有满足一定先决条件的有益菌才能称得上是益生菌。其中，安全性是其中最重要的先决条件之一，用于婴幼儿的益生菌尤其如此。我国对于用于婴幼儿食品的益生菌要求尤其严格，安全性是首要考虑因素。基于充分的人体试验研究确认，卫生部于2012年对有关菌种进行了安全性评估，根据安全性评估结果最终确定了可用于婴幼儿食品的6株益生菌菌株。 婴幼儿益生菌对宝宝的身体成长是有很多好处的，那么在摄取过程中要注意哪些事项呢? 1、冲调含有益生菌的奶粉或制剂，要注意使用温开水(35～40℃)给宝宝服用，冲泡好的奶或益生菌制剂要及时服用，以免益生菌死亡失效。 2、益生菌不能与抗生素同服。抗菌素尤其是广谱抗菌素不能识别有害菌和有益菌，所以它杀死敌人的时候往往把有益菌也杀死了。这时候或者过后补点益生菌，都会对维持肠道菌群的平衡起到很好的作用。如果必须服用抗生素，服用益生菌与抗生素间隔的时间不应短于2～3小时。 3、1岁以上的宝宝，可以喝婴幼儿益生菌酸奶。特别是有食欲不振、便秘、经常腹泻或消化不良的宝宝，长期选择益生菌酸奶还能调节胃肠功能。喝酸奶后，若发生腹部不舒服或腹痛、恶心、呕吐，应立即停止饮用。 4、益生菌的食物有纤维、乳糖、淀粉、寡糖，益生菌的发酵产物等成分;所以在补充益生菌的同时，应多吃根茎类蔬菜、水果及海藻等食品，就等于在肠子里布置一个它们喜欢生长的环境。多数的益生菌并不喜欢肉类和葡萄糖，如果含益生菌的食品中含有过多的糖分也会降低菌种的活性。 5、如果没有消化不良、腹胀、腹泻或存在其他破坏肠内菌群平衡的因素，不提倡婴幼儿额外摄入过多的益生菌制剂。 Puractive益生菌动物双歧杆菌BB-12，是科汉森公司专门针对婴幼儿的生理特征开发研制的。品质安全有保障。含有100%动物双歧杆菌Bb-12，百分百不添加牛奶、乳糖、香兰素、蔗糖、果粉、菊粉等成分，同样适合过敏体质宝宝食用；运用微胶囊包埋技术和独立的铝箔包装可以很好地保护Bb-12菌株的活性，能常温保存，方便携带。
体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌。每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。 【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面―次(拖布要专用).紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。―些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。 【洗手和着装】原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意：金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。 【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、 PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。
水产益生菌使用方法和注意事项 益生菌，又称为益生素、微生态制剂或活菌制剂。指有利于维持肠道内的微生态平衡的微生物及其代谢产物，其可通过进入并定植于宿主的消化道，促进肠道有益微生物的繁殖，抑制有害微生物生长，调节宿生肠道菌群平衡，从而改善宿主的健康。益生菌对宿主的作用属于生物修复的范畴。 因此，益生菌应具备以下条件： （1）必须对宿主无害； （2）被宿主摄入后，可定植于消化道内并发挥作用； （3）在人工感染的实验中，必须能提高宿主的抵抗力。 1、益生菌的作用机理 分泌作用：通过分泌细菌素、胞外酶等物质，抑制或杀灭有害细菌。 竞争作用：通过分泌抑制性物质，竞争营养物质，竞争宿主的定植位点或通过竞争排斥的原理，抑制有害细菌的生长繁殖。 提高水产动物的免疫力：通过提高抗体水平和巨噬细胞的活动，激活机体体液和细胞免疫系统从而提升宿主的免疫能力。 净化改良水环境：通过直接或间接的分解和利用养殖水体中的有机物质，减少氨氮、亚硝酸盐的含量，抑制有害细菌滋生，改善水体环境，促进水产动物的健康生长。 2、益生菌在水产养殖中的应用 水产动物生活在水环境中，其体内微生物组成除了受自身机体内在因素的影响，还易随着来自外界环境与食物中的微生物入侵而发生改变。为了有效地对水产动物疾病的进行防治，可以采用外界添加益生菌的手段实现改善水产动物生存的环境，平衡体内的微生物群落的组成，增强水产动物对病原菌的抵抗能力，提高养殖成功率的目的。 分类 在水产养殖过程中，益生菌常作为生长促进剂、免疫促进剂、治疗剂、水质改良剂进行实际应用，根据菌种不同来区分，常用的益生菌有光合细菌、芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、蛭弧菌、硝化细菌等。 1、光合细菌 光合细菌，属于厌氧或兼性厌氧性的光能异养菌。在光照条件下，光合细菌能利用小分子有机物合成自身生长繁殖所需要的各种养分，增加水体溶氧，还能利用水环境中的氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐等合成有机氮化物，净化水质；在缺氧条件下，光合细菌对硫化氢、酸性物质等均有一定的分解作用。此外，光合细菌可以产生抗病毒因子等生物活性物质，具有独特的抗病、促生长功能，大大提高了水产动物的生产性能的优点。 使用注意事项： （1）光合细菌制剂多为液态，使用时无需活化，应选在晴天上午使用，低温及阴雨天不宜使用； （2）水肥或水质恶化时，宜使用光合细菌分解有机污染物，改善水体环境；水瘦时要先施肥再使用光合细菌； （3）由于酸性水体不利于光合细菌生长，使用光合细菌前应先泼洒适量生石灰调节水体pH至6.0-8.0。 2、芽孢杆菌
无菌操作原则及注意事 项 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
无菌操作原则及注意事项 无菌操作原则： 1、环境要清洁，进行无菌操作前半小时，须停止清扫地面等工作。避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室应每天用紫外线消毒一次。 2、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。 3、执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。 4、夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。? 无菌操作间 四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 5、无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。 6、无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。 7、无菌盐水及酒精、新洁尔灭棉球罐每周消毒一次，容器内敷料如干棉球、纱布块等，不可装得过满，以免取用时碰在容器外面被污染。 无菌操作技术及注意事项 1、玻璃器皿的消毒和清洁
⑴新购玻璃器皿的处理 新购玻璃器皿应用热肥皂水洗刷，流水冲洗，再用1%～2%盐酸溶液浸泡，以除去游离碱，再用水冲洗。对容量较大的器皿如试剂瓶、烧瓶或量具等，经清水洗净后应注入浓盐酸少许，慢慢转动，使盐酸布满容器内壁数分钟后倾出盐酸，再用水冲洗。 ⑵污染玻璃器皿的处理 ①一般试管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分钟，或在3%～5%漂白粉澄清液内4小时，有的亦可用肥皂或合成洗涤剂洗刷使尽量产生泡沫，然后用清水冲洗至无肥皂为止。最后用少量蒸馏水冲洗。 ②细菌培养用的试管和培养皿可先行集中，用1kg/cm2高压灭菌15～30分钟，再用热水洗涤后，用肥皂洗刷，流水冲洗。 ③吸管使用后应集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小时，逐支用流水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗。 ④油蜡沾污的器皿，应单独灭菌洗涤，先将沾有油污的物质弃去，倒置于吸水纸上，100℃烘干半小时，再用碱水煮沸，肥皂洗涤，流水冲洗。必要时可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水冲洗，后用清洁或稀盐酸洗脱染料，再用清水冲洗。一般染色剂呈碱性，所以不宜用肥皂的碱水洗涤。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水冲洗，再用肥皂或弱碱性煮沸，自然冷却后，流水冲洗。被结核杆菌污染或不易洗净的玻片，可置于清洁液内浸泡后再冲洗。 2、无菌器材和液体的准备 将玻璃器具中的培养皿、培养瓶、试管、吸管等按上述方法洗净烘干后，用一洁净纸包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，装入干净的铝盒或铁盒中，于120℃的干燥箱中干燥灭菌2小时，取出备用。对于手术器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，则采用高压
益生菌四大功能 益生菌（Probiotics）是一类对人体有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善人体微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌分类 ①乳杆菌类（如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌等）； ②双歧杆菌类（如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等）； ③革兰氏阳性球菌（如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等）。 此外，还有一些酵母菌与酶亦可归入益生菌的范畴。当人体住满足够的益生菌时，人就会处于健康的状态，但是一旦体内菌群失去平衡，比如菌种间比例发生大幅变化或者超出正常数值时，那么腹泻、过敏、胃口不佳、疲倦、免疫力低等一系列病症就会随之而来，人体的健康就会亮红灯，而这时适当添加益生菌，协助体内菌群平衡，才能让人重现健康状态。2011年10月24日，国家卫生部针对国内婴幼儿益生菌市场，公布了《关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告》（卫生部公告2011年第25号） 用于婴幼儿食品的菌种名单
菌种名称拉丁学名菌株号 嗜酸乳杆菌* （只限于1 岁以上的幼儿食用） Lactobacillus acidophilus NCFM 动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis Bb-12 乳双歧杆菌Bifidobacterium lactis HN019 Bi-07 鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus LGG HN001 注释：卫生部公告中规定的这6个益生菌菌株是经过了大量的临床实验，对于婴幼儿的安全性和功效性是有保证的。其中，* 嗜酸乳杆菌NCFM只限于1岁以上的幼儿食用。这6种益生菌菌株中，动物双歧杆菌Bb-12和鼠李糖乳杆菌LGG是由丹麦科汉森公司生产，而另外4株菌-嗜酸乳杆菌NCFM、乳双歧杆菌HN019、乳双歧杆菌Bi-07、鼠李糖乳杆菌HN001全部是由杜邦丹尼斯克公司生产。 许多益生菌株在胃肠道内可产生消化酶，这些酶可帮助人体更好地消化所摄入的食品及吸收食品中的营养成分。益生菌还可竞争性抑制有害微生物吸收营养物质及进入血液循环系统。嗜酸乳杆菌是这方面的代表菌株，可分泌消化乳糖的乳糖酶，从而缓解乳糖不耐症。 1.帮助营养物质的消化吸收 2.产生重要的营养物质 益生菌能产生维生素，包括泛酸、尼克酸、B1,B2,B6及维生素K等，同时能产生短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等等，对骨骼成长和心脏健康有重要作用。 3.抵抗细菌病毒的感染，提升免疫通过三大步骤，益生菌可清除有害菌对身体的伤害：
使用益生菌制剂的注意事项 1、选择可室温保存的益生菌制剂，患者服药依从性好 由于受到生产工艺的限制，传统益生菌制剂均需要2～8℃低温贮运或阴凉条件下储存，这既增加了贮运成本，又使得患者的服药依从性差。新一代益生菌制剂克服了此项技术瓶颈，可直接室温保存，既降低了贮运成本，又提高了患者的服药依从性。 2、选择不含肠球菌的益生菌制剂 肠球菌是条件致病菌，国内外关于肠球菌耐药性和致病性的文献已达上万篇。2002年WHO和FAO联合发表报告建议：益生菌中不宜使用肠球菌。2006年中华消化杂志也发表文章表明：由于肠球菌是院内感染的重要来源，且对万古霉素耐药性的不断增加，故不推荐此类活菌作为益生菌制剂。 3、与抗菌药联用的注意事项 抗菌药不具有生物选择性，在杀灭有害菌的同时，也会杀死肠道内的有益菌，导致抗生素相关性腹泻等不良反应的发生，因此，中华预防医学会微生态分会儿科学组及卫生部合理用药专家委员会主任委员李兰娟院士建议：目前细菌感染性疾病的治疗策略核心，由单纯的抗菌药“杀菌”，向“杀菌”的同时应用益生菌“促菌”（保护肠道菌群）转化，即“边抗边调”和“抗后再调”。“边抗边调”和“抗后再调”已成为抗菌药合理应用的“八字方针”。 口服抗菌药的同时口服益生菌制剂，需要间隔2-3小时，即服用抗菌药2-3小时后再服用益生菌制剂；静脉输抗菌药的同时口服益生菌制剂，则不需要间隔。另外，专家共识还建议：应用抗菌药的同时，应加大益生菌制剂的服用次数和剂量。 4、选择能够修复肠黏膜的益生菌制剂，效果更佳 中国有句古话：“皮之不存，毛将焉附”。对于溃疡性结肠炎、伪膜性肠炎等肠黏膜受损的患者，此时服用益生菌制剂，则有益菌很难在肠黏膜上定植。 研究证实，丁酸（又称酪酸）是肠黏膜再生和修复的重要营养物质，能修复受损伤的肠黏膜，营养肠道，而丁酸（又称酪酸）就来源于肠道内的产酪酸菌。因此，补充产酪酸菌（如酪酸梭菌），能够在修复肠黏膜的基础上，恢复肠道菌群平衡，有效预防肠功能紊乱和内源性感染的发生，效果更佳。
第一部分：益生菌相关介绍 索引 一、什么是益生菌 二、益生菌的种类 三、益生菌的作用 四、人体中的益生菌 五、如何补充益生菌 六、哪一些需要补充益生菌 七、补充益生菌的注意事项 八、如何正确冲服益生菌 一、什么是益生菌 益生菌（Probiotics）是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内、口腔、食道等处，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。 二、益生菌的种类 （1）乳杆菌类 （如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌等） （2）双歧杆菌类
（如长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等） （3）革兰氏阳性球菌 （如粪链球菌、乳球菌、中介链球菌等）。 三、益生菌的作用 益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。益生菌是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。 1、益生菌有缓解乳糖不耐症状，促进机体营养吸收的作用：益生菌有助于营养物质在肠道内的消化。它能分解乳糖成为乳酸，减轻乳糖不耐症。双歧杆菌和乳酸杆菌不仅可以产生各种维生素如维生素B1、B 2、B6、B12、烟酸和叶酸等以供机体所需，还能通过抑制某些维生素分解菌来保障维生素的供应。另外，双岐杆菌还可以降低血氨改善肝脏功能。 2、益生菌有整肠作用，调整微生态失调，防治腹泻：益生菌活着进入人体肠道内，通过其生长及各种代谢作用促进肠内细菌群的正常化，抑制肠内腐败物质产生，保持肠道机能的正常。对病毒和细菌性急性肠炎及痢疾，便秘等都有治疗及预防作用。益生菌和很多慢性胃炎，消化道溃疡等消化道疾病有密切的关系。一部分的益生菌能抗胃酸，粘附在胃壁上皮细胞表面，通过其代谢活动抑制幽门螺旋杆菌的生长，预防胃溃疡的发生。 3、益生菌能代谢产物产生生物拮抗，增强人体免疫力：肠道决定人体70%的免疫力，益生菌可以修复肠道黏膜、提升机体免疫力。益生菌可产生有机酸、游离脂肪酸、过氧化氢、细菌素抑制其它有害菌的生长；通过“生物夺氧”使需氧型致病菌大幅度下降，益生菌能够定殖于粘膜、皮肤等表面或细胞之间形成生物屏障，这些屏障可以阻止病原微生物的定殖，起着占
手术中无菌操作的注意事项 1.任何人发现或指出违反无菌技术时，必须立即纠正，术者 的脐平面以下区域，均视为有菌区，因此手和器械都不可以放到该平面以下，如器械掉至该平面一次啊，需重新灭菌处理才能在使用。 2.手术者或助手皆不可随意伸臂横过手术区取器械，器械护 士不可以从术者身后传递器械，必要时可以从术者手臂下传递，但不得低于手术台的边缘。 3.已取出的无菌物品包括手套，手术衣，手术巾，手术单， 器械，敷料，注射器，针头，导尿管等，虽未被污染，也不能放回无菌容器中，需重新灭菌后再用。 4.手套破口时，应及时更换，凡怀疑物品，器械被污染时， 要重新灭菌后在使用。、 5.术中以污染的器械，如切开胃肠用后的剪刀，接触污染区 的器械等，皆需另放于盘内，不能重复用于无菌区。并且操作人员需更换手套，必要时加盖无菌单重建无菌区。， 6.手术中手术人员需更换位置时，需后退一步背对背转身。 7.向手术台上提供一次性物品时，应保持一定距离，不得进 入或跨越无菌区。 8.手术中若需擦汗，应将头转向一侧，咳嗽、打喷嚏也应避 开无菌区。 9.手术中防止空气污染，应随时关闭门，限制人员走动和手
术间的人数。 铺无菌巾、单注意事项 1.在铺单前，应前确定切口的部位，，铺好4块治疗巾后， 用巾钳固定防止下滑。（递4块治疗巾的方法） 2.手术巾铺下后，不可随意移动，如位置不准确，只能有手 术区向外移动，而不能向内移动（以免污染手术区）。3.消毒的手臂不能接触靠近手术区的灭菌敷料，铺单时，双 手只接触手术单的边角处。 4.手术野四周及托盘上的无菌单为4-6层，手术野以外为2 层以上。 5.手术单的头端应超过头架，两侧及尾部应下垂超过手术台 的30cm， 6.打开的无菌单和治疗巾，无使其下缘接触收手术衣要平面 以下及其他有菌物品，铺无菌单时如污染即须更换。 7.铺至第一层无菌单者不穿手术衣、不戴手套。铺完第一层 无菌单后，铺单者应再次用消毒液消毒双手后穿无菌手术衣、戴无菌手套后再铺其他无菌单。 8.尽量应用稍大的单子，减少铺单数目，小单子要重叠盖好， 以免散开，导致污染。 9.切口四周至少有四层巾单遮盖。术中一经浸湿，即失去无 菌隔离作用，应加盖无菌单。 10.铺置薄膜手术巾前先用无菌纱布擦干手术野皮肤。
备的菌存保及制液．精品文档 1目的菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保 藏 的目的。规范菌种原始菌液的制备及长期保存。 内容 2 定义 2.1 由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。原始菌液-- 由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的-- 工作菌液 孢子或细菌的悬浮液。总则2.2 微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。 每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽 孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。经检查如果满意，贴上 合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里 ～8℃）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记（2 录以便能追踪传代史。生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。 原始菌种的传代次数最多传至第五代。 培养基 2.3 冻干菌制备原始菌液 2.4 由甘油冷冻菌制备原始菌液 2.4.1 液体培养基后所得的菌作为第一代。把冻干菌加入100ml 2.4.1.1 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；2.4.1.2
该菌所适用的液体培养基中；100ml 2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至 或更长一些24h 2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养 时间；液体培养基后所得的菌作为第二代。把甘油冷冻菌加入100ml 2.4.1.5 由集菌平板制备原始菌液2.4.2 （或更长时间）培养的菌液摇匀，各取24h2.4.2.1 在超净工作台内，把经过 只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。不同培51ml，无菌转移至养基 适用于不同菌种。另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。 2.4.2.2 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。 2.4.2.3 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除． 精品文档 以内即可显见增长；生长菌-24h 2.4.2.3.1 孢子，这样可确保提到浓50%7天或更长时间才能得到孢子-需要3～ 2.4.2.3.2 的悬浮液。对需长时间培养或培养温度较高（55℃）的平板进行适当密封，以免培养基失水干裂。天才能获得明显的分生孢子生长物，将平145～ 2.4.2.3.3 分生孢子，一般需要 板封口，以免分生孢子污染空气。）加至经培养后氯化钠磷酸缓冲液（PBS 2.4.2.4 在超净工 作台内，各取约8.0ml 的集菌平板内。用弯曲的接种棒（或无菌玻璃弯头）轻轻地刮平板表面，使菌落与平板 2.4.2.5 分离。但注意不要划破培养基。倾斜平板，使菌悬液集中于平板一端，用无菌注射器或无只平 板中的菌悬液收集于一只大小合适，便于封口的试管中。5菌吸管吸取菌悬液，把标记2.5 在原始菌液的标签上记述下列内容： 菌种名称 2.5.1 制备日期） 2.5.2原始菌种制备编号（代数+ 有效期（孢子悬浮液的有效期为一年） 2.5.3 操作者姓名 2.5.4 菌液浓度一经标定后，即应补记在标签上。 原始菌液的浓度标定 2.6 标定孢子初始制备液的浓度并进行记录，以后，每次使用该原始菌液时， 2.6.1 不论直接使用或用其配制工作菌液，都应事先重新标定其浓度。前一次标定浓度仅供参考；除 非有定量要求，一般生长态菌的原始菌液无需标定，生长菌很易死亡， 2.6.2 因此不能保持稳定可靠的浓度。菌种的斜面保存 2.7 经常使用的菌种。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长 2.7.1 2℃～8℃的冰箱中保藏。后，棉塞部分用油纸包扎好，移至保藏时间依微生物的种类而有不 同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存 2.7.2 个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。2-4菌液甘油冷冻管保存 2.8 将液体培养基培养或固体培养基培养制备的剩余原始菌液中加入足量的无 2.8.1 甘油液。轻轻振摇，使其充分混和；菌甘油得到10%收集于网络，如有侵权请联系管理员删除． 精品文档 支冷冻用小试管或冷冻管中，在上述混和液，无菌分装于10 2.8.2 各取2.0ml 年的有效期。做好记录，并妥善保存。2管子上注明菌种名称、菌种号等以及从冷冻日起80℃ 超低温或液氮罐内贮存。 2.8.3 制备好的菌液甘油冷冻管在- 液体石蜡管的保藏 2.9 1℃灭菌12 2.9.1 将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，