第十章细胞增生和凋亡的分子机制
多细胞生物体细胞命运
?细胞周期增生
?分化成具有特定功能的细胞
?死亡并从生物体中消失
体内自发的细胞死亡是细胞凋亡
第一节生长因子信号转导活化细胞周期进程是细胞增生的分子机制
细胞周期
参与细胞周期的蛋白质
调控蛋白协同作用调控细胞周期
生长因子通过信号转导调控细胞周期
细胞周期:大多数真核细胞经过一系列有序事件，使细胞体积增大，染色体复制，并且分裂成两个各含有一套完整的染色体的子代细胞
细胞周期：四个周期
间期(G1期S期G2期M期):蛋白质合成旺盛，DNA复制2nG1细胞4n的G2期细胞细胞体积增大
M期细胞分裂4n的细胞分裂为两个2n的G1期细胞
细胞周期中的四个关卡
1.G1晚期的限制点
2.G1-S转折的DNA 损伤关卡
3.G2-M转折的DNA 损伤关卡
4.M期的有丝分裂中期关卡或称纺锤体组装关卡
关卡是调控细胞周期的位点为保持细胞周期正常进行，细胞周期中存在四个关卡：G1晚期的限制点；G1-S转折和G2-M转折的DNA 损伤关卡；M期的有丝分裂中期关卡或称纺锤体组装关卡
二、有许多蛋白质参与调控细胞周期进程
周期蛋白（CYCLIN）周期蛋白依赖性激酶（CYCLIN DEPENDENT KINASES(cdk) 周期蛋白－周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）RB及E2F－DP1转录因子
调节Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶
泛酸（ubiquitin)和使蛋白质泛酸化(ubiquitination)的酶
(一)周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶复合物驱动细胞周期进程
周期蛋白--含量随着不同细胞周期时期升高和降低的蛋白质，可分为A、B、C、D、E等周期蛋白的含量受以下几方面的调控：
生长因子诱导的基因表达泛素介导的蛋白质降解在细胞核与细胞质间的运输（周期蛋白B）
周期蛋白的结构
有结构保守的100多个氨基酸残基的周期蛋白盒，是与Cdk结合的部位
周期蛋白与相应的Cdk结合成异二聚体
周期蛋白依赖性激酶（Cdk）
组成型表达的核内丝－苏氨酸蛋白激酶单独存在的Cdk无活性
与相应的周期蛋白结合后变构形成异二聚体，并被磷酸化和去磷酸化调控才能在有活性和无活性状态之间转换。周期蛋白是调节亚基，Cdk是催化亚基
有活性的Cdk能磷酸化底物蛋白质如Rb蛋白，转录因子、组蛋白等，调控它们的活性，驱动细胞周期进程Cdk复合物的活性受CKI抑制
The main human cyclins and Cdks
成熟促进因子（mature-promoting factor, MPF)
周期蛋白B和Cdk1(Cdc2)的复合物
Cdc2 is the protein that encoded by genes which are required for passage through START as well as for entry into mitosis.
Cyclin B is a regulatory subunit required for catalytic activity of the Cdc2 protein kinase. (二) CKI抑制Cdk及周期蛋白－Cdk复合物的活性
CDK抑制物（CKI）的种类(两类）
1.Cdk4和Cdk6抑制因子家族，包括P15、P16、P18和P19 蛋白
特异地识别和结合Cdk4或Cdk6，抑制周期蛋白D与Cdk4或Cdk6地结合
与周期蛋白D－Cdk4/6结合，抑制Cdk4/6利用ATP磷酸化底物
2. Cip/Kip（细胞因子诱导地蛋白/激酶相互作用蛋白）家族，包括P21、P27和P57
是细胞接受到接触抑制、DNA损伤、低氧及某些细胞因子等信号后的产物
和周期蛋白－Cdk复合物结合，抑制它们的活性
对周期蛋白D－Cdk4/6 有正调节作用
（三）Rb蛋白与转录因子E2F－DP1的结合对G1期进展产生负调节作用
RB家族的成员RB（P105 RB，视网膜母细胞瘤蛋白）及P107和P130
分子中有一个口袋状结构，称口袋蛋白
RB家族的分子中口袋蛋白能与多种蛋白结合，如转录因子E2F－DP1复合物、RNA聚合酶等，并调控它们的活性
G1早期低磷酸化的RB与E2F－DP1复合物结合，抑制它的转录因子功能
G1中期及晚期，周期蛋白D－Cdk4/6和E/Cdk2先后磷酸化RB，磷酸化的RB失去活性，释放出E2F－DP1
游离的E2F－DP1活化靶基因转录
核苷酸及DNA合成酶的基因，如四氢叶酸还原酶，胸苷激酶，DNA合成酶α的基因
周期蛋白D、E、A及Cdk2基因某些细胞癌基因
游离的E2F－DP1活化靶基因转录
E2F基因本身
E2F活化自身基因及周期蛋白E，加速RB蛋白在G1晚期磷酸化及释放E2F－DP1
E2F靶基因的表达使细胞完成DNA复制的准备，细胞通过限制点
（四）使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也调节Cdk活性
Cdk1 101位苏氨酸被Cdk活化激酶磷酸化，可将活化
15位酪氨酸及14位苏氨酸磷酸化，失去活性G2期，三个部位都磷酸化，无活性
15位酪氨酸及14位苏氨酸去磷酸化后，才能有活性
( 五) 泛素－蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用
泛素（Ub）是由76个氨基酸残基组成的多肽，高度保守，广泛存在于所有真核细胞内
Ub利用其末端甘氨酸末端残基与靶蛋白的α或ε－氨基结合，使蛋白质泛素化标记，以便于进一步降解
Ub与靶细胞的结合由一系列酶连续催化完成
泛素活化酶（E1）泛素偶联酶（E2）泛素－蛋白连接酶（E3）
蛋白质泛素化过程所需要的酶：
泛素活化酶E1和泛素偶联酶E2都是巯基酶，参与酶催化反应
泛素－蛋白连接酶E3是多亚基酶，有两类：SCF复合物APC（有丝分裂后期促进复合物）SCF复合物
三个核心成分（Skp1、Cdc53/Cullin和F－box）
底物先被磷酸化，才能和F－box蛋白结合
Cdc53/Cullin和另一亚基R－box蛋白结合泛素化的E2，并催化泛素和底物连接
SCF复合物的底物有周期蛋白D、E、P21、P27、E2F和Weel
APC
APC由10种以上的亚基组成，能与E2结合的泛素转移给周期蛋白A和B。
有功能的纺锤体形成后，APC也能多泛素化连接姐妹染色体的蛋白
通过多泛素化途径降解的蛋白质都是一些短命的蛋白质，如周期蛋白，P21,P27,E2F,Weel 等
与周期蛋白泛素化有关的序列周期蛋白A和B的N端9个氨基酸残基组成的保守序列，称破坏蛋白盒周期蛋白D和E的C端保守的PEST（脯－谷－丝－苏）序列
过程
1.E1利用ATP水解释放能量活化Ub，使半胱氨酸残基与Ub的C末端甘氨酸残基间形成高能硫酯键
2.E1将活化的Ub传递给E2，形成Ub－E2中间体E2是一类小分子量蛋白质，含有一个保守的核心结构域，其中的半胱氨酸与Ub也以高能硫酯键相连
3.在E3的催化下，Ub的C末端与靶蛋白的赖氨酸残基的ε－氨基以一个酰氨异构肽键连接，形成泛素化蛋白质
4.泛素化蛋白Ub分子上的48位赖氨酸残基的ε－氨基进一步不断泛素化，形成泛素化蛋白质
三、调控蛋白协同作用调控细胞周期
(一) Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素
?细胞周期蛋白D最早出现于G1中期，在晚期达到高峰
?细胞周期蛋白E最早出现于G1晚期，在G1-S转折处含量最高
?周期蛋白D和E分别与Cdk4/6 和Cdk2 形成复合物，使Rb磷酸化释放转录因子，使靶基因转录，作好复制准备
?周期蛋白D和E经SCF泛素化而降解
（二）Cdk1活化是G2M关卡处关键调控因素
?周期蛋白B-Cdk活化
?周期蛋白B磷酸化使周期蛋白B-Cdk1在核内聚集，并磷酸化底物蛋白，使染色体致密化，核膜解体，纺催体形成
（三）APC介导的多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素?周期蛋白A/B-Cdk1是APC磷酸化而活化的因素之一
?有丝分裂中期介导姐妹染色体稳定地附着在纺锤体的有蛋白激酶和蛋白质因子?APC活化导致连接姐妹染色体地蛋白质降解，细胞通过有丝分裂中期关卡，可进展到G1期
（四）DNA损伤关卡与G1及G2期停滞相关G2期地停滞涉及一系列的磷酸化过程（四）生长因子等细胞外因素通过信号
转导调控细胞周期
?细胞退出细胞周期，从G1期进入G0期，可由以下因素引起
环境中的信号分子促进G1期细胞退出细胞周期，并开始分化
环境中启动细胞分裂的生长因子不足
体外培养的原代细胞在分裂一定次数后进入衰老状态，不能回到G1期的终末G0期。G0期的细胞仍然进行着新陈代谢，许多具有特定功能的G0期细胞甚至不停地合成及分泌蛋白质，如胰腺细胞、肝细胞
G0期重返G1期要经过三个阶段
获得资格进入需要血小板源生长因子表皮生长因子和胰岛素
进展需要胰岛素样生长因子1
最终活化周期蛋白－Cdk复合物，从而使细胞从G0期进入G1期
G1期的细胞也需要生长因子促进细胞周期的进程
生长因子受体酪氨酸蛋白激酶及整合素Ras-Raf-MAPKK-MAPK/ERK途径周期蛋白D的表达进入胞质被降解(G1早，中期）
生长因子活化p21和p27 促进周期蛋白D和cdk4/6结合使少量RB磷酸化E2F －DP1 促进周期蛋白E和Cdk2的表达
第二节细胞凋亡是一种自发的程序化细胞死亡
?早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis）
?细胞凋亡是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程?是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程
细胞凋亡与细胞坏死的区别
细胞凋亡与细胞坏死的区别
细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）
PCD最初是1956年发育生物学中提出的概念，是个功能性概念，强调的是其分子生物学和生理功能，一般指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。
形态学特征
凋亡的起始：细胞器、染色质等开始变化
凋亡小体的形成：质膜包裹染色质和细胞器
凋亡小体的消化：被吞噬细胞消化
生物化学特征
?胞浆内Ca2+浓度升高。细胞内活性氧增多。质膜通透性变大。
?DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180~200bp为基数的有序片段。Ⅱ型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。
细胞凋亡的生理意义
确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能
细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡可能会引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为自然科学界的关注热点。
凋亡途径是由诱导产生的胱天蛋白酶级联反应
?凋亡途径最早在线虫中阐明
凋亡途径涉及四个ced 基因产物：
Ced4 蛋白是一种蛋白酶，能活化Ced 3蛋白
Ced3 蛋白是一种蛋白酶，能使许多底物蛋白降解，从而出现凋亡形态学变化
Ced9 蛋白，能使Ced4蛋白失活
线虫胚胎期Ced 9基因突变失活能使许多本应存
活的细胞由于Ced4和Ced3的活化而凋亡，结果胚胎死亡。
Egl-1 的产物能抑制Ced9，过量表达可诱导凋亡
?胱天蛋白酶的名称来自该酶的活性中心有催化作用的半胱氨酸残基，能水解底物蛋白中特异部位的天冬氨酸残基羧基侧肽键
?凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf1）是一种构架蛋白，能活化胱天蛋白酶
?Bcl－2家族中有些成员是抗凋亡的，另一些成员是促凋亡
哺乳动物中Caspase 家族成员有相似的结构与活化过程
有14 种家族成员以酶前体的形式合成前体的结构分三部分：N端的原域，中间的p20和C端的p10域。域与域之间有可以被胱天蛋白酶水解的位点
在活化过程中，前体被水解成3个域，原域丢失，2个p20域和2个p10域组装成含有两个活性中心的四聚体成熟酶
胱天蛋白酶分类
1.起始者胱天蛋白酶，如caspase 8,9和10
◆位于上游，有较长的原域，
◆和接头蛋白或构架蛋白相互作用的功能域
◆通过蛋白质－蛋白质相互作用自我激活
Caspase 8前体位于途径上游，在接头蛋白FADD的介导下从胞浆中被募集到细胞膜，提高内在的酶活性而自我激活
Caspase 9前体也位于途径上游，能与Apaf 1等蛋白质结合而自我激活
2.效应者胱天蛋白酶，如caspase 3,6和7
有较短的原域，位于胱天蛋白酶级联下游
前体能被起始者胱天蛋白酶切割而活化
活化的效应者胱天蛋白酶能切割底物，使细胞凋亡
哺乳动物的Bcl－2家族是凋亡调节蛋白
Bcl-2家族:
(B cell lymphoma/leukemia-2）B细胞淋巴瘤/白血病-2)Bc1-2是一种原癌基因
是ced-9和Egl－1在哺乳类中的同源物
和一般的癌基因不同，Bc1-2家族中有些成员是抗凋亡的，另一些是促凋亡的。
Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。
蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命名为BHl、BH2、BH3和BH4
作用机制：影响凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf1）的功能影响线粒体的结构与功能 可分为3个亚族：
Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1
Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用
分子含有BH1～BH4区，大多数成员C端有能插入线粒体外膜和内质网膜的疏水肽段，分子面向胞浆
Bax亚家族
Bax、Bak、Bok
它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，促进细胞凋亡
除缺少BH4区外，结构和分布与第一类成员相识
促凋亡成员位于途径的下游
BH3亚家族
Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid
仅有BH3结构域
它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。
促凋亡的基因位于途径的上游。
死亡受体途径及线粒体途径是两种主要的凋亡信号转导途径
外源性死亡受体途径的关键步骤是死亡诱导信号复合物的形成
?被胞外信号所诱导的细胞凋亡途径称外源性凋亡途径
?有八种死亡受体，属于肿瘤坏死因子受体（TNFαreceptor)家族成员Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、
DcR1、DcR2
TNF receptor的结构特征
?I型跨膜糖蛋白
?胞膜外富含半胱氨酸的结构域（cysteine-rich domain CRD）
?胞内有死亡域（DD）
?以三聚体形式存在，与三聚体的TNF结合
死亡结构域蛋白
?死亡结构域蛋白（death domain protein DD）包括TRADD，FADD，RIP等。这些蛋白质C端都有一段同源的死亡结构域，通过这些死亡结构域与死亡受体的胞浆区相作同，传递死亡受体所引起的各种信号.
?TRADD：TNF receptor-associated death domain protein 34kd,与TNFR1胞浆区相关的蛋白质，传递TNFR1的大部分信号
FADD：Fas-associated death domain protein 与Fas胞浆区相关的蛋白质。N 端序列为死亡效应区域（death effector domain DED）,也是接头结构域，具有DED结构的蛋白质之间可以相互结合起来。
RIP：receptor-interaction protein 74kd，直接与Fas 结合，还可以通过TRADD 间接与TNFR1结合。RIP除了含有C端DD外，还含有N 端的蛋白激酶同源区（protein kinase homolog PKH）,具有蛋白丝/苏氨酸激酶活性
TRAF（TNF receptor-associated factor）：一组与TNFR家族成员胞浆区关联的接头蛋白TRAF结构域：分为TRAF-N和TRAF-C，TRAF-C同源性高，是TRAF蛋白与TNFR超家族成员胞浆区结合的部位。
锌指结构：经典的锌指结构C2H2
环指结构：参与信号转导途径，截去则发挥相反作用，成为信号转导抑制蛋白
Fas受体途径
?配体为FasL，也是一种细胞表面的单跨膜蛋白质，分布在细胞毒性T细胞表面?FasL在细胞表面形成三聚体
?细胞毒性T细胞识别靶细胞后，T细胞表面的三聚体FasL与Fas结合，使Fas也形成三聚体
?三聚体Fas的胞内段被激活，DD通过与接头蛋白FADD中的DD相互作用而募集FADD 构成死亡诱导信号复合物（DISC）
?FADD中的死亡效应域（DED），能与caspase 8 前体原域中的DED作用而募集caspase 8 前体
?募集caspase 8 前体自我激活，并且活化下游的caspase 3，导致病毒感染细胞凋亡细胞凋亡的膜受体通路
?FASL+FAS +FADD
?凋亡诱导复合物（DISC）
?胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上
?细胞有足够caspase8 细胞caspase8浓度不够
?死亡受体活化，切割Bid tBid从胞质到线粒体
?细胞凋亡
?CtyC 释放
TNFR的信号转导
?TNF-α三聚体与TNFR的结合引起受体多聚化，同时受体胞浆区DD也发生多聚化，这种多聚化DD可与胞浆中TRADD分子通过DD间相互作用发生结合。
?TRADD的募集可以引起两条信号转导通路：一条是通过FADD导致细胞凋亡，一条是通过TRAF2和RIP诱导NF-κB和AP-1的活化，参与抗凋亡?NF-κB转导细胞存活信号，通过表达FLIP（与caspase结构相似，无酶活力的蛋白）抑制caspase 8前体活化，细胞不凋亡
?TNFR只有在蛋白合成受阻的情况下才会诱导凋亡。
内源性线粒体途径的关键步骤是细胞色素C从线粒体膜间隙释放到细胞浆
?线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径
?促凋亡基因活化
?细胞色素C
?细胞色素C+Apaf-1+ caspase9—凋亡体
?抗凋亡成员能与促凋亡成员相互作用而抑制促凋亡成员的功能
线粒体释放细胞色素C的模型
?Bax和Bak在线粒体外膜上打孔
?通过VDAC（voltage-dependent anion channel)在线粒体外膜上形成通道
?使线粒体外膜上天然存在的ATP－ADP转运蛋白孔道保持开放状态，使细胞色素C 从线粒体膜间隙穿过外膜进入胞浆
细胞色素C的作用
?进入胞浆的细胞色素C与Apaf1、ATP/dATP结合成复合物，称凋亡体
?Apaf1通过分子中的胱天蛋白酶募集域(CARD)与caspase 9前体原域中的CARD相互作用而募集caspase 9前体，富集的caspase 9前体自我激活
凋亡途径有正、负调节
?正调节有caspase 8和9 前体的自我激活和胱天蛋白酶级联中的酶促放大作用
?负调节作用有FLIP 抑制caspase 8前体的活化和Bcl-2家族中抗凋亡成员阻断促凋亡成员的作用
?抑制caspase 的凋亡抑制物（IAP)
分子中有1到3 个BIR域，有保守的CX2CX16HX6C序列，可以形成锌指样结构BIR2域的IAP可与caspase 3和7结合并抑制它们的活性
BIR3域的IAP可与caspase 9结合并抑制它们的活性
?Smac或称DIA－BLO能与IAP的BIR域结合从而抑制IAP
细胞凋亡的两条途径间存在串话
?caspase8
?细胞有足够caspase8 细胞caspase8浓度不够
?死亡受体活化，切割Bid tBid从胞质到线粒体
?细胞凋亡
?CtyC和Smac/DIABLO 释放
内源性凋亡途径细胞凋亡与人类疾病
?细胞凋亡受抑制有关的疾病
?恶性肿瘤:滤泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病
?自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、肾炎
?病毒感染性疾病：腺病毒病、庖疹病毒病
?细胞凋亡增多有关的疾病
?艾滋病：
?神经变性性疾病：早老性迟呆、帕金森病、小脑退化病
?骨髓发育不全性疾病
?缺血性疾病
?酒精中毒性肝炎
八. 细胞凋亡的检测方法
一、细胞凋亡的形态学检测二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）
三、线粒体膜势能（ mt）的检测四、DNA片断化检测
五、TUNEL法六、Caspase-3活性的检测七、WB检测
八、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析
细胞凋亡的形态学检测
1 光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
3 电子显微镜观察
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
细胞衰老概括 【引言】人体衰老的实质即为细胞衰老，当前科学家无不探究着生命的奇迹意欲找出防止细胞衰老而延缓生命的方式，然而细胞衰老一方面对人体有着不可替代的作用，领一方面又不为人们所接受。 【The advantage of cell senescence】 1.细胞衰老可抑制肝脏纤维化 人类繁殖后期（post—reproductive）的生命通常与衰退、能力丧失联系在一起，细胞中称为衰老（senescence）的状态，即细胞衰老与此相似。然而近期来自美国冷泉港实验室、霍德华休斯医学院、巴西圣保罗大学研究人员发现一类特殊的衰老肝脏细胞能调控活体小鼠中一系列的生命活动，抑制纤维化（fibrosis）——这是肝脏遇到急剧伤害的时候作出的自然反应。 这一惊人的发现是由这一研究团队去年将肝脏细胞衰老与抵抗肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的器官功能联系在一起的技术获得的。这一研究成果公布在8月22日的《细胞》（Cell）『1』杂志上。 这项研究成果首次证明了细胞衰老在非癌症性病理中的特殊作用，CSHL研究小组认为这有助于针对一些严重肝脏疾病的前体，譬如肝硬化提出新的治疗方法——肝硬化是美国第12种最常见的致死疾病。 在2003年Scott W.Lowe博士等人就发现细胞衰老机制会让癌细胞停止生长，并且他们成功的让癌细胞在进行治疗后处于无法复制的细胞衰老阶段，并显现出良好的效果。在那项研究中，研究人员还进一步找出了这个使细胞停止生长的分子机制，即细胞衰老是由于一些特殊的染色体区域被紧密的包裹在异染色质内所致。研究人员将这些新发现的区域命名为“衰老相关异染色质基因座”（senescence—associated heterochromatic foci，SAHF）。 去年研究小组又发现诱导衰老的细胞衰老能够有效预防自发性癌症。衰老细胞有异常染色体，上面携带机能不良的端粒和较短的末端，在肿瘤抑制子p53缺失时促进肿瘤发生，可能与老年人癌症高发性有关。研究人员认为衰老途径的活化，足够抑制原发性肿瘤，说明通过阻止细胞增殖，p53介导的衰老是抑制衰老细胞形成肿瘤的一个重要机制。 而近期Lowe研究小组的有关肝脏疾病的相关衰老研究分成了两个不同的方向：哪些伤害对于肝脏组织而言是急性，哪些则是慢性，这种对照性的实验有助于发现衰老是如何帮助抑制损伤的，以及衰老过程是如何和何时被肝脏受到的慢性伤害“打垮”的。 在针对第一项的研究中，研究人员对小鼠肝脏施用一种毒素——急性伤害，发现了与之前实验的一致的结果：在细胞纤维化增多之后，出现肝细胞死亡（纤维化是小鼠，人类中都存在的应对组织损伤的一种天然反应）。之后的研究就越来越有趣了，Low e博士说，“我们观测到肝脏星状细胞（Hepatic stellate cells，HSC）出现增殖激增之后，我们发现这些细胞为了避免更多纤维化反应，最终走向衰老，从肝脏中清除了出去。”
细胞凋亡主要发生机制及相关作用研究 摘要 细胞凋亡是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是细胞接受某些特定信号刺激后在基因调控下所发生的一系列细胞主动死亡过程，通常来说是一种正常生理应答反应。目前认为细胞凋亡信号传导通路主要包括三种：内源性途径、外源性途径以及内质网途径。细胞凋亡的研究已成为当前生命科学研究热点之一。研究细胞凋亡的信号传导通路及其调控对进一步认识和治疗凋亡相关疾病有重要意义。 关键词：细胞凋亡信号传导通路疾病治疗
ABSTRACT Apoptosis is an orderly or programmed cell death way, is a series of cells active death process under gene regulation that after cell accepted certain specific signal stimulation, it is a normal physiological response. At presently, the cell apoptosis signaling pathways mainly includes three types: intrinsic pathway, extrinsic pathway, and the way of endoplasmic reticulum. The research of apoptosis has become the life science research hotspot. Researching cell apoptosis signaling pathways and regulation can get further understanding and also have the important meaning to treatment of apoptosis related diseases. Key words: A poptosis Signal conduct pathway Treatment of diseases
细胞衰老理论 *氧化功能损伤理论 细胞新陈代谢产生的活性氧类分子（ROSs）如超氧化物阴离子、过氧化氢和羟基化物等对细胞都有积累性损伤。大部分的活性氧类分子都产生于线粒体中，如携带编码抗氧化剂基因的转基因果蝇寿命更长。一般认为谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶SOD（SOD）可清除ROSs，但是在某些情况下经诱变的缺乏谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶（SOD）SOD1 SOD2和SOD3的鼠并没有明显的衰老现象出现，这些鼠中有些出现了严重的寿命缩短现象。超氧化物歧化酶是一种酶，它使两个超氧阴离子变成过氧化氢和氧气。最近发现缺少编码p66shc蛋白基因的鼠对一些产生氧化损伤的作用物有高度的抗性，这种鼠存活时间延长了30%。p66shc是p52shc/p46shc的异构体，是p52shc/p46shc选择性剪切形成的。p52shc/p46shc 是细胞质内的物质，参与细胞表面受体到Ras的促细胞分裂信号的传导。这些结果表明氧化损伤是引起细胞衰老和老化的一个重要因素。 *基因组不稳定理论 遗传基因改变的积累是衰老的原因，如点突变、DNA重复序列的丢失（核糖体DNA,、染色体缺失或重组）。事实上突变积累已在鼠中发现。在一些研究中，转基因的lacZ报告基因作为标记基因整合入质粒，这种转基因对肝脏（有丝分裂旺盛）的影响比对大脑（有丝分裂较慢）的影响要大，大部分的突变是基因的重组。对鼠的研究证实了DNA损伤对细胞老化的影响。XPD 基因的突变导致细胞的过早衰老和鼠寿命的缩短，这表明基因突变对细胞衰老有重要影响。XPD 基因编码DNA解旋酶，具有DNA修复和转录的功能。这种影响是否由DNA缺陷直接产生的还是由DNA缺陷间接引起的现在仍然不清楚。 出芽酵母出芽后母细胞出现老化，核糖体DNA改变，最初出现100-200个串联拷贝。在细胞生长期里核糖体DNA从染色体上脱离并保持染色体外的环状拷贝（染色体外的rDNA环，ECRs），这些拷贝大多分布在DNA复制后的母细胞中。ECRs数量增多，导致在rDNA转录处的核仁碎片出现。遗传学数据表明ECRs对酵母老化起重要作用。酵母细胞sgs1`基因的突变使ECRs更快地积累，导致细胞生命期的缩短。通过人为的遗传操作产生ECRs也可缩短细胞的生命期。sgs1基因编码DNA解旋酶（解开DNA双链）。人类与sgs1项对应的是Werner's综合征（WS）相关基因，WRN基因突变导致Werner's综合征，其症状与早衰相似。 *染色体外的基因组不稳定理论 线粒体DNA突变的积累可能导致衰老已经引起重视，线粒体DNA的突变率是核DNA突变率的10-20倍，这一事实证明了这种可能性。但是，已证实在人肌肉细胞中基因突变部分必须至少达到50-80%以上才能对细胞产生危害。随着年龄增长线粒体突变的多样性增加，并且个体细胞中DNA相当大一部分都有突变。另外，在线粒体DNA复制的调控区有高频的点突变发生。随年龄增长线粒体电子转运功能也逐渐衰退。骨骼肌纤维细胞缺乏细胞色素C氧化酶导致高水平的线粒体电子转运功能缺失。缺乏电子转运的功能导致一些次级效应，如自由基的积累。 *染色体末端的不完全复制 首次有文献资料证明细胞衰老发生的是染色体复制衰老理论：经过多次分裂后，大多数正常人体细胞其增殖能力逐渐下降。最近又研究表明人体细胞的复制衰老是由于端粒的缩短。端粒是染色体末端帽状重复的DNA序列，可防止染色体的融合并保证基因组的稳定性，是染色体的必须结构。端粒酶可将端粒的重复序列加到端粒末端，在缺少端粒酶的情况下，每一轮的DNA复制都留下50-200bp的未复制的DNA 3'末端。大多体细胞中缺乏端粒酶，DNA合成的这种特点导致细胞的复制衰老理论，当细胞具有一个或多个短的端粒时就导致它的衰老。
细胞凋亡检测方法的比较和选择（二）关键词：细胞蛋白酶试剂标准物质北京标准物质网 一、PI-Annexin V 优点：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏，不需固定细胞，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。 缺点：需要流式检测，设备要求高，操作难度高。 二、caspase-3 优点：①不同细胞在凋亡早期均出现caspase-3蛋白高表达，本方法具有普遍意义：②在蛋白酶级联切割过程中，caspase-3处于核心位置；③本法可用于各种培养细胞凋亡诱导研究，而且灵敏度高，特异性强，与其他已知的caspases 无交叉反应。 缺点：①在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降，因此本法对于凋亡晚期灵敏度较差；②本法对特定样本中的检测下限随凋亡过程的动力学、诱导凋亡的试剂，以及在细胞总数中受影响的细胞数而不同。 三、线粒体膜势能的检测 优点：①早期检测细胞凋亡；②可用来检测各种细胞类型包括单核细胞和神经细胞，以及完整组织和纯化的线粒体；③检测灵敏度强。 缺点：①操作步骤复杂，设备要求高，费用高；②不能说明细胞凋亡的机制，需结合其他凋亡检测方法进行综合分析(如caspase、形态学、生化)。 四、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 优点：在细胞凋亡早期均出现TFAR19蛋白高表达和核转位，荧光染色定位显示清晰，便于区分凋亡细胞和正常细胞，同时伴随细胞形态学的变化，并持续较长时间，为研究细胞凋亡期所发生的时间提供一项新型技术和指标。不同细胞在凋亡早期均会出现TFAR19蛋白高表达和核转位，因此可以广泛应用于检测不同种类的凋亡细胞，具有普遍意义。
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。
细胞凋亡机制的研究及其意义 摘要: 细胞凋亡是维持神经系统正常发育, 维持其免疫系统正常功能所必需过程。目前, 对细胞凋亡的研究已经成为生命科学领域研究的热点。本文就细胞凋亡的发生机制、基因调节机制等方面作一综述。 关键词: 细胞凋亡; 机制；意义 引言：细胞凋亡对机体的健康发育甚为重要，在生理条件下，它作为机体正常细胞群生长与死亡相协调的重要方式，有利于清除多余的细胞、无用细胞、发育不正常细胞、有害细胞、完成正常使命的衰老细胞；有利于维持机体细胞群的自身稳定，从而维持器官组织的正常发育。细胞凋亡过少时，机体易患肿瘤性疾病、自身免疫性疾病；细胞凋亡过多时，机体易患神经系统方面的疾病。人的艾滋病等疾病之所以发生，主要是由于机体细胞凋亡发生异常的结果。 正文： 1、细胞凋亡机制 1.1 信号传递机制 凋亡一般由细胞外的调节因素与其在细胞表面的受体结合而启动。经活化的受体又启动胞内第二信号系统，激活核酸内切酶，引起DNA裂解，进而引发细胞凋亡。细胞外的调节因素包括生理活性因子：如肿瘤坏死因子、转化生长因子及表皮生长因子等；非生理因素：如X射线、紫外线、一氧化氮、毒素及化疗药物等；感染因素：如EB病毒、腺病毒及HIV病毒等。有学者认为，细胞凋亡的信号传导能使用或部分利用细胞增殖和分化过程中的传统信号途径。传统信号途径包括G 结合蛋白信号途径和酶蛋白信号途径，前者可以调节第二信使cAMP和钙离子的生成，细胞内cAMP和钙离子浓度的变化可以对细胞凋亡产生影响；后者可通过酪氨酸蛋白激酶（PTK）、Ras-MAPK或JaK-STAT等途径参与凋亡信号的传导。但众多研究表明可直接启动细胞凋亡的信号途径或死亡信号途径是两种死亡因子，即肿瘤坏死因子和Fas配体与细胞膜表面的相应受体TNF受体和37? 结合以后所发生的凋亡反应。目前对TNF和FasL与相应受体结合所介导的细胞凋亡信号途径及其机制已取得了突破性进展 1.2 酶学机制 1.2.1 caspases蛋白酶 胱冬蛋白酶（caspases）是近几年研究的热点之一，属于ICE/CED3蛋白酶家族成员，目前发现至少有14种之多,分别命名为caspases1-caspases14。与细胞凋亡密切相关，它是通过级联反应，最终激活核酸内切酶来实现的。也有人认为凋亡并不总是引起caspases的释放，而caspases的释放也并不总是引起凋亡，很可能还与细胞的迁移和分化有关.。蛋白酶前体可在天冬氨酸位点上被切断成3部分，H2N端是抑制区域被移去，另一端COOH端断裂成一大一小亚单位
细胞凋亡在医学上的应用 （专业：动物遗传育种与繁殖） 摘要：细胞凋亡是细胞的自杀过程，通过自杀方式去除体内非必需细胞或即将发生变异的细胞，细胞凋亡不同于创伤性死亡，它可以帮助人类预防诸如癌症和自身免疫性疾病。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，凋亡过程的紊乱与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如早老性痴呆症、帕金森症、舞蹈症肿瘤，自身免疫性疾病等。研究表明，多种人类恶性肿瘤细胞具有较低响应生理刺激而经历凋亡的能力[1]。因此，诱导癌变细胞凋亡被看作是一种新的癌症治疗方法[2]。开发各种有效提高细胞凋亡能力的试剂——细胞凋亡诱导剂，可能是最有前途的治疗癌症的策略。许多抗癌药，如adrlamycin，vinblastin和紫杉醇等，都可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗癌症。细胞凋亡异常在肿瘤特别是肝癌发生中具有重要作用。 正文：细胞凋亡在免疫学和临床医学中的应用中受到广泛应用，在免疫学中研究胸腺细胞成熟过程中的凋亡及活化诱导的细胞死亡较为突出，细胞凋亡在临床医学中，发现HIV病毒感染造成CD4+细胞减少是通过细胞凋亡机制，同时，从细胞凋亡角度看，肿瘤的发生是由于凋亡受阻所致，更为重要的细胞凋亡的研究将给自身免疫病带来真正的突破。 最新研究进展 蛋白尿促肾小管细胞凋亡机理：武汉大学中南医院肾病内科李晓宁博士经多年研究发现，蛋白激酶C－delta在蛋白尿中表达升高，会成为尿蛋白诱导肾小管细胞死亡的“元凶”，如成功抑制，有望避免致肾小管细胞死亡的现象。研究人员发现，肾病水平的蛋白尿可以在体内和体外诱导肾小管细胞凋亡，他们同时发现细胞凋亡的早期特征性事件以及晚期特征性事件等，从而分别从细胞水平，亚细胞水平、DNA水平和蛋白质水平证实了白蛋白对肾小管细胞的直接毒性作用。为找到治疗手段，研究人员分别用化学药物和基因转染的方法，成功抑制了蛋白尿诱导的肾小管损伤。李晓宁认为，这一结果在蛋白激酶C－delta基因敲除的蛋白尿小鼠模型中得到证实，这表明医学界有望在进一步研究中通过药物控制蛋白激酶C－delta水平，以彻底消灭蛋白尿引起的肾小管损伤[3]。 ( 发现细胞凋亡开关有助癌症治疗：美国科罗拉多大学博尔德分校的研究小组通过研究线虫，首次发现引起细胞凋亡的“开关”，此项研究结果可用于治疗人类由于“非正常细胞凋亡”引起的癌症等疾病。研究小组利用线虫的半胱天冬酶（ caspase ）进行试验。半胱天冬酶是细胞凋亡的“酶刽子手”，因为它的主要作用就是切断和破坏细胞的蛋白质。但是，研究小组在试验中发现半胱天冬酶对Dicer酶具有不同的作用，当半胱天冬酶分裂 Dicer酶后，它并没有杀死Dicer 酶，而只是改变了 Dicer酶的功能（ Dicer酶是一种RNA切割酶），Dicer酶开始分裂染色体，并杀死细胞。这个实验首次表明，利用半胱天冬酶分裂Dicer 酶（这是一种RNA切割酶），可以改变Dicer酶的功能，使其转变为DNA切割酶."
细胞凋亡 细胞凋亡是指由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，由于细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常称为细胞编程性死亡（programmed cell death,PCD）。具体指细胞遇到内、外环境因子刺激时，受基因调控启动的自杀保护措施，包括一些分子机制的诱导激活和基因编程，通过这种方式去除体内非必需的细胞或即将发生特化的细胞。例如，蛙的个体发育过程中，四肢的形成过程中尾巴消失等现象，都涉及细胞的自动死亡。 在形态学上把细胞凋亡分为三个阶段：第一个阶段是凋亡的开始，此阶段只是进行数分钟，细胞中所表现的特征是：微绒毛消失，细胞间接触消失，但是质膜保持完整性，线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并与质膜发生融合，染色质固缩等等；第二阶段是形成凋亡小体，核染色质发生断裂，形成许多的片段，与一些细胞器聚集在一起，然后被细胞质膜包围，形成凋亡小体；第三阶段是凋亡小体被吞噬细胞所吞噬，而其残留物质被消化后重新使用。细胞凋亡是一个主动性自杀过程，所以它是一个耗能的过程，需要ATP提供能量。 【细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。 人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡（apoptosis）。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。 凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程 在不同的情况下，细胞凋亡的信号转导途径是有差别的，根据对caspase家族（半胱氨酸蛋白酶，它们的活性位点均包括半胱氨酸残基，能够特异的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，目前已有１３种caspase成员被先后发现或克隆，其中６种caspase与细胞凋亡有关）的依赖性可分为两大类型。一类称为外在途径，由细胞表面的死亡受体，如Ｆａｓ和肿瘤坏死因子受体家族（ＴＮＦ－Ｒ）引发，死亡受体与配体结合后，通过跨膜信号转导把死亡信号转导入细胞内死亡域，进而引起caspase联级反应；另一类称为内在途径或线粒体途径，由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所表１细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或外界因素的巨变如高温、强压等范围单个分散的细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体破损，通透性增加染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化，保持完整
基因与长寿g J Immunol：阿克巴尔等发现控制白血细胞老化新机制 作者：何屹来源：科技日报2011-8-24 据美国每日科学网站报道，英国研究人员发现了一种可控制白血细胞老化的新机制，可扭转免疫系统衰退，提高老年人的免疫力。 随着年龄的增长，老年人免疫系统的效率开始下降，因而容易感染重症。这对他们的生活健康构成了威胁，也使其生活质量明显下降。 由伦敦大学学院阿恩·阿克巴尔教授领导的研究小组发现，人类免疫系统逐渐衰弱的原因是由于每次感染后会有一定比例的白血细胞失活。虽然这种机制是进化而来，可以起到预防某些癌症的作用，但随着失活的白血细胞的比例不断提高，人体的防御系统也被削弱。 研究表明，白血细胞失活是由一种尚不确定的免疫系统老化机制所导致。此前科学家认为，免疫细胞老化与染色体端粒的长度有关。随着白血细胞的不断增殖，染色体端粒不断缩短，直至最后细胞永久失活。这意味着，免疫细胞有一种内置的寿命机制。随着人类寿命的延长，免疫细胞将无法提供有效的保护。 阿克巴尔教授的研究小组在采集的血液样本中发现，一些失活的白血细胞却有着较长的端粒，这表明白血细胞失活存在其他机制。而更令人兴奋的是，这些有着较长端粒的白血细胞不会处于永久失活状态。 当研究人员阻断在实验室中新确定的白血细胞的某个途径时发现，白血细胞可以被重新激活，而阻断该途径的药物早已被开发出来，用于治疗其他疾病。所以研究人员下一步将研究重新激活老年人的白血细胞会带来什么好处。 研究人员表示，虽然这种方法还不能让人类永葆青春，但它可以提高老年人的免疫力，帮助老年人战胜各种感染性疾病。此外，该研究还深化了人类对细胞生物学的认识，为控制人类的免疫系统开拓出全新的无法预见的未来，对提高人类的生活质量价值重大。 Nature：节食真能使人更长寿？ 作者：何嫱来源：生物通2011-5-13 17:50:02分享到： 2 关键词：信号通路节食衰老 众所周知节食在如线虫、酵母、果蝇与啮齿动物等多种模型生物中可以延长寿命，延迟衰老相关疾病发生。虽然在寿命延长中发挥作用的若干关键因素已被识别出来，但人们对于协调生物代谢反应的信号却知之甚少。 近日由美国佛罗里达州斯克里普斯研究院的科学家领导的一个研究小组证实一条调控营养吸收和能量平衡生物信号可影响线虫寿命的长短。这一研究发现在线发布在5月12日的《自
细胞衰老的分子生物学机制 衰老是机体退化时功能下降及生理紊乱的综合表现。衰老与机体的多种疾病有着密切的关系，是当前生物医学界研究的热门话题。机体衰老与细胞衰老密切相关，细胞衰老是指细胞生理功能的衰减。衰老在组织细胞水平上表现为DNA、蛋白质、脂类及细胞器等的损伤和有害物质积累。本篇文章对衰老的分子水平研究进行综述。 一、细胞衰老相关假说 随着衰老研究的发展，学者们提出了越来越多的有关衰老机制的学说：端粒假说，氧自由基学说、神经内分泌学说、DNA损伤修复学说、细胞凋亡学说、分子交联学说、失衡中毒学说以及生物膜损伤学说等。【1】 二、细胞衰老相关信号通路 目前研究最多的与细胞衰老相关的信号通路有p53-p21-pRb【2】和p16-pRb通路，【3】SIRT1通路，胰岛素/IGF-1通路，mTOR通路等。与细胞衰老相关的分子参与这些信号通路进行细胞衰老的调控。 三、细胞衰老相关基因 人类衰老相关基因大多是抑癌基因、原癌基因或静止期细胞表达的基因。诸如P16、P21、P53、P33、PTEN、Rb，ras、raf、c-jun、c—fos、myc、bcl—2、cyclinDl等基因。人类“长寿基因”与“衰老基因”相比模式更为复杂，且绝非一种基因在起作用，可能是一个基因群。犹如癌基因与抑癌基因．凋亡与抗凋亡基因，一正一负、既联系又制约，调控衰老的进程。【4】
四、细胞衰老相关RNA IncRNA参与细胞衰老调控的机制包括：参与细胞周期的调控、调控端粒长度、参与表观遗传学调控。同时，IncRNA还参与了衰老相关重要信号通路的调控，如p53/p21,与许多衰老相关重大疾病密切相关。【5】 MicroRNA(miRNA)是一类在基因转录后水平发挥重要调控功能的非编码单链小分子RNA。近年来随着研究的深入，发现miRNA可以通过调控衰老信号通路中的蛋白,调节端粒酶逆转录酶的活性从而调节端粒酶的活性和端粒长度，调节活性氧自由基的生成以及调节线粒体的氧化损伤等多种途径来调控细胞衰老的过程。【6】 五、衰老有关因子 1、p21是细胞周期抑制因子,活化的p53转录激活p21表达,是引发细胞衰老的重要分子通路；p21是p53肿瘤抑制作用中的主要决定因子,在肿瘤中的表达降低。p21缺失不会促进肿瘤形成。【7】 2、CKI分为两类:一类为INK4即pl6家族。包括 p15、pl6、pl8 和pl9,这些蛋白均含有独特的4级锚蛋白结构(ankyrin),能特异性地抑制cyiclnD-CDK4/6-RB的磷酸化过程;另一类为CIP/KIP即p21家族,包括p21、p27和p57,对CDK有广泛抑制作用。cyclin过表达或CKI失活均可引起细胞增殖失控,使细胞持续性增殖向恶变发展。【8】 3、BRCAI(DNA损伤修复因子/肿瘤抑制因子)功能缺陷导致DNA损伤以及基因组不稳定, 并由此激活ATM/CHK2/p53( DNA损伤修复反应途径)通路 ,进而触发细胞周期阻滞/细胞凋亡/细胞老化,加速生物
第十三章细胞衰老、死亡与癌变 第三节细胞凋亡的分子机理 细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。 细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 一、凋亡相关的基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 1．Caspase家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶；③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE 亚族和CED-3家族（图13-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。 细胞中还具有caspase的抑制因子，称为IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）[3]与caspase结合，抑制其活性，如XIAP。
衰老的分子生物学 姓名：学号：单位：邮箱：
衰老的分子生物学 摘要：衰老是生命过程中一种复杂的现象。细胞是大部分生物的基本构成单位，生命过程就是细胞代谢过程。而多细胞生物又有两种细胞组成，一类为能自我分裂繁殖的干细胞，一类为不分裂的功能细胞。干细胞有一定的分裂次数，及说明它存在潜在的衰老过程；功能细胞的代谢功能失调时就会出现衰老。而细胞的衰老也将导致组织、器官和整体的衰老。 关键词：细胞；衰老；机制；抗衰老 一、衰老的概念及表现 在生命过程中，随着年龄的增加，整个生物机体的形态、结构和功能逐渐衰退，有机体死亡的可能性增大，这一现象称为衰老。『1』人体衰老的形体特征是皮肤松弛褶皱、毛发灰白与稀疏、出现老年斑、牙齿和骨质变质、性腺与肌肉萎缩、血管硬化、肺和气管萎缩、细胞及核酸分子结构异常；功能特征是视力和听力降低、记忆力和思维能力逐渐下降、反应迟钝、行动缓慢、适应能力低、心肺功能下降、代谢功能失调、免疫力下降、出现老年性疾病。『2』细胞衰老的结构变化有细胞核增大、核膜内折、染色质固缩化、核仁裂解为小体、内质网总量减少且排列有序性下降、线粒体数量减少、致密体形成、膜流动性降低、细胞链接减少；生理变化有胞内水分减少、代谢速率减慢、呼吸速率减慢。『3』 二、细胞衰老的分子机制 （一）衰老的基因学说 衰老基因学说是基于遗传学说而研究的。这种学说认为各种生物的自然寿命是由各自的遗传基因所决定的，遗传基因中可能有一种特定的“衰老基因”，专门控制衰老进程。生物成年后。基因组内衰老基因开放。其表达产物或可特异地决定生物的寿命和衰老进程。在利用动物模型研究衰老机制中己发现许多与衰老相关基因，并且研究了与衰老有关的增殖基因、衰老基因、长寿基因和凋亡基因等。『4』通过分子学研究Johnson（1990）最先由线虫分理出长寿命变异体age-1。随后其它生物体的研究又相继发现了daf2等十多种长寿基因和短寿基因。通过突变，daf2的活性时，可是线虫的寿命延长一倍，已知daf2基因本身具有减慢机体代谢的作用。 (二)衰老的端粒学说
miR-17在细胞衰老中的表达变化 课题研究：王怡丹 指导教师：符永兰（北京师大二附中） 王苗（北京师范大学生命科学学院） 该文获2010年西城区科技创新大赛二等奖 摘要: miRNA（全称microRNA，通用简称是miRNA，以下简称miRNA，miR-17是13号染色体长臂上的miRNA）是一种长约22个碱基的小RNA,近些年来miR-17被报道在许多肿瘤中表达上调。但miR-17在衰老细胞中的表达还没有报道。目的:本实验的目的是建立年轻和衰老的WI38细胞系,检测已知在多种肿瘤中高表达的miR-17细胞衰老中的表达情况。方法:通过传代培养细胞，细胞计数确定细胞代数，β-Gal染色检测细胞是否衰老。用Trizol试剂提取细胞的总RNA,逆转录获得cDNA 模板。最后通过实时定量PCR比较miR-17在年轻和衰老细胞中的表达。结果:构建了年轻和衰老的WI38细胞系，发现与在肿瘤细胞中相反，衰老细胞中miR-17的表达水平显著降低。这一结果预示miR-17可能同时参与细胞衰老和肿瘤的发生发展。 一、综述 （一）细胞衰老 1.细胞衰老概述 衰老是一种有机体的死亡危险随年龄增加而增大的现象，是生命的基本现象，也是生物界的普遍规律。随着衰老研究及分子生物学的迅猛发展，人们对衰老的探究已经逐渐深入到细胞、基因及分子水平。 1961年，L.Hayflick做过这样的实验，体外培养的人体某种细胞，最多分裂50次左右就停止分裂了，并且丧失了正常的功能[1]。这种原来具有分裂能力的细胞随着整体年龄增长而减缓或停滞分裂的现象叫做细胞衰老。成纤维细胞WI38是研究细胞衰老的经典模型。 衰老细胞与年轻细胞相比，在形态结构和生理生化反应上会出现明显的变化，主要表现在膜透性及脆性增加，核膜内陷，核增大，核中染色质凝聚、破碎，线粒体数量减少，胞内脂褐素等异常物质沉积等。在pH=6时，衰老细胞的酸性β-半乳糖苷酶染色呈阳性。 2.细胞衰老的机制 从诱因来看衰老一般分为复制型衰老和过早型衰老两种，由于细胞分裂增殖进而端粒缩短或端粒机构的破坏而引起的人类和某些物种细胞的衰老称为复制型衰老，这是人类和某些物种细胞衰老的主要机理[2]。由外界因素诱导比如，离子辐射，氧化胁迫，某些肿瘤抑制因子和癌基因的过表达诱导的衰老称为过早型衰老。 3.细胞衰老与肿瘤的关系 细胞衰老是细胞经历的不可逆的生命过程，在这个时期里，组成细胞的化学物质在运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤，造成退化时期生理功能下降和紊
细胞衰老的分子生物学机制衰老是机体退化时功能下降及生理紊乱的综合表现。衰老与机体的多种疾病有着密切的关系，是当前生物医学界研究的热门话题。机体衰老与细胞衰老密切相关，细胞衰老是指细胞生理功能的衰减。衰老在组织细胞水平上表现为DNA、蛋白质、脂类及细胞器等的损伤和有害物质积累。本篇文章对衰老的分子水平研究进行综述。 一、细胞衰老相关假说 随着衰老研究的发展，学者们提出了越来越多的有关衰老机制的学说：端粒假说，氧自由基学说、神经内分泌学说、DNA损伤修复学说、细胞凋亡学说、分子交联学说、失衡中毒学说以及生物膜损伤学说等。【1】 二、细胞衰老相关信号通路 目前研究最多的与细胞衰老相关的信号通路有p53-p21-pRb【2】和p16-pRb通路，【3】SIRT1通路，胰岛素/IGF-1通路，mTOR通路等。与细胞衰老相关的分子参与这些信号通路进行细胞衰老的调控。 三、细胞衰老相关基因 人类衰老相关基因大多是抑癌基因、原癌基因或静止期细胞表达的基因。诸如P16、P21、P53、P33、PTEN、Rb，ras、raf、c-jun、c—fos、myc、bcl—2、cyclinDl等基因。人类“长寿基因”与“衰老基因”相比模式更为复杂，且绝非一种基因在起作用，可能是一个基因群。犹如癌基因与抑癌基因．凋亡与抗凋亡基因，一正一负、既
联系又制约，调控衰老的进程。【4】 四、细胞衰老相关RNA IncRNA参与细胞衰老调控的机制包括：参与细胞周期的调控、调控端粒长度、参与表观遗传学调控。同时，IncRNA还参与了衰老相关重要信号通路的调控，如p53/p21,与许多衰老相关重大疾病密切相关。【5】 MicroRNA(miRNA)是一类在基因转录后水平发挥重要调控功能的非编码单链小分子RNA。近年来随着研究的深入，发现miRNA可以通过调控衰老信号通路中的蛋白,调节端粒酶逆转录酶的活性从而调节端粒酶的活性和端粒长度，调节活性氧自由基的生成以及调节线粒体的氧化损伤等多种途径来调控细胞衰老的过程。【6】 五、衰老有关因子 1、p21是细胞周期抑制因子,活化的p53转录激活p21表达,是引发细胞衰老的重要分子通路；p21是p53肿瘤抑制作用中的主要决定因子,在肿瘤中的表达降低。p21缺失不会促进肿瘤形成。【7】 2、CKI分为两类:一类为INK4即pl6家族。包括 p15、pl6、pl8 和pl9,这些蛋白均含有独特的4级锚蛋白结构(ankyrin),能特异性地抑制cyiclnD-CDK4/6-RB的磷酸化过程;另一类为CIP/KIP即p21家族,包括p21、p27和p57,对CDK有广泛抑制作用。cyclin过表达或CKI失活均可引起细胞增殖失控,使细胞持续性增殖向恶变发展。【8】 3、BRCAI(DNA损伤修复因子/肿瘤抑制因子)功能缺陷导致DNA损伤以及基因组不稳定, 并由此激活ATM/CHK2/p53( DNA损伤修复反应