成都中医药大学
硕士学位论文
参术胶囊调控脾虚胃癌转移鼠动物模型细胞外基质降解相关基
因表达的研究
姓名：叶冰
申请学位级别：硕士
专业：方剂学
指导教师：彭成
20040401
成都中医药大学硕士学位论文
中文摘要
目的：研究参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠动物模型的细胞分化及细胞外基质降解相关基因表达的作用，探讨参术胶囊对脾虚胃癌转移的作用机理，从而拓展实验肿瘤学研究的新领域，为肿瘤的发生发展变化规律及抗癌中药复方作用机理的研究提供新思路。
方法：取ＢＡＬＢ／ｏ－ｎｕ／ｎｕ小鼠，采用偏食法建立脾气虚证动物模型，用外科原位移植方法（ＳＯＩ）将经传代（四代）培育后生长的ＳＧＣ７９０１胃癌组织块植入ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ小鼠胃浆膜下，建立脾虚胃癌转移鼠病证结合动物模型。采用腿染色及免疫组织化学的方法研究参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠动物模型的细胞分化及细胞外基质降解相关基因汹舻２、Ｍ卿９、ＴＩＭＰＩ、ＴＩＭＰ２、ｕＰＡ及ＰＡｌ—１）表达的调控。
结果：脾虚胃癌转移鼠动物模型稳定可靠，参术胶囊对胃癌细胞分化以及对细胞外基质降解相关基因（ＭＭＰ２、ｌ嘲网、ＴＩＭＰＩ、ＴＩＭＰ２、ｕＰＡ及ＰＡＩ—１）的表达有明显调控作用。
结论：用本文所述方法可复制出稳定的病证结合的脾虚胃癌转移鼠动物模型：参术胶囊能抑制脾虚胃癌转移鼠的肿瘤转移，其机制可能是诱导肿瘤细胞的重新分化及调节细胞外基质降解相关基因的表达。
关键词：参术胶囊脾虚胃癌转移鼠动物模型细胞外基质基因
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ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｂｏｕｔｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ）ｕｐｏｎＳｐｌｅｅｎＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ＆ＳｔｏｍａｃｈＣａｎｃｅｒｍｅｔａｍｏｕｓｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｗｉｔｈＳｈｅｎｚｈｕｃａｐｓｕｌｅｓ．ＷｉｔｈｉｔｔｏｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＳｈｅｎｚｈｕｃａｐｓｕｌｅｔｏＳｐｌｅｅｎＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ＆ＳｔｏｍａｃｈＣａｎｃｅｒｍｅｔａｍｏｕｓｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ．Ｔｈｕｓｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｔｈｅｎｅｗｆｉｅｌｄｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｏｎｃｏｌｏｇｙｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｗａｎｔｉｎｇｔｏｏｆｆｅｒｎｅｗｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｖａｒｉａｔｉｏｎｆｏｒｔｕｍｏｒａｎｄｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅｃｏｍｐｏｕｎｄｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＥｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｏｆＳｐｌｅｅｎ—ＱｉＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙｗｉｔｈｆｅｅｄｉｎｇｅｘｃｅｓｓｉｖｅｓｏｕｒｎｅｓｓｉｎ剖Ｌ叫ｃ－ｎｕ／ｎｕｍｉｃｅ．ｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｔｈｉｓｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｐｌａｎｔＳＧｃ７９０１ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｓｖｉｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇａｆｔｅｒｆｏｕｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｕｎｄｅｒｓｔｏｍａｃｈｃｈｏｒｉｏｎｏｆＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕｍｉｃｅｗｉｔｈＳＯＩｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄＳｐｌｅｅｎＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ＆ｓｔｏｍａｃｈｃａｎｃｅｒｍｅｔａｍｏｕｓｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ．Ｕｓｅｄ脏ａｎｄｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｍｍｕｎｅ—ｔｉｓｓｕｅｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｏｆｒｅｌｅｖａｎｔｌｙｇｅｎｅｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｅｓ（ｍ口２、加旧９、ＴＩ肝ｌ、ＴＩ肝２、ｕＰＡ及ＰＡＩ—１）ｏｆＳｈｅｎｚｈｕｃａｐｓｕｌｅｓｔｏｃｅＩｉ黼藿ＦｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＥ例ｏｆＳｐｌｅｅｎｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ＆ＳｔｏｍａｃｈＣａｎｃｅｒｍｅｔａｍｏｕｓｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓ．’．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＳｐＩｅｅｎＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ＆ＳｔｏｍａｃｈＣａｎｃｅｒｍｅｔａｍｏｕｓｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＳｈａｎｚｈｕｃａｐｓｕｌｅｃｏｕｌｄｐｒｏｈｉｂｉｔｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｄｊｕｓｔｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＥｃ＾Ｉｏａｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｒｅｌｅｖａｎｔｌｙｇｅｎｅｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰｌ、ＴＩＭＰ２、ｕＰＡ及ＰＡＩ－Ｉ）．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ：ＴｈｅＳｐｌｅｅｎＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ＆ＳｔｏｍａｃｈＣａｎｃｅｒｍｅｔａｍｏｕｓｅａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｃａｎｂｅｄｕｐｌｉｃａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｈａｓｂｅｅｎｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｎｔｈｅｃｏｎｔｅｘｔ：ＳｈｅｎｚｈｕｃａｐｓｕｌｅｃａｒｌｐｒｏｈｉｂｉｔｔｈｅｋｎｕｂｂｌｙｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆＳｐｌｅａｎＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ＆ＳｔｏｍａｃｈＣａｎｃｅｒｍｅｔａｍｏｕｓｅ．ａｎｄｉｔ’ｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｂｅｉｎｄｕｃｔｔｈｅｒｅ－ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌａｎｄａｄｊｕｓｔｔｈｅｒｅｌｅｖａｎｔｌｙｇｅｎｅｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｅｓｏｆｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＥＣＭ．
ＫｅｙＷｏｒｄｓ：ＳｈｅｎｚｈｕＣａｐｓｕｌｅ，ＳｐｌｅｅｎＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ＳｔｏｍａｃｈＣａｎｃｅｒ，Ｍｅｔａｍｏｕｓｅ，ＡｎｉｍａｌＭｏｄｅｌ，Ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘ，Ｇｅｎｅ
’
２
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引言
癌症是影响人类健康的重大疾病，而胃癌是常见的恶性肿瘤。全世晃死于癌症的６３０万人中，７７．６万为胃癌，仅次于肺癌，占第２位。在我国，胃癌为农村癌症发病率之首，城市仅次于肺癌位居第２。面对这一严峻的现实，使得肿瘤工作者更积极地探索多学科综合治疗，特别是中西医结合治疗ＩｌＪ。
胃癌的发病机理至今未明，目前认为可能与饮食、环境因素、以及幽门螺旋杆菌感染的因素有关口】。其临床表现在早期一般为消瘦、食欲不振、上腹不适、腹泻、乏力等症状，到了中晚期则发展为呕血和黑便等症状，同时以出现腹部肿块或转移灶的症状为主。纵观胃癌的症状，无不包含着正虚邪实两个方面，所以中医认为胃癌之生系饮食失节，忧思过度，脾胃受损，运化失常，气滞痰凝，气、痰、瘀、毒至结而成。即脾胃虚弱导致胃癌的形成，而胃癌的发生发展又加重了脾虚症状。导师彭成研究员通过大量的理论分析与实验研究得出“脾虚是胃癌发生和转移的内在因素”这一论点。目前脾虚与胃癌的关系已得到广大学者的认同，根据中医理论及治疗原则，稿床对于脾虚胃癌的病证多从调理脾胃入手，在治则治法上采用益气健脾，扶正培本之法，具体方药上多用具有益气健脾作用的参术膏、四君子汤、参苓白术散等复方取得较好的治疗效果。其中，参术膏（现为参术胶囊）是最基本的代表方剂。但未见中药复方治疗脾虚胃癌的作用机理研究，。未见中药复方调控脾虚胃癌基因表达的研究。
要进行中药复方作用机理的研究，就必须复制相对稳定的动物模型‘３Ｈ引。脾虚证动物模型目前有以下几种类型［９１：泻下法、偏食法、饮食失节法、综合法、现代医学的病理模型。胃癌动物模型主要有以下三类：一是早期的以黄曲霉素【１０】和甲基胆蒽（３－ＭＣ）【¨】为代表的碳氢化含物，以及现在广泛使用的以２一乙基亚硝胺（ＤＥＮＡ）ｌ引，Ｎ＿甲基硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）［１３ｑ４１为代表的亚硝基化合物等的单因素或多因素联合攻击化学诱癌法【”。６１建立的胃癌及胃癌癌前病变模型；二是同种或异种胃癌的非原位移植法和原位移植法等移植性胃癌模型；三是胃癌
转移模型，包括自发性转移和实验性转移‘１刀模型。但未见脾虚胃癌转移鼠动物模
。１
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型的研究报道。
现代分子生物学研究表明，人类基因的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。中医认为由脾虚发展到胃癌需要一个漫长而复杂的阶段，而在这一过程中除了我们宏观上观察到的能反映脾虚证的消瘦、食欲不振、上腹不适、腹泻、乏力等症状，以及到了中晚期的呕血、黑便、出现腹部肿块或转移灶的症状外，一定也有基因水平的变化，如目前经常检测的癌基因ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ．２、ｒａｓ及ａｋｔ．２等基因，抑癌基因有ｐ５３、ｐ１６、Ｒｂ、ＡＰＣ和ｎｍ２３等基因，其中ｍｅｔ和ｒｉｔ￥基因的过量表达发生在癌变早期，ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ一２及ａｋｔ－２基因扩增与肿瘤的快速生长有关，ｎｍ２３和ｐ１６基因缺失或表达水平降低与瘤细胞恶性表型密切相关，ｂｃｌ。２基因可以抑制细胞凋亡，Ｂａｘ基因则促进细胞凋亡，野生性ｐ５３可促进细胞凋亡，突变型ｐ５３可抑制野生型ｐ５３，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。特别是在肿瘤的侵润、转移中，肿瘤细胞要穿越组织自然屏障向身体各韶位移动，则需产生或诱导产生蛋白酶类以降解细胞外基质。因此与细胞外基质降解相关的一些基因（ＭＭＰ２、ｌＩＭＰ９、ＴＩＭＰｌ、ＴＩＭＰ２、ｕＰＡ及ＰＡＩ－１）成为了肿瘤研究的一大热点。但未见中药复方调控胃癌细胞外基质降解相关基因表达的研究报道。
因此，本课题的目的就是在建立脾虚胃癌转移鼠动物模型研究的基础上，探索
～
参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠的癌细胞分化以及细胞外基质降解相关基因表达的调控作用，以期从细胞、基因水平上揭示中药用于肿瘤治疗的作用机理，开辟中医药抗肿瘤转移研究的新领域。
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实验研究
参照导师彭成的偏食脾虚造模法“１和Ｈｏｆｆｍｎｎ的ＳＯＩ转移鼠造模法“８１建立脾虚胃癌转移鼠动物模型。通过一般状态观察、病理切片、侵润转移相关基因等研究参术胶囊对脾虚胃癌转移鼠的作用机理。
１实验材料
１．１实验动物
ＢＡＬＢ／ｃ—ｎｕ／ｎｕ裸鼠１０８只，ＳＰＦ动物，雌雄均有，８周龄。由成都中医药大学实验动物研究中心提供。生产许可证号；第０４—１２号，检疫后备用。
１．２造模瘤源
人胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１悬液（３×１０６）由华西肿瘤研究所提供。
１．３实验药物
山西白醋，由山西老陈醋集团有限公司生产，酸度３．５９／ｌＯＯｍｌ，标准代号ＧＢｌ８１８７—２０００液态发酵。
５一氟尿嘧啶，规格：０．２５９／ｌＯｍｌ，由天津金耀氨基酸有限公司生产，批号０３０７０１２，配制：１２ｍ１５－Ｆｕ加无菌水至ｌＯＯｍｌ（１００ｍ１：３００ｍｇ）。
胃复春胶囊，规格：０．３７９／片，由杭州胡庆余堂药业有限公司生产，批号０３０７１７，配制：２９片（１０．７３９）碾为细末加无菌水溶解为７２．５ｍｌ。
参术胶囊，由成都中医药大学药学院提供，淡黄色颗粒，每克提取物含ｌＯｇ原生药，批号２００１０９０１，配制：低剂量为３．３９加无菌水溶解为ｌＯＯｍｌ：中剂量为６．６９加无菌水溶解为ｌＯＯｍｌ；高剂量为１３．２９加无菌水溶解为ｌＯＯｍｌ。
１．４实验试剂
ＴＩＭＰＩ（Ｈ一１５０），ｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌＩｇＧ，购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。
ＴＩＭＰ２（Ｉ｛－１４０），ｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｅｌｏｎａｌＩｇＧ，购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。
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ＭｍＰ２（Ｃ－１９），ｇｏａｔｐｏｌｙｃｌｏｎａ］ＩｇＧ，购自ＳａｎｔａＣｒｕＺ公司。
ｕＰＡ（Ｍ一２０），ｇｏａｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌＩｇＧ，购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。
ＰＡＩ一１（Ｈ－１３５），ｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌＩｇＧ，购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司。
ＭＭＰ９，ｒａｂｂｉｔａｎｔｉｌｉ穗ＩＰ－９（Ａｂｌ），ＢＡ０５７３，购自武汉博士德生物手投术有限公司。
相应二抗及试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。
１．５仪器设备
ＣＢ３２０１数字描记式小动物活动观测仪中国Ｊ｜Ｉ北电子工业公司
电子天平ＰＡ２００３上海天平仪器厂
ＢＸ５０光学显微镜日本
Ｏｌｙｍｐｕｓ
ＭＩＡＳ－－２０００型图像分析系统四川大学图像图形研究所１．６实验设施
ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅｃｏｎｄｍｏｌｌ）实验动物屏障系统，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，实验动物设施环境符合ＳＰＦ级标准，使用许可证号：第０４－－０５０号。
２实验方法
２．１脾虚胃癌转移鼠动物模型的建立及分组处理
取ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ裸鼠１０８只。实验第ｌｄ将ＳＧＣ．７９０１悬液接种于２只裸鼠腋下（Ｏ．２ｎ：ｌｌ／Ｒ），培育胃癌组织块，待胃癌组织块长成ｌｃｍＸ１ｃｍ大后将此胃癌组织块传代培育至实体瘤，本次实验传至第四代时待其长成ｌｃｍＸｉｃｍ大备用（８周）。其余自由摄食无菌全价颗粒饲料，第９周开始将其余１００只裸鼠造脾虚证动物模型，实验前禁食３６ｈ后，首次灌胃以山西白醋按１５ｍｌ／ｋｇ／ｄ，以后按１０ｍｌ／ｋｇ／ｄ灌胃６ｄ；第ｌＯ周时，在严格无菌操作条件下进行手术造胃癌转移动物模型，即在手术第１天用戊巴比妥钠４０ｍｇ／ｋｇ腹腔麻醉下，手术视野皮肤消毒，并在裸鼠剑
６
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突下开～０，７ｃｍ．１ｃｍ长纵向切口，找到胃，在腺胃处切开浆膜并用荷包缝合法缝入［１９１前述传至第四代的胃癌组织块０１×０．１ｃｍ后，关闭腹腔。实验过程在ＳＰＦ动物实验室内进行，术后将此１００只裸鼠随机分为６组，即脾虚胃癌模型组１７只，西药对照组１６只，中药对照组１６只，参术胶囊低剂量组１７只，参术胶囊中剂量组１７只，参术胶囊高剂量组１７只，手术第２天开始除脾虚胃癌模型组自由饮用无菌水外，西药组灌胃给予５．氟尿嘧啶３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ／２…，中药对照组灌胃给予胃复春１４８９／ｋｇ／ｄ，参术胶囊低剂量组灌胃给予参术胶囊药液３３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ，参术胶囊中剂量组灌胃给予参术胶囊药液６６０ｍｇ／ｋｇ／ｄ，参术胶囊高弃＂量组灌胃给予参术胶囊药液１３２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ，除模型组外均按此法治疗２ｌ天（３周），到术后第２３ｄ脱颈椎处死，处死前禁食２４小时，取出胃，沿胃大弯侧级向削开，用生理盐水洗净食物残渣后，将胃组织用１０％的中性福尔马林液固定待测。
实验中每周电子天平称一次体重、小动物活动观测仪测定ｌｏ分钟内的自发活动、电子天平称２４ｈ动物的摄食量，观察大便性状、腹形及体表的其他表现。２．２病理组织学染色步骤及胃癌细胞的形态观察
将前述胃组织１０％中性福尔马林液固定４８小时，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸腊，石蜡包埋，常规切片４ｕｒｎ，髓染色．每个标本在１０）（４０高倍镜下，随机观察２０个癌细胞核形态，并在ＭＩＡＳ－－２０００型图像分析系统下测量细胞核及相应核仁的面积（截面的面积等于落在截面内的像素点计数乘以每个测试像素点所代表的测试面积（ａ＝ｄ２ｋ。Ｐｃ））、周长（指围绕被测试物体周边的长度）、最大直径、最小直径（平面图形的卡规直径是指正切该图形的两条平行线之闯的距离，它可用最大直径、最小直径和平均卡规直径来描述）及形状因子（一般指二维形状因子，综合反映二维形态结构的变化，无量纲参数（即无单位），当被测物体为园时，形状因子等于１，当物体不规则或呈椭圆时，形状因子小于ｌ，反映被测物体截面的不规则程度）５种形态参数“““。
７
２．３胃癌侵润、转移相关基因表达的裣测
免疫组织化学染色步骤（ｓＰ法）：。６。１采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的待测抗原。染色的主要过程如下：
１．石蜡切片脱蜡至水，用ＰＢＳ液（Ｏ．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＨ７．４）冲洗３次×５ｍｉｎ．
２．３％Ｈ２仉室温孵育ｌＯ分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育１０ｍｉｎ．３．蒸馏水冲洗，ＰＢＳ浸泡５分钟。
４．１０％的正常山羊血清（ＰＢＳ稀释）封闭，室温孵育ｌＯ分钟。倾去血清，勿洗，滴加Ｉ：１００比例稀释的一抗，３７’Ｃ孵育１小时。
５．ＰＢＳ冲洗，５分钟Ｘ３次。
６．滴加第二代生物索标记二抗工作液，３７‘ｃ或室温孵育３０分钟。
７．ＰＢＳ冲洗，５分钟×３次。。
８．滴加第二代辣根酶标记链霉卵自素工作液，３７’Ｃ孵育３０分钟。
９．ＰＢＳ冲洗，５分钟×３次。
１０。ＤＡＢ显色。
１１．自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。
阳性结果判定：ＭＭＰ２、１６１Ｐ９、ＴＩＭＰＩ、ＴＩＭＰ２、ｕＰＡ及ＰＡＩ一１阳性物质棕褐色至淡黄色啪１，呈细丝状或者细颗粒状，瑚腰２、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰＩ、ＴＩＭＰ２主要表达部位在肿瘤细胞胞浆，部分表达在肿瘤间质细胞（包括血管内皮细胞）胞浆及基质；ｕＰＡ及ＰＡＩ－Ｉ表达部位主要在血管内皮细胞胞浆，部分在肿瘤细胞胞浆及基质。
ｌ胁Ｌ０２、脚９、ＴＩＭＰＩ、ＴＩＭＰ２、ｕＰＡ及ＰＡＩ—ｌ基因表达的检测：首先将ＳＰ法染色切片在１０Ｘｉ０低倍视野下进行全面观察，寻找肿瘤内ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰＩ、ＴＩＭＰ２、ｕＰ＾及ＰＡＩ—ｌ阳性物质最丰富区域（即“热点”区，染色颜色最深伴／或者染色面积最多），然后在１０Ｘ２０中倍视野下选择２０个热点区，采用ＭＩＡＳ－－２０００型图像分析系统测量各个指标阳性物质的面积、平均光密度、积分光密度、平均黑度，
表示它们的含量。
统计学处理：所有计量资料以均数±标准差表示（彳±鲫），采用ＳＰＳＳｌｌ．０统计软件包处理，组间比较用ＬＳＤ（方差齐）和ｓ—Ｎ《或Ｔａｍｈａｎｅ（方差不齐），
３实验结果
３．１脾虚表现
用山西白醋灌胃６ｄ后，实验裸鼠的一般情况都发生了变化。摄食量、自发活动减少，体重下降，腹部胀大、大便变溏或呈小干颗粒状，与造脾虚模型前有极显著差异。（见表１、袭２）
表１造脾虚模型前后裸鼠摄食量、自发活动、体重的变化（Ｚ±ＳＤ）
注：与造模前比较：‘－ｐ＜０．０１
表２造脾虚模型前后裸鼠大便、腹形的变化
注：与造模前比较：－ｐ＜０．０１
３．２病理组织学观察
ｆｉＥ染色切片下观察脾虚胃癌模型组癌组织结构紊乱，呈浸润性生长，与周围组织分界不清，癌细胞中等偏大，呈圆形、椭圆形、多边形及不规则形，胞浆较
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少，核染色较深，呈椭圆形、三角形及不规则形，多数呈空泡状，核分裂像较多，核仁粗大，位于核中央或偏位，多数具有～个核仁，少数有两个或者以上，染色深。５个治疗组癌细胞大小与模型组相似，但形状以圆形、椭圆形居多，多边形及不规则形减少，尤其是核的面积减小、形状明显变得规则、核仁数目和面积均较模型组减少。在核面积上，西药组有显著性差异，其余４个组差异无显著性；核周长和核最大直径较模型组减小，西药组和参术高剂量组有显著性差异，其余３组差异无显著性；核最小直径较模型组减小，但均无显著性差异：代表核形状的核形状因子较模型组增大，其中西药组和中药对照组有显著性差异，参术低、中、高剂量组有极显著性差异：核仨面积、核仁与核面积之比较模型组减小，且５个治疗组均有极显著性差异；核仁形状因子较模型组增大，除参术高剂量组有显著性差异外，其余各组均差异无显著性。结果详见表３、表４、图ｌ～６。
实验过程中共死亡２８只动物，其中在食醋灌胃及手术双重打击下有１５只动物死亡，后在灌胃治疗中又死亡１３只，特别是西药组由于５．ｆＩｌ的副作用大，动物消瘦死亡多达７只，尸检无特殊。
表３ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ裸小鼠胃癌组织内癌细胞核仁形态变化（膏±ＳＤ）
注；与脾虚胃癌模型组比较：＇《００５。??Ｐ《０．０１。
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表４ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎＵ裸小鼠胃癌组织内癌细胞核形态变化（ｇ＋ｓｏ）
蝈剐动物药糖攘面积挂胀拄最大直径接最小直径
投形状因子砸”’（只）ｔ∥ｋ）（ｕｒ）｛蚺）ｆ蛐）｛删）
一——●¨——————————Ｈ————————————－——————————－—＿———————————●—————＿——————————————————＿———————一簋鸯翱
睥虚胃癌组１３…一９７７，．３６士１９７．２０１１７．５５＋１１．９６４３２２４－４．５２２６．６５＋３．０６０?８６９４＂０＋０３０西药对照组ｔｌ０．０３７４０．４５ｊ：２１２，９１’ｔ００．５３±１５．７３＂％｛７士５．ＩＦ２４－０９：：ｉ：４．ｎ０?盼６±Ｏ?０１９中药对照组１３１．４０９１７．９５＋１８０．Ｏｌ１１２．５６＋９．９９４１．１７＋３．６６２６．３３＋２．７７０８９５士０．０１９参术｛臣刺量１２０．３３９４４．３２＋２５４．１５Ｉｔ２．９０：１：１４．７５４０．３０＋５．６５２７．４０±３．３１ｏ．９０６±０．０１９。参术中剂量ｌＯ０．６６８２５．３３＋１０５．昭１０６．５５＋７．０３３９．２３士３．２９２５．４４：／：１．７７０，９０５＋０．０３２”参术高荆量１３１３２８１４．８２±１４９．０２１０５．１１＋９．０７‘３８３７＋２．８２‘２５．｛７士３．３００．９１３±０．０２０“注ｌ与脾虚１１１癌模型组比较：’‘０．０５，¨，《０．０１．
３．３胃癌侵润、转移相关基因的表达
３．３．１ＴＩＭＰｌ基因的表达
ＴＩＭＰｌ基因在参术胶囊低中高三剂量组的表达较脾虚胃癌模型组、西药对照组及中药对照组有所增强，但差异无显著性。结果详见表５、图７—１２。
表５ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ裸小鼠胃癌组织细胞内ＴＩＭＰＩ含量变化（ｆ±锄
３．３．２ＴＩＭＰ２基因的表达
ＴＩＭＰ２基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组增强，其中胃复春组、参术胶囊高、中、低剂量组与脾虚胃癌组比较有显著性０＜０．０５）或极显著性差异（ｐ＜０．０１）。结果详见表６、图１３—１８。
表６ＢＡＬＢ／Ｃ－ｆｌＵ／ＩｌＬｌ裸小鼠胃癌组织细胞内ＴＩＭＰ２含量的比较（ｊ±ＳＤ）
注：与脾虚■癌模型组比较；’《０．０５，¨ｐ‘０．０１．
３．３．３ＭＭＰ２基因的表达
＾ｎ俨２基因在五个治疗组中的表达均较脾虚胃癌模型组减弱，其中中药对照组、参术胶囊中剂量组与高剂量组较脾虚胃癌模型组有极显著性差异０＜０．０１），参术胶囊低剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异如＜０．０５），而西药组较脾虚胃癌模型组差异无显著性。结果详见表７、图１９—２４。
胂虚胃癌组１３等窑积竞蕾水３．４３±２．２９１．６３士１．００６６３±３．９３
西药对腻组１１中药对照组１３参朱低荆量１２参术中剂量ｌＯＯ．０３
１４８
０３３
２．７５±０．９７Ｌ鸲±３７１５．０３±２．２２１２７２６±ＩＩ＿２Ｉ
ｌ＿ｌＢ士０．６７
ｉ６７±Ｏ．７０ｔ，２０士０７３
２４６±Ｌ３６¨ｉ２３．韩±９．０９
２３４２±１０．２７１．４５±０．∞１．０８±４．００２．８２＋１．２９¨１２９．１５＋７．０１＂
参木尚剂量１３１．３２１．０２＋Ｏ．５９６．７８＋Ｏ．４３’?Ｌ９７±１．１７¨１２９．５９土８．３２＊
３．３．４ＭＭＰ９基因的表达
ＭｇＰ９基因在西药对照组中的表达较脾虚胃癌模型组有一定增强，但差异无显著性；在中药对照组、参术胶囊低中高三剂量组的表达较脾虚胃癌模型组减弱，且参术胶囊高剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异０＜０．０５）。结果详见表８、图２５—３０。
表８ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ裸小鼠胃癌组织细胞内ＭＭＰ９含量的比较（只±ｓ∞
蛆剽：只？。竺，。。＝，平麓１０≯瓮：度蝴度‘只）＜｜／ｋＩ）（ｘｌｏ‘ｕＩ）（×。）ｃ×ｌｎ’一
脾虚■癌组１３尊容积无一水５．２３士４．３４０．８６土Ｏ．４６８．３３：：／：７．６５１２３２３土４１７
西药对照组Ｉｉ０，０３‘．６９士３．００１．６７＋０．ｔ９¨９．０３土５３５１２２．４１士３．４８
中药对照龃１３１．柏参术低剂量１２０，３３参术中拊量ＩＯｎ晰
１．６８±１．０７０．９３＋０．４９３．３９土２．０２１２０．７５±２．４５２．８０－●－１．１３Ｌ１１＋０．３８５．３５士２．１５１２１５４±８．５０２．２５＂＋１．髓１，ｔ５土０．５９４．４９士４．２９１１８６Ｉ±９．０５
参术高剂量１３１．３２０．７４±Ｏ．４６０．５９＿＋０．３３１＿６２±０．９５?
１２６４５＋＿１３Ｂ８西面丽丽两面丽ｉ而面ｉ鬲而■———一————
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３．３．５ｕＰＡ基因的表达
ｕＰＡ基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组减弱，且参术胶囊中剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异０（０．０５），参术胶囊高剂量组较脾虚胃癌模型组有极显著性差异０＜０．０１）。结果详见表９、图３１－－３６。
表９ＢＡＬＢ／ｃ—ｎｕ／ｎｕ裸小鼠胃癌组织细胞内ｕＰＡ含量的比较（ｆ±劝）
注Ｉ与脾虚胃癌模型组比较。＇ｃ０．０５，¨，‘０．０１?
３．３．６ＰＡＩ．１基因的表达
ＰＡＩ一１基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组增强，其中中药对照组、参术胶囊低中高三剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异（Ｐ（０．０５），西药对照组较脾虚胃癌模型组差异无显著性。结果详见表１０、图３７—４２。
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表１０ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ裸小鼠胃癌组织细胞内ＰＡＩ－Ｉ含量的比较（彳±黝）
动物组别
（只）
药物面积平均光密度积分光密度
（以ｇ）
（×ｌｏ｜Ⅶ，）川）（ｘｌｏ，
￥冁履
脾虚■癌组１３等容积无曹木ｔ．２３±０．５８０．９４士０．４４２．６３土ｔ．２８［２３，６６±６．４０
西药对照蛆１ｌＯ．０３１．８９士１．１０１．２２士Ｏ．８２３７９士２．４２
１２６．２３±９．４５
中药对照组１３参术低剂量１２参术中剂量１０
ｌ４８２?７７＋Ｌ２２＋１．０９±Ｏ．３４４．８３２：Ｌ８５＊
Ｌ２９．０７＋１０．９４０＿３３
ｏ．６６
ｌ－６０±Ｏ．５１５．０９土１．３６＊１２６．２５士６．１４２?６｛±ｔ－ｔ２．ｔ．２０±０．６０４．７３±２．４６＊１２８．Ｏｌ±１０．７６
参术商舸量１３１．３２２．９６士Ｉ．３０¨１．０２士Ｏ．１３
４．８７－４－１．７８?１３１８１土４．５４
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讨论
１脾虚是胃癌发生和转移的内在因素
中医认为，脾位居中焦，与胃相表里，脾的主要生理功能是主运化水谷、水湿，输布精微而藏营，为气血生化之源，故有后天之本之称。“。脾虚则生化乏源，气血亏虚，临床上可出现形体消瘦，倦怠乏力，纳呆食少，大便不调，腹胀腹痛等症状。胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，其病因在西医中至今未明，目前考虑与饮食和环境因素以及幽门螺杆菌感染有关，而中医则将胃癌归属“反胃”、“噎嗝”、“积聚”以及“胃脘痛”等范畴“…１，其病因病机中医多认为属忧思恼怒日久，情志不遂，或饮食不节，导致肝失疏泄，胃失和降：或久病损伤脾胃，运化失职，痰凝气滞。热毒血瘀，交结于胃，积聚成块而发病，即脾胃虚弱是胃癌发生的前提。癌肿形成之后，由于局部气血不畅，很容易损伤脾胃受纳、运化功能，故而又加重脾虚气弱，生化乏源。无力抗邪，邪毒乘而侮之，五脏病邪相互传变，复消耗气血，正气因之愈虚，而邪气因之愈盛，如此恶性循环，在临床上就表现为转移、恶病质及全身衰竭甚至死亡。故脾虚又是胃癌转移的诱导因素。
古代医家对脾胃虚弱与胃癌发生和转移的关系的论述也颇多。《奇效良方》谓；“夫反胃者，本乎胃。多因，饮酒过伤，或积风寒，或忧思悒快，或因蓄怒抑郁，宿滞痼癣，积聚冷痰，动扰脾胃，胃弱不能消磨谷食，遂成此症。”脾为后天之本，气血生化之源。胃癌患者素来饮食不馨，腹胀腹泻，或完谷不化，脾胃损伤则正气虚弱，以致卫外之气无处以生，邪毒内侵，蓄结不除，导致癌瘤产生。李东垣在《脾胃论》中说：“盖胃为水谷之海，饮食入胃，丽精气先输脾归肺，上行春夏之令，以滋养周身，乃清气为天者也；升已而下输膀胱，行秋冬之令，为传化糟粕，转味而出，及浊阴为地者也。”李东垣以一年之气的升降，春夏地气升浮而生长，秋冬天气沉降而杀藏，惟长夏土气居中央，为浮沉变化的枢纽，由此认为人身精气的升降运动，亦赖脾胃居于其中为枢纽。若脾胃～伤，则当升者不升，当降者不降，疾病随之而生。《内经》也云：“邪之所凑，其气必虚。”东汉张仲景在《金匮要略》
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中载日：“脉弦者虚也，胃气无余，朝食暮吐，变为胃反。”以上论述无不强调脾胃虚弱的发病机制，同时脾虚不仅是胃癌发生的根本原因，而且也是胃癌发展与变化的关键。
随着中医理论结合现代医学研究手段的发展，越来越多的学者从临床与实验的研究中提出了脾虚与胃癌发生发展相关的观点。邱佳信教授０２１等在临床和实验研究中提出了“消化道恶性肿瘤邪实是客观存在，而脾虚则贯穿疾病的始终，治瘤应从健脾着手”的基本观点。余桂清等ｎ１１也在临床与实验的研究中得出脾虚导致的痰湿、气滞、血瘀、毒邪是胃癌形成的原因之一。赵爱光等。３１则主要从医学统计学角度对脾虚与胃癌形成的关系作了半定量分析，其结果在一定程度上证明中医基础理论对胃癌病因病机认识的正确性和科学性。尹光耀等。ｏ对脾虚证胃病患者的胃粘膜上皮细胞线粒体的超微结构、微量元素、胃粘膜肠化亚型、环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ），超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）与血清过氧化脂质（ＬＰＯ）水平进行检测，发现线粒体退变及相关因素量变与脾虚证的转归、肠化生、胃的癌变有互为因果的内在联系，前者是后者产生的病理生理学基础Ⅲ３。沈克平等人啪３对胃癌及其相关病变患者脾虚症状的半定量分析，发现脾虚与胃癌发生发展各阶段病变之间呈等级正相关，并且在研究中观察到早期和进展期胃癌组脾虚症状表现较重．尤其是进展期胃癌组，提示脾虚在胃癌形成和转移过程中可能起至关重要的作用，这与不少学者的观察结果是一致的。还有采用反映小肠吸收功能的卜木糖吸收实验，检测脾虚肿瘤患者消化吸收功能变化，发现脾虚肿瘤患者小肠吸收功能明显低于正常人，亦有学者对脾虚肿瘤患者进行某些消化激素的检测，发现这类患者血清胃泌素、胰功肽含量均低于正常人‰３，这些研究结果均表明脾虚证肿瘤患者消化吸收功能和消化激素含量的改变，也进一步说明脾胃虚弱与消化道肿瘤关系
密切。在导师彭成研究员多年的实验研究中也得出“脾虚是胃癌发生和转移的内
在因素”之理论，同时在这一理论的直接指导下，师兄林代华在实验中成功地复制出稳定的病证结合的脾虚胃癌动物模型，这一模型同时具有脾虚的主要症状和
胃癌的病理及基因的改变，从而从实验的角度证明了脾虚在胃癌的发生、发展过
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程中有着重要作用，并提示这种作用可能是通过影响一系列的胃癌相关基因的异常表达完成的。
从已有的临床及实验研究来看，在胃癌的形成及其转移的各种阶段均存在脾虚的症状，而在脾虚证的发展过程中如果不能得到及时而有效的治疗那么最终也可能转归为胃癌，因此笔者希望通过本论文的研究引起医家及患者双方对脾虚证的重视，同时也为胃癌的治疗提供中医学的理论和实验数据的支持，从而拓宽对胃癌的治疗方法及药物的研究与运用。
２脾虚胃癌转移鼠动物模型的评价
从古至今的有关资料都表明，中医动物模型是中医临床理论形成、发展、诊疗水平提高的内在动力。中医学术要进一步发展，要与现代自然科学接轨，就必须在中医药理论指导下将中医证候动物模型与疾病动物模型结合，建立中医病证结合动物模型，促进中医临床的发展。因此笔者在导师的理论指导下，建立了脾虚胃癌转移鼠这一将脾虚证与胃癌结合的病证结合动物模型。
病是在病因作用和正虚邪凑的条件下，体内出现的具有—定发展规律的邪正交争、阴阳失调等演变过程，具体表现在若干特定的症状和各阶段相应的证候。中医在临床上，根据疾病的若干特定的症状等，对照各种病的概念与特征，从而确定疾病病名的诊断过程，称为辨病。证即证候，是疾病发生和演变过程中某一阶段本质的反浃。它以某些相关的脉症，不同程度地揭示病因、病机、病位、病性、病势等，为论治提供依据。胃癌在祖国医学中无此病名，但从文献分析来看，它包含在“噎嗝”、“胃反”、“胃痛”、“积聚”等以症状为名的病名范畴中，如《灵枢》谓：“胃病者，腹胀，胃脘当心而痛，上肢两胁，膈咽不通，食积不下……”即与现代临床所见偏食道、胃、贲门肿瘤症状相似。所以现代中医学多借鉴西医的病名。而胃癌转移则是发生在胃癌中晚期的事件，它是指瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，迁徙至８他处而继续生长，形成与原发瘤同样类型的肿瘤。《内经》中认为人体本身的亏虚，实乃各种肿瘤发生发展的重要原因，在临床中胃癌患者也有不同程
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度的脾虚证候。
近二十年来国内不少单位研制了许多脾虚证的动物模型，综合起来大致分为以下几种类型：一、泻下法。二、偏食法。三、饮食失节法。四、综合法（把多种造模因子叠加起来形成的造模方法）。五、现代医学的病理模型。其中导师彭成研究员建立的食醋致脾虚的动物模型已相当稳定，由于其造模因素科学化、定量化，且在实验过程中影响因素少，故本实验采用了食醋致脾虚的方法来造脾虚证的动物模型。过食酸味致脾虚的理论古已有之，早在《素问?生气通天论》中就有“味过于酸，肝气以津，脾气乃绝”的论述，饮食过酸，肝木旺盛，克伐脾土，脾气虚衰的道理。实验中我们采用首次灌胃裸鼠以山西白醋按１５ｍｌ／ｋｇ／ｄ，以后按ｌＯｍｌ／ｋｇ／ｄ灌胃６ｄ造成脾气虚证的动物模型，此动物模型产生的体重减少、艘胀、大便异常、活动减少等症状与脾气虚证的症状极吻合，同时这一结果与林代华的实验以及笔者多次预试的结果相符，说明此法重复性好，因此这一造模方法是相当成功的。
胃癌动物模型包括胃癌癌前病变动物模型、胃癌动物模型及胃癌转移动物模型。因为侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，也是导致癌症病人死亡的主要原因，所以对肿瘤转移的研究也就显得尤为重要，故我们着重研究了胃癌转移动物模型。肿瘤转移模型属于一种特殊的移植性肿瘤模型，要求使用免疫功能低下的动物，近年来利用免疫缺陷动物建立肿瘤转移动物模型的研究较为深入，因此，我们在实验中选择了免疫缺陷动物裸鼠作为研究对象。在转移鼠动物模型的研究中，Ｒｏｆｆｍａｎ等于１９９１年创立了外科原位移植方法（ｓｕｒｇｉａｃａｌｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＳＯＩ），它采用的移植物直接来自新鲜的外科标本或移植性人肿瘤组织，维持了原有瘤组织结构和其生物学特性，并且通过手术原位移植，因此移植瘤在宿主体内能以类似于临床的方式显示其恶性行为，比癌细胞悬液的原位接种和癌组织块的非原位移植拥有更高的移植生长率和转移率。故本次实验参照了Ｈｏｆｆｍａｎ的转移鼠动物模型在脾虚证动物模型基础上采用荷包缝合法在裸鼠的胃浆膜下种植一０．１ｘＯ．１ｃＩｌＩ大小胃癌组织块（裸鼠腋下接种￥ＧＣ－７９０１悬液长成的），结果表明此法建立的模型能更好地再现人胃癌的浸润转移特性。