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农业大学
毕业论文
题目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓名：
学院：动物科技学院
专业：动物医学
班级：1001
学号：20105254
指导教师：温建新
2014年6月5日
反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定
动物医学专业袁如意
指导教师温建新
摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。
关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定
Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains from
Ruminants
Student majoring in veterinary medicine Yuan Ruyi
T utor Wen Jianxin
Abstract：One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin, penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations.
Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification
引言
枯草芽孢杆菌是存在于动物肠道中的非致病需氧菌[1]，可降低肠道氧浓度，产生的枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等活性物质能显著降低肠道大肠杆菌、沙门氏菌的数量，减少机体致病菌[2]，改善了乳酸杆菌等厌氧菌的生长环境，增加有益菌，以此来保持肠道菌群的平衡，提高动物机体抗病能力。同时枯草芽孢杆菌具有耐受高温、耐酸、耐挤压等特点，在饲料加工和储存过程中不易失活[3-5]。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用，可将淀粉转化为单糖，能提高动物对饲料中营养的消化和吸收率；其还能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、促生长因子等，参加机体新代，利于动物机体吸收，使动物保持健康状态；还具有降解碳水化合物的酶如纤维素酶、葡聚糖酶[6-7]。
枯草芽孢杆菌在养殖业中发挥了巨大作用，并且已经得到广泛的应用。针对鸡、猪、水产等已有大量报道，丁祥力等利用枯草芽孢杆菌WH-5净化水产养殖厂的水[10]，姗姗等从健康仔猪空肠黏膜分离到23 株对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有拮抗作用的芽孢杆菌[11]，虽然枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物中还没有广泛应用，但近年来，枯草芽孢杆菌作为微生态制剂在反刍动物养殖中的研究越来越多。本试验从健康奶牛粪便中分离鉴定枯草芽孢杆菌，以期为进一步深入研究枯草芽孢杆菌提供参考，并为枯草芽孢杆菌作为反刍动物微生态制剂的研制和应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 样品来源
新鲜的荷斯坦成年牛牛粪便，取自某奶牛养殖场。
1.2 主要试剂
MYP、LB培养基、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、细菌微量生化鉴定管、三糖铁琼脂、革兰氏染色试剂盒均购自陆桥技术有限责任公司。细菌微量生化反应管、药敏纸片购自天和微生物试剂。0.5%沙黄、5%孔雀绿溶液自配。
1.3 仪器和设备
SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（净化设备LED-2）、电热恒温培养箱（龙口市先科仪器公司YY0027-90）、XSP-2C生物显微镜。
1.4 方法
1.4.1 菌株的分离纯化
取菌液接种于MYP培养基平板上，置于37℃恒温培养箱培养18 h；挑取疑似枯草芽孢杆菌菌落进行纯化培养，将分离纯化后得到的菌株命名为“菌K”。
1.4.2 染色镜检
1.4.
2.1染色
采用革兰氏染色法，见文献[13]。
1.4.
2.2 芽孢染色
采用孔雀绿沙黄染色法，见文献[13]。
1.4.3 生化试验
按照常规试验方法对菌K进行糖苷醇发酵试验、甲基红（MR）试验、乙酰甲基甲醇试验（VP试验）、淀粉水解试验、吲哚试验、产类淀粉化合物测定试验、柠檬
酸盐试验、TSI试验、过氧化氢酶（触酶）试验、KOH试验、脲酶试验、明胶液化等试验。
1.4.4 16S rDNA的PCR扩增和序列分析
将菌K接种于5 mL LB肉汤中摇菌10 h，取4mL菌液10000r/min离心2min，参考《精编分子生物学实验指南》的方法提取DNA。
在参考了国外相关文献后[19]，由华大生物工程合成了一对芽孢杆菌属特异性引物：Primer 1：5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'，Primer 2：
5'-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3'，预期扩增片段长度为1436 bp。
PCR反应体系：总体系25μL ，DNA模板2μL，上下游引物各加1μL，10 ×buffer 2.5μL，dNTP2.5μL，T aq酶0.5μL，ddH2O15.5μL。PCR反应条件为：94℃预变性2min，95℃变性45s ，58℃退火50s，72℃延伸1min，72℃，10min，共32个循环，4℃保存。
PCR产物送六合华大基因科技股份测序。测序结果采用BLAST软件和GenBank 数据库中的国外相关芽孢杆菌16S rDNA 的序列对比，用Clustal X Method 进行同源性比较。
1.4.5药敏试验
按照扩散法在MYP培养基上进行药敏试验，见文献[13]。
1.4.6安全性试验
选取体重为30~40 g的小白鼠10只，每组5只。取菌液浓度约为1011cfu/mL 的LB肉汤，对空腹8 h的试验小鼠每天一次经口灌胃0.3 mL，同时设空白营养肉汤对照组。每天观察和记录，14 d后结束试验，剖检观察脏及组织器官变化。
2 结果
实验十、土壤中芽孢杆菌的分离与筛选 ——培养基配制及样品采集 一、实验目的 学习和掌握菌种选育技术中从自然界中采样的技术，掌握芽孢杆菌筛选的特异性培养基配制方法。 二、实验原理 自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。但总体来讲土壤样品的含菌量最多，土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。 三实验材料 1. 采样器具：灭菌的牛皮纸袋、小铲刀（或不锈钢勺）、温度计、pH试纸、 记号笔等。 2. 筛选培养基：肉汤琼脂培养基 四、操作步骤 1. 采样： 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好，或事先灭菌处理的牛皮纸袋、玻璃器皿内。北方的干燥土壤，可在10～30cm处取样。给牛皮纸袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 （注意：一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。 从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，
青岛农业大学 毕业论文 题目：反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定姓名： 学院：动物科技学院 专业：动物医学 班级： 1001 学号：20105254 指导教师：温建新 2014年6月5日
反刍动物源性枯草芽孢杆菌的分离与鉴定 动物医学专业袁如意 指导教师温建新 摘要：从健康荷斯坦成年奶牛新鲜粪便中分离纯化出1 株疑似芽孢杆菌属菌株，编号为K。对该菌株进行形态学观察、生化试验、药敏试验及安全性试验等。试验结果表明，该菌菌体革兰氏染色阳性，芽孢染色为绿色，呈长杆状，芽孢中生，椭圆；能发酵糖醇，吲哚试验阳性，触媒试验阳性，能产生淀粉酶，并且可以液化明胶，生化试验结果表明K菌为枯草芽孢杆菌；该菌对链霉素、青霉素、诺氟沙星、四环素耐药性强，而对庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星等抗生素表现敏感；动物安全试验表明，灌服浓度为1011cfu/mL菌液的小鼠精神状态良好，无死亡现象。本试验为获得反刍动物的有益菌种及研制反刍动物微生态制剂奠定基础。 关键词：反刍动物；枯草芽孢杆菌；分离；鉴定
Isolation and Identification of Bacillus subtilis Strains from Ruminants Student majoring in veterinary medicine Yuan Ruyi Tutor Wen Jianxin Abstract：One bacillus strain was isolated and purified from the faeces of healthy Holstein named K. Morphological observation, biochemical tests, chemosensitivity test and security experiment were conducted. Experimental results showed that strain K Gram stain was positive, spore staining was green. Its shape was a long rod-shaped bacteria, and spores was oval . Common sugar alcohols could be fermented; Indole test was positive; Catalyst test was positive; It could produce amylase; It also could liquefy gelatin. Susceptibility testing showed that the bacteria strongly resisted to streptomycin, penicillin, norfloxacin,and tetracycline and that it was sensitive to gentamicin, kanamycin and ciprofloxacin. Animal safety trials showed that Mice fed bacterias 1011cfu/mL were in good condition and no mortality. therefore, the K was identified as Bacillus subtilis strain. So it provided theoretical basis for developing probiotic preparations. Key words: ruminants; Bacillus Subtilis; isolation; identification
从土壤中分离和筛选产淀粉酶活性的芽孢杆菌及部分鉴定 试验 一、实验目的 1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定,对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90℃温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。 4、芽孢杆菌属的共同特征是：革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养
明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。 5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 二、实验材料 1、土壤样品 实验前三天在距土壤表层5-8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、药品 可溶性淀粉、蛋白胨、Nacl、牛肉膏、琼脂粉、碘、碘化钾、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸 3、试剂： （1）配制稀碘液： 原碘液：称取碘和碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 稀碘液：吸取原碘液，加入碘化钾用水溶解定容至500ml，贮存于棕色瓶中。 （2）可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于烧杯中，用少量水调成浆糊状，边搅拌边缓慢加入70ml沸水中，然后用水冲洗装淀粉的烧杯，洗液倒入其中，搅拌加热至完全透明，冷却定容至100ml。（溶液现配现用） （3）磷酸缓冲液（pH=）：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容到1000ml，用pH计校正后使用
微生物设计性实验 枯草芽孢杆菌的分离及筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3 实验材料 3.1 选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。 配方： 牛肉膏5.0g 蛋白胨10.0g 氯化钠5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 调整pH 至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2 溶液或试剂 牛肉膏1.25g 蛋白胨2.5g 氯化钠1.25g 可溶性淀粉2.5g 琼脂5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。 3.4 仪器或其他用品 平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程 倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存
枯草芽孢杆菌的分离纯化与鉴定 一、目的： 掌握芽孢杆菌属常见种的分离，鉴定方法和技术。将土壤样品中分离的芽孢杆菌属未知种鉴定到属。 二、原理： 芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性。，因而得到芽孢菌属，经过进一步分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。 三、材料和器皿： 显微镜、培养皿（12个）、试管（12个）、三角瓶（5个）、烧杯、移液管（）、涂布棒（6个）、载玻片、接种环、接种针、试管架、灭菌锅、培养箱 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、v.p.实验培养基、肉汤琼脂培养基 孔雀绿溶液、番红复染液、NaOH溶液、草酸铵溶液、碘液、乙醇 四、操作步骤 菌种的分离和纯化 （1）土壤的采集：取土壤表层5~10厘米下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋中带回实验室分离。 （2）平板的制备：融化三角瓶中的牛肉膏蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒入6个平板上。 （3）稀释分离法：秤取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15分钟，而后静止5分钟。吸取上层液0.5ml 加入到含有4.5ml的无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取 10-2和10-3土壤悬浊液个0.1ml滴加到上述牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每种 稀释2皿，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1~2天。 （4）挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌落，然后在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是否是芽孢杆 菌纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，置37℃培养1~2 天备用。 菌种的鉴定 1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等） （1）单个菌种的形态 （2）菌种形态的观察 2.革兰氏染色 3.芽孢染色 4.菌体大小测验 5.枯草芽孢杆菌的生理生化鉴定
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物设计性实验 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 分 离 及 筛 选 第二小组 组长：杨泽升 组员：王亭亭 叶宁 霍克
枯草芽孢杆菌的分离和筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3实验材料 3.1选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基， 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。 3.4仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程
芽孢杆菌的分离与鉴定 实验器材：铲子（1）,盆（1）,电子天平（1），洗耳球(1)，接种勾和环（1）,1ml吸管（7）,玻璃涂棒（1）,平皿（12）,250ml带玻璃珠三角瓶（1）,双层纱布（1）,试管（7），标签纸（1）,恒温箱，显微镜（4）。 实验试剂：无菌水，1mol/L NaOH、1mol/L HCL、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、复红液、5%孔雀绿、沙黄、乙醚、吲哚试剂、40%NaOH、肌酸 牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏1g，蛋白胨2g，Nacl 1g，水200ml，ph7.2，琼脂3.0-4.0g；生孢培养基：0.1%蛋白胨，0.1%葡萄糖，0.07%酵母粉，0.02%硫酸镁晶体（七水），0.02%硫酸铵，0.1%磷酸氢二钾（3水），1.5%琼脂； 一、土壤中芽孢杆菌的筛选 A.培养基配置步骤：（1）称量：按比例称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠，共置于烧杯中； （2）溶解：先加入适量无菌水，加热使其溶解，再补足水至总量； （3）调pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调PH至7.6； （4）过滤：用滤纸过滤； （5）融化琼脂：加入3.5克琼脂，继续加热至完全溶解，补足因加热蒸发失去的水分； （6）分装与包扎：摆斜面 （7）灭菌：121℃，灭菌20min B.实验步骤： （一）采集土样: 每个采样点选取土壤较肥沃、有代表性的地块约0．2 cm2，五点法采集。取5～10cm深土壤，每一个土样约500 g。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4℃保存备用。 （二）土壤悬液制备：称取10g土样，放入盛有99ml无菌水并带有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡摇晃20min，使土样与水充分混合，将细胞分散，两层纱布过滤，然后将锥形瓶置于90℃水浴锅，加热20min，制备成土壤悬液。 （三）土壤悬液稀释：用一支1ml的无菌吸管从锥形瓶吸取过滤的土壤悬液1ml加入盛有9ml 无菌水的大试管中，震荡均匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一只盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1 、 10-2 、 10-3、 10-4、10-5、 10-6 不同的稀释度。 （四）倒平板：将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，冷却至45-50度倒平板，每个梯度两个平行，共12个，每皿15ml左右。平皿凝固后，在平皿底部分别用记号笔用：10-1 、 10-1、10-2、 10-2 、 10-3、 10-3、10-4、 10-4、10-5、 10-5、10-6、10-6。 （五）涂布：用无菌吸管分别将10-1 、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤稀释液各吸取0.2ml，将菌悬液小心的对号滴入已写好稀释度的平皿表面中央，再用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，倒置放置，待培养。 （六）培养：将接种好的平皿倒置于37℃温箱中培养，大约1-2天。 （七）平板划线分离纯化：将培养好的单个菌落分别挑取少许细胞接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面培养基上，置于37℃温箱中培养24小时左右，待长出菌苔，镜检其特征是否一致，有杂菌，需再一次分离纯化，直至获得纯培养。 (八)生孢培养：再分别挑取单个菌落划线接种于生孢培养基，于37度培养箱培养，直至长出单个菌落。 二、纯化菌株的鉴定： （一）观察菌落形态：观察平板菌落形态：菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，（二）观察菌体形态：
目录 枯草芽孢杆菌培养基的优化研究- 2 - 1 枯草芽孢杆菌简介及应用- 3 - 1.1 枯草芽孢杆菌简介- 3 - 1.2 枯草芽孢杆菌应用- 3 - 2材料和方法- 4 - 2.1 实验材料- 4 - 2.1.1 菌株- 4 - 2.1.2 培养基- 5 - 2.1.3 仪器与设备- 5 - 2.2 培养基的优化- 5 - 2.2.1 培养方法- 5 - 2.2.2 检测方法- 5 - 2.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 - 2.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 - 2.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 - 2.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 - 2.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 - 2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 - 3 结果和分析- 7 - 3.1含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 - 3.2稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 - 3.3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 - 3.4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 - 3.5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 - 3.6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 - 参考文献- 10 - 枯草芽孢杆菌培养基的优化研究 摘要。随着国家对农业的支持，微生物化肥有农业中的应用也越来越受到 重视。而枯草芽孢杆菌在农业方面和其它方面都有广泛的应用，因此，对
枯草芽孢杆菌的研究也越来越多，对枯草芽孢杆菌的需要也越来越大。为 了在枯草芽孢杆菌的工业生产中，降低生产成本而又能提高枯草芽孢杆菌 的产量，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行研究。 本文先就培养基的主要原料，含水量，碳源，氮源，碳氮比，pH等几个因 素作单因素实验。研究表明最佳培养基是：稻草49.05%，玉M粉2.25%， 尿素0.9%，CaCO 1.8%，KH PO 1.0% ，水含量57%，pH 7.8[1][2]。 关键词。枯草芽孢杆菌。培养基优化[3]。应用 Bacillus subtilis culture medium optimization Abstract :along with the country the support to agriculture, microbial fertilizer has application in agriculture has been paid more and more attention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of a wide range of applications, therefore, on Bacillus subtilis are studied more and more, on Bacillus subtilis needs more and more. In order to Bacillus subtilis in industrial production, reduce production cost and can improve the yield of Bacillus, Bacillus subtilis fermentation medium of. This article first medium main raw material, water content, carbon source, nitrogen source, carbon and nitrogen ratio, pH and several other factors single factor experiment. Research shows that the optimum medium was49.05%: straw, corn flour 2.25% ,urea 0.9%,CaCO 31.8%, KH3 PO 4 1%, water content 57%, pH 7.8[1] [2]. Key words:Bacillus subtilis。 medium optimization。 application 1 枯草芽孢杆菌简介及应用 1.1 枯草芽孢杆菌简介 枯草芽孢杆菌 实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃 危险源辨识登记表 部门：项目部 序号过程/作业地点危险源事故后果状态现有措施 1 办公室饮水机水垢危害人体健康正常定期清洗 3 办公室开关电源漏电触电异常开关带漏电保护 4 办公室电脑辐射人体伤害正常尽量减少接触时间 5 办公区电线短路火灾、人员伤亡、财产损失正常配置消防器材 6 办公区物品堆放处吸烟火灾异常严禁乱丢烟头、在电脑前吸烟 7 办公区开水遗洒人员烫伤正常提高员工防范意识 8 道路外出车辆发生交通事故人身伤害异常严格遵守交通规则 9 施工现场锤子砸伤手人身伤害正常谨慎操作 10 施工现场割灌机伤人人身伤害异常谨慎操作 11 施工现场切割机伤害人体伤害异常谨慎操作 12 施工现场开关电源漏电触电异常开关带漏电保护 13 施工现场压线皮带压手手指压伤正常按作业指导书操作，谨慎操作 14 施工现场高温作业中暑正常发放降温用品、定时更换作业人员 15 施工现场壁纸刀伤手人体伤害正常谨慎操作 16 施工现场进入现场未带安全帽人身伤害异常严格按照要求，带好安全帽 17 施工现场配电室触电人员伤亡异常带绝缘手套 18 施工现场进入现场时，钢钉伤脚人身伤害异常做好防护措施，小心观察 19 施工现场高空物体坠落砸伤异常戴好安全帽，做好防护措施 20 施工现场接线、安装不当触电人员伤亡异常提前切断电源 22 施工现场料斗，搅拌机伤人砸伤异常定期检查 23 施工现场门挤手人身伤害异常谨慎操作 24 施工现场 灯杆轴倾倒砸人砸伤异常 按施工方案执行，谨慎操作，设置 警示标识 危险源辨识登记表 部门：项目部 序号过程/作业地点危险源事故后果状态现有措施 25 施工现场施工油丝绳断线伤人人身伤害异常谨慎操作 26 施工现场焊接火花飞溅烫伤皮肤异常谨慎操作，佩戴防护用品 27 施工现场 喷洒农药人身伤害 异常谨慎操作，佩戴防护措施，警示周 围人员 28 施工现场新种大型乔木倒落砸人砸伤异常定期检查，固定支撑 29 施工现场切割机、电钻噪声的排放听力伤害正常加强机械维护，选择合格车辆 30 施工现场灯具安装不牢，从灯杆处跌落砸伤异常谨慎操作 31 施工现场穿线时被铁丝划伤人身伤害正常按作业指导书操作 32 施工现场蚊虫叮咬人身伤害正常配备药品，紧急救治 33 施工现场吊车起杆时掉落砸人砸伤异常谨慎操作 34 施工现场吊车搬运重物时掉落砸人砸伤异常谨慎操作，按作业指导书操作 35 施工现场电焊强光伤眼视力伤害异常谨慎操作，佩戴防护用品 36 施工现场切割机火花伤眼视力伤害异常谨慎操作，佩戴防护用品 37 施工现场高空作业人员伤亡异常谨慎操作，带好安全带 38 施工现场油漆时溅到皮肤皮肤伤害异常谨慎操作，佩戴防护用品 39 施工现场灯具安装不当触电人员伤亡异常切断电源，定期检查 40 施工现场电线接线不当造成短路引发明火火灾异常配置充足灭火器、加强接线检查 41 施工现场切割、打眼粉尘呼吸系统伤害正常谨慎操作，佩戴防护用品 42 施工现场接地安装不当触电人员伤亡异常切断电源，定期检查 43 施工现场潜在火灾人身伤害异常定制应急预案，杜绝火源 44 施工现场破损玻璃扎手人身伤害异常谨慎操作，佩戴防护用品 土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选 2013023123刘倩倩 一、实验目的 1.掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。 2.了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 二、实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。 利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 三、实验材料 （1）选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。 配方：牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉 10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 （2）溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。（3）仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 四、实验步骤 倒平板→制备梯度稀释液→涂布→培养→初筛→复筛→纯化→保存（1）实验前准备 制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。（2）制备土壤稀释液 取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层5cm，去5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。放入盛有99ml无菌水三角瓶中，常压80 度的水浴处理样品1小时后，取出。 用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2 、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。 （3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三 毕业论文 课题名称枯草芽孢杆菌培养基的优化研究 2014年5月18日 目录 摘要 (Ⅰ) Abstract (Ⅱ) 1 前言 (1) 2 材料与方法 (3) 2.1材料以及试剂 (3) 2.2实验主要仪器设备 (4) 2.3试验方法 (4) 3 结果与分析 (6) 3.1 单因素试验结果 (7) 3.2 正交试验结果 (11) 4 结论及讨论 (13) 参考文献 (15) 致谢 (16) 枯草芽孢杆菌培养基的优化研究 摘要 本文选取BPG液体培养基研究该培养基配方对枯草芽孢杆菌生长的影响，通过相关资料的查询，选取葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾这四个因素变量。先通过单因素实验确定这四个因素的最适含量，再进行L9(34)正交试验确定BPG液体培养最适培养基组合。最终得到最佳培养基配方含量是牛肉膏4.0g，蛋白胨3.8g，NaCl 3.3g，葡萄糖4.0g，淀粉3.3g，KH2PO4 3.4g，MnSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH7.0，其枯草芽孢杆菌生长量为3.631×107 CFU/mL。 关键词：枯草芽孢杆菌；葡萄糖；蛋白胨；牛肉膏；磷酸二氢钾；正交实验 Bacillus subtilis culture medium optimization research Abstract This article selected BPG liquid medium to study the culture medium formula of the effect on bacillus subtilis growth, through the relevant information query, glucose, peptone and beef extract, potassium dihydrogen phosphate this four factors variables. First determined by single factor experiment, the optimum content of these four factors, then L9 (34) orthogonal test to determine the BPG liquid culture combination optimal medium. Finally it is to know the best culture medium formula content is 0.40 g of glucose, peptone 0.38 g, 0.36 g beef paste, potassium dihydrogen phosphate 0.34 g. Keywords:Glucose, peptone and beef extract, potassium dihydrogen phosphate, single factor experiment, orthogonal experiment 河南省建设工程重大危险源登记建档管理办法 为及时准确掌握建设工程重大危险源的数量和分布状况，强化重大危险源管理，提高控制和防范风险的能力，杜绝重大生产事故发生，根据《河南省建设工程重大危险源安全监控管理暂行办法》，特制定本办法。 一、在本省行政区域内的建设工程重大危险源，应按照本办法进行登记建档。 本办法所称重大危险源是指存在重大施工危险的分部分项工程（以下简称危险性较大工程），主要包括： （一）建设部建质〔2004〕213号文规定的危险性较大工程； （二）《河南省建设工程重大危险源安全监控管理暂行办法》中明确的存在重大施工危险的分部分项工程； （三）施工现场存在的符合国家标准《重大危险源辨识》（GB18218—2000）重大危险源分类中规定的重大危险源。 二、建设单位在办理建设工程项目安全施工措施备案手续时，应组织施工单位填写《建设工程重大危险源登记表》，如实将拟建工程的重大危险源报当地建设行政主管部门或建设工程安全监督管理机构备案。 在安全措施备案时，建设工程重大危险源登记不全的，应根 据工程进度情况，适时登记上报。 三、施工单位在列入重大危险源的危险性较大工程施工前，应单独编制专项施工方案，并按规定程序进行审核、审批或论证。 四、施工单位应建立重大危险源安全管理档案和台帐，并建立重大危险源公示制度，在施工现场醒目位置设立《建设工程重大危险源公示牌》，向有关人员公示施工中不同阶段、不同时段的重大危险源名称、施工部位、可能发生的事故、防护措施和责任人等内容。 五、列入重大危险源的危险性较大工程施工前5天，施工单位应填写《危险性较大工程施工告知单》，并报送当地建设行政主管部门或建设工程安全监督管理机构，以便安全监督管理部门及时了解危险性较大工程进展情况，有重点地进行跟踪督查。 施工单位在危险性较大工程施工前，应当在施工区域设置警戒线和警示标志，并做好防护措施和应急救援工作。 六、列入重大危险源的危险性较大工程实施完毕后，施工单位应填写《危险性较大工程实施完毕告知单》，并及时报送当地建设行政主管部门或建设工程安全监督管理机构。 七、在建工程重大危险源的登记、建档、公示、施工告知和实施完毕告知等由总承包单位统一负责。 总承包单位应经常组织分包单位对重大危险源的实施进行安全检查，并做好相应记录。 八、监理单位应加强对重大危险源的监管，通过采取方案审 胶州市2015年农村公路建设三标段 鹿家村—逄家沟中修工程、铺集沙河桥工程 危 险 源 识 别 及 一 览 表 青岛平运路桥工程有限公司 危险源的分类与识别 1、危险源的分类 （1）按诱发危险、有害因素失控的条件分类 1）人的不安全行为； 2）物的不安全状态； 3）管理缺陷。 （2）按导致事故和职业危害的直接原因进行分析 1）物理性危险、有害因素 2）化学性危险、有害因素 3）生物性危害危险、有害因素 4）心理、生理性危险、有害因素。 5）行为性危害、有害因素 6）其他危险、有害因素 （3）按引起的事故类型分类 1）物体打击，指落物、滚石、锤击、碎裂崩块、碰伤等伤害，包括因爆炸而引起的物体打击。 2）车辆伤害，是指企业机动车辆在行驶中引起的人体坠落物和物体倒塌、飞落、挤压伤亡事故，不包括起重设备提升、牵引车辆和车辆停驶时发生的事故。 3）机械伤害，是指机械设备运动（静止）部件、工具、加工件直接与人体接触引起的夹击、碰撞、剪切、卷入、绞、碾、割、刺等伤害，不包括车辆。 4）触电，包括雷击伤害。 5）淹溺，包括高处坠落淹溺，不包括矿山、井下透水淹溺。 6）灼烫，指火焰烧伤、化学灼伤（酸、碱、盐、有机物引起的体内外灼伤）、物理灼伤（光、放射性物质引起的体内外灼伤）。不包括电灼伤和火灾引起的灼伤。 8）火灾。 9）物理性爆炸，包括锅炉爆炸、容器超压爆炸、轮胎爆炸等。 10）中毒或窒息，包括中毒、缺氧窒息、中毒性窒息。 11）其他伤害，是指除上述以外的危险因素，如摔、扭、挫、擦、刺、割伤和非机动车碰撞、轧伤等。 （4）按职业健康分类 参照卫生部、劳动与社会保障部、中华全国总工会等颁发的《职业病范围和职业病患者处理办法的规定》和《职业病目录》，将生产性粉尘、毒物、噪声和振动、高温、低温、辐射（电离辐射、非电离辐射）及其他危险、有害因素分为7类。 2、危险源的识别 （1）危险源识别的方法 识别施工现场危险源方法有许多，如现场调查、工作任务分析、安全检查表、危险与可操作性研究、事件树分析等，现场调查法是安全管理人员采取的主要方法。 1）现场调查方法。通过询问交谈、现场观察、查阅有关记录，获取外部信息，加以分析研究，可识别有关的危险源。 土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法 一、实验目的 1.学习掌握芽孢染色法并了解芽孢的形态特征 2.学习并掌握荚膜染色法并了解荚膜的形态特征 3.学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征 4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术 二、实验原理 1.细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不 着色（芽孢呈无色透明状）。 2.芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色又难以脱色这一特点而设计的。 3.所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以 促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色， 然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而更能明 显地衬托出芽孢，便于观察。 4.染色方法：改良后的Schaeffer-Fulton氏染色法 三、实验仪器及材料 1.菌种：枯草芽孢杆菌 2.染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液 3.仪器或其他用具：Eppendorf管架、载玻片、显微镜、电磁炉、搪瓷杯等。 四、实验步骤 1.制备菌悬液：在EP管中滴两滴生理盐水，挑取2-3环菌苔加入到含生理盐水的EP 管中，混合均匀。 2.染色：在EP管中滴加2-3滴孔雀绿染液，盖紧EP管，将EP管插入浮筏中，放进 沸水中加热15-20分钟，加热过程需要有人看护，随时控温，防止沸水进入EP管。 3.涂片固定：取半滴经孔雀绿染色的菌悬液在载玻片的中央，用接种环将菌液涂抹均 匀，将载玻片用法电风机冷风吹干，经过酒精灯火焰固定三次。 4.脱色：待玻片冷却后，水洗脱色。 5.复染：滴加数滴0.5%番红水溶液在菌膜上，染色2min，再水洗。 6.镜检：将晾干后放在显微镜下观察。 五、实验结果产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
危险源识别登记表(项目部)
土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选
枯草芽孢杆菌培养基的优化研究
危险源登记表
危险源识别及一览表
土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法
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